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摘要

这项研究的目的是将不同的基因构建块组装成一个聚焦的DNA传感器，用于检测血液中与葡萄糖相关的蛋白质，以便使用合成生物学和传统分子生物学诊断早期糖尿病。构建了葡萄糖DNA传感器酿酒酵母使用基因组和合成序列，并在两者中进行了测试，在活的有机体内使用人体血浆样本，然后在体外使用文化传媒。结果基于DNA传感器的荧光强度，并与临床方法进行比较。当DNA传感器与不同患者的血浆样本混合时，其灵敏度很高(也就是说,糖尿病、糖尿病前期和正常)显示高荧光，并能够检测到与临床血糖值相当的葡萄糖浓度范围。用2D-DIGE凝胶电泳-maldi分析检测糖代谢相关蛋白的表达。葡萄糖传感器在与一滴人体血液样本混合后不到一分钟就产生了结果。我们的研究结果强调了利用构建的DNA传感器检测血液中的葡萄糖以早期诊断糖尿病的优势。

酵母DNA葡萄糖传感器成功地与标准化的遗传部件组装，并能够检测低水平的相当于临床血糖血症(<140 mg/dL)，以及更高水平的血糖血症(>200 mg/dL)。因此，我们的传感器可以用于糖尿病或糖尿病前期的早期诊断，从而允许更早的临床干预。葡萄糖水平与DNA传感器的荧光强度之间的直接相关性显示了使用该技术识别特定类型糖尿病患者的优势。有时，用不同的方法很难建立准确的相关性。

关键字

DNA葡萄糖传感器，葡萄糖，荧光，质粒，血糖，糖尿病，合成生物学

简介

已有大量关于细胞自发发光的论文发表。这是基于超弱光子发射(UPE)，通常被称为生物发光或生物光子。通常，细胞能够发射1到数千光子/秒厘米²超过基本设备固有噪声水平。当细胞暴露于生理变化时，包括环境压力，如化学物质[1]的存在，细胞能够增加其UPE强度水平。

生物传感器是一种检测、传输和记录有关生理或生化变化信息的设备。它的功能是一个将生物元件与电子传感器集成在一起的探头，将生化信号转换为可量化的电响应[2]。

因此，微生物DNA传感器可以归类为生物传感器。传感器在日常生活中有各种各样的应用，包括作为机器和机器人汽车的组件，在医学、环境保护、工业、临床诊断和其他各种领域。许多不同类型的传感器已经被开发出来。物理或电子传感器，检测物理特性，如温度、压力、湿度和运动，被广泛使用;化学传感器已经被开发用来检测不同的分子，包括气体如氧气和氨，或溶液中的特定分子[3,4]。这些会产生各种可测量的反应。例如，生物、细胞或分子传感器可以检测到可能作为生物标志物有用的有机化合物[5,6]。蛋白质如糖蛋白和/或葡萄糖转运蛋白，以及基因(也就是说,GLUT)已被用作指示人血[7]中葡萄糖存在的标记物。这些类型的传感器是通用的分析工具，由于其固有的特异性、选择性和简单性，比经典的分析方法具有优势。大多数生物和细胞传感器使用膜和细胞蛋白，从介质[6]中识别和接受生物标记物。然而，DNA也被用于分子生物传感器[8,9]。

用于检测和诊断疾病的生物标记物包括身体症状、突变的DNA和RNA、分泌的蛋白质、细胞死亡或增殖等过程以及血清中胆固醇等小分子浓度，或在糖尿病中为葡萄糖[6]。

目前，诊断糖尿病最常用的方法是使用酶的反应来测定葡萄糖水平[10,11]。这些方法测量全血中的葡萄糖，因为红细胞中含有高浓度的葡萄糖[12]。方法包括使用葡萄糖氧化酶、己糖激酶和葡萄糖脱氢酶[13-15]。这些与血糖反应的产物可以用比色法和分光光度法测定或通过测量酶反应中产生的电流来测定;后者是大多数商用血糖仪[16]中使用的方法。这些方法是准确和敏感的，有些能够检测葡萄糖浓度从0到500毫克dL^－1用于实验室化验，剂量为20至500毫克dL^－1家庭监控。然而，目前的方法可能会在存在干扰性环境条件或正在接受某些医疗治疗的患者中提供虚假的葡萄糖高值[17,18]。仪表和试纸的不兼容也可能导致不确定性，这是与当前测量葡萄糖水平的方法有关的另一个持久问题。

目前的方法的成本也是一个障碍，用于家庭监控传感器的每个条带的价格在0.35美元到1美元之间。1型糖尿病患者可能每天检查4到10次，而2型糖尿病患者的检查频率通常较低。在临床实验室中，葡萄糖量化的成本从3美元到5美元不等，尽管在一些国家，如美国，成本可能超过100美元。分析的成本也取决于所使用的分析技术的类型。就胰岛素分析而言，美国的价格从50美元到130美元不等，在一些拉丁美洲国家约为25美元。糖尿病诊断测试包括葡萄糖和胰岛素的检测和量化，费用在190美元到350美元之间，这是非常昂贵的。

基于葡萄糖以外的生物标志物检测糖尿病的其他方法正在开发中。例如，使用动力激光可以通过监测糖尿病在患者眼睛[19]中引起的身体变化来检测糖尿病的存在。另一个例子是，基于免疫学的检测谷氨酸脱羧酶(GAD)和甲状腺过氧化物酶的方法可用于诊断糖尿病[20,21]。然而，一旦糖尿病已经在体内形成，这些技术成本昂贵，很难在家里实施和评估。

鉴于上述所有问题，需要开发一种新的、具有成本效益的和准确的技术，在糖尿病的早期阶段检测葡萄糖和胰岛素水平，以便预防或治疗该疾病。我们应用合成生物学的概念，结合现有的科学方法，生产新的葡萄糖检测仪。有效利用合成生物学合成的分子传感器来增强金属的检测已经有报道。将现有的科学方法与合成生物学相结合的有效性已经得到证实。我们的传感器是用基因组和合成序列的各种遗传部分构建的。这里描述的酵母DNA传感器有效地检测人类血液样本中的葡萄糖。

材料和方法

DNA葡萄糖传感器的构建

合成的DNA遗传部分来自Clonetex Systems公司(Austin, TX)，组装在pYES2质粒载体中。序列包括参与糖代谢的Genbank登录号为U33753.1的ADH1葡萄糖启动子，Genbank登录号为XM_001386379.1的SNF3葡萄糖受体(高亲和力葡萄糖受体已被证实为葡萄糖传感器)，Genbank登录号为d26134.1的核糖体开关TC合适体，以及Genbank登录号为KT878729.1[23]的Cyan报告蛋白。实验实验室程序遵循分子生物学和合成生物学的标准方法[7,24-26]。葡萄糖传感器采用特异性引物定点克隆构建(图2)，具体如下:

图1所示。由于组装的基因两端都有EcoR1和NotI位点，所以葡萄糖装置用相同的酶消化，从pYES2载体中切出插入物。4819片段为组装葡萄糖装置，5829bp片段为pYES2载体。

图2。葡萄糖DNA传感器设备的完整地图。说明构建的质粒，基因的方向，位置和大小，以及在pYES2载体内的酶。质粒说明了葡萄糖传感器从GAL 1启动子、T7启动子、核开关TC合适体、ADH1启动子、RBS、SNF3蛋白和荧光报告蛋白序列开始。

葡萄糖仪的装配:五个基因根据国际创意园(IPOC)设计的装置组装。组装的基因包括:1;T7启动子2。ADH1发起人3。SNF3 4。TC适配体核糖体开关5。青色的记者。使用各基因重叠序列对应的PCR引物;所用的PCR试剂来自新英格兰生物实验室。使用的pYES2 Vector来自Invitrogen公司(CA)。

过程:该过程是通过结合分子生物学和合成生物学的标准实验实验室方法[7,24-26]和Clonetex Systems, Inc (Austin, TX)的实验室方法进行的。因此，PCR扩增方法如下:每个基因用基因特异性重叠引物进行PCR扩增，并在需要的地方添加酶切位点。组装好的基因两端分别在5 '处增加EcoR1位点和3 '处增加NotI位点，将组装好的器件亚克隆到pYES2载体中。

将PCR扩增的片段用同源重组方法组合，亚克隆到pYES2载体中。对转化后的克隆进行测序和分析，以确定正确的结构。

葡萄糖装置设计:该装置包含五个基因，排列顺序如下:

5个靶基因PCR、Glucose Device同源重组及亚克隆至pYES2载体完成后，从转化板中选取4个克隆进行DNA全长测序。选择与构建体设计匹配序列100%的克隆进行纯化，获得中等规模纯化水平的质粒构建体。这种DNA装置将使我们能够检测到患者血液样本中与葡萄糖相关的蛋白质，和/或检测葡萄糖本身的存在。

酵母Saccharomyces cerevisiae (Sc)的转化:所有组装好的盒式片段，用PCR (pUC13正向引物和反向引物)扩增并插入pYES2质粒，按照标准方法结合Invitrogen试剂盒协议(Invitrogen Inc.， CA)转化为酿酒酵母感受质细胞[25,26]。然而，在上述调查中，Invitrogen公司的协议是首选的，如下所示:

•10 ml YPD培养基中接种INVSc1菌落，在30℃振荡条件下培养过夜。

•在600 nm处测定酵母培养物的光密度(Optical Density, OD)，然后在YPD培养基中稀释，30°C孵育2-4小时。

•以2500转/分的转速离心培养，获得颗粒，在1X TE缓冲液中重悬40 ml。

将颗粒重悬在2ml 1X LiAc/0.5X TE缓冲液中。

细胞在室温下孵育10分钟。

•每次转化，将1µg的质粒DNA混入100µg变性剪切三文鱼精子DNA中，并与步骤5中酵母悬液的100µl混合。

质粒溶液被置于一系列试剂中，包括缓冲混合物。最终溶液在微离心机中离心，取上清，将细胞球重悬于1X TE缓冲液和驱避剂中。细胞颗粒在50-100µl 1X TE缓冲液中重新复苏，并镀于选择板上。在Sc-URA板中选择含有遗传装置的克隆。

蛋白质分析

在另一个实验中，野生型酿酒酵母(Sc)菌株200892购自ATCC。将100 μL的初始细胞悬浮液等分重悬于YPD液体肉液中(Sigma- Aldrich: 10 g酵母提取物，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖和18 g琼脂，每升)，在30°C下培养6 h，达到光密度(OD)在600 nm (λ 600)为1。标准合成完全培养基，SC - URA (1.7 g酵母氮基，5 g硫酸铵，2 g - URA滴液混合物，5 ml 200x亮氨酸和18 g Difco琼脂^{l - 1})补充精氨酸(80毫克)^{l - 1}；Sigma-Aldrich)和组氨酸(40毫克)^{l - 1}；Sigma-Aldrich)用于转化酵母的选择和培养。以下协议由Clonetex系统公司(Austin, TX)实施，以识别参与检测葡萄糖的蛋白质。包括用于检测葡萄糖的不同遗传部分的转染酵母和未转染酵母(对照)的酵母培养物样品进行如下蛋白质提取。分别与磷酸盐缓冲的生理盐水混合，在4℃、2000 g下离心3次，时间为300 s。收集球团，取1g球团用于随后的蛋白质分析，采用二维凝胶电泳(2D DIGE)和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白质鉴定[8,27]。

用Y-PER plus可透析性酵母蛋白提取试剂裂解酵母细胞。遵守了制造商的协议;用蛋白酶抑制鸡尾酒和0.1m DTT增强固定相的裂解酿酒酵母．

向小球中加入基本样品缓冲液(Sigma-Aldrich: 7m尿素，2m硫脲，4%重量/体积chaps, 30 mm tris pH 9)。随后，使用2d清洁试剂盒和2d定量试剂盒(均来自GE)对样品进行纯化。

蛋白质样品首先在小的11cm 2d标准凝胶(Biorad)上测试;用银染色法观察蛋白质。这一步可以确定样品的清洁度，优化缓冲液pH值范围和丙烯酰胺在凝胶中使用的百分比，用于后续的分析步骤。

根据制造商的协议，使用等电聚焦条(GE生命科学)通过2D-DIGE完成蛋白质分离。然后对蛋白斑点进行如下识别。串联质谱-液相色谱(LC-MS/MS):从2D-DIGE凝胶中切除的蛋白点在胰蛋白酶(10 μg ml)中消化^－1；在37°C下过夜[29]。蛋白质斑点的分析使用热菲尼根ltq线性四极离子阱质谱计(圣何塞，加州)，配有microrom范例MS4高效液相色谱，3000自动进样器的光谱系统和纳米电喷雾源。肽段从15 cm拉尖毛细管柱(100 μm内径X 360 μm内径;3-5 μm针尖开口)用7 cm vydac c18 (Hesperia, ca)材料(5 μm, 300 × 10^－10m孔径)，使用梯度为0-65%的vol/vol溶剂b (98% vol/vol甲醇/ 2% vol/vol水/ 0.5% vol/vol甲酸/ 0.01% vol/vol三氟乙酸)在流速为350 nL min的3600 s期间^－1．ltq电喷雾正模式电压为1.6 kv，毛细管温度为180℃。使用xcalibur v 1.4软件进行相关数据扫描，默认电荷为2，隔离宽度为2.491 x 10^-24年G，激活振幅为35%，激活时间为30 ms，最小信号为100个离子计数[30]。全局相关数据设置如下:拒绝质量宽度2.491 x 10^-24年G，启用动态排除，排除质量宽度为2.491 x 10^-24年G，重复计数1，重复持续时间60s，排除持续时间300s。扫描事件系列包括一次质量范围为5.811 x 10的完整扫描^-22年—3.321 x 10^-21年G紧随其后的是3次最强烈离子的依赖ms/ms扫描。用turbosequest v 3.1分析多肽的串联质谱，该程序允许将实验串联质谱数据与已知蛋白质序列[31]生成的理论光谱相关联。用于初步阳性肽鉴定的标准与前面描述的相同，即带+1电荷的肽前体离子具有xcorr >1.8， +2 xcorr > 2.5和+3 xcorr > 3.5。dcn评分> 0.08和实验/剧场>的片段离子比50%也被用作可靠匹配肽识别[30]的过滤标准。所有的匹配肽都通过光谱的目视检查得到了确认。对所有光谱进行搜索酿酒酵母2010年8月从NCBI下载的数据库。在搜索时，NCBI的酵母蛋白数据库包含72,216个条目。结果还使用另一个搜索引擎xtandem和脚手架进行了验证，脚手架是一个依赖于各种搜索引擎结果的程序(也就是说,: sequest, xtandem, mascot)，它使用贝叶斯统计来可靠地识别更多光谱[30-32]。分析样品的2D-DIGE分析，以建立pH/pi范围:采用池化内标进行二维差凝胶电泳。每个试验设4个重复。所有数据在程序sigmapplot中进行分析，使用shapiro-wilk检验和单因素方差分析，以便比较处理和分析相关性。

全血葡萄糖DNA传感器的体外分析

采用标准分子生物学方法进行在体外结合DNA提取试剂盒协议Thermal Fisher (Grand Island, NE)[26]对患者全血样本中的葡萄糖传感器DNA进行分析。PCR在标准5332 eppendorf热循环仪中进行。用ge纳米紫外分光光度计定量DNA;DNA通过热ec (ec-150)电源电泳可视化和纯化。凝胶可视化，血糖传感器的血糖浓度和DNA浓度作为测量参数在体外DNA装置的表达。

测定了酵母DNA葡萄糖传感器的荧光(FSU)在体外．这是通过在培养基中培养酵母DNA葡萄糖传感器来实现的。将保存在-80℃的酵母DNA葡萄糖装置中的样品放入YPD培养基中，稀释培养至OD值为600 nm(1)，在不同葡萄糖血当量浓度(0 - 500 mg dL)的无菌去离子水中培养和转育细胞^－1)，由一小时至四十八小时不等。虽然不同比例的酵母DNA葡萄糖传感器:使用杀菌去离子水(也就是说,1:1, 2:1, 3:1)，只有3:1的比例效果最好。酵母DNA葡萄糖传感器在此比例下的荧光(FSU)为1900 FSU。因此，当酵母DNA葡萄糖传感器与血浆样品混合使用用于检测葡萄糖时，将该值(1900 FSU)从在活的有机体内葡萄糖检测结果，如所示在活的有机体内下面的文章。DNA葡萄糖传感器的荧光(FSU)在GloMax生物分析仪检测器中测量，GloMax®-Multi+检测系统与Instinct™软件(Promega, Madison, WI)。

患者血浆中血糖的体内临床测定

对传感器的功效进行了测定在活的有机体内荧光(FSU)与患者血浆样品中血糖浓度相关。血糖测定是在哥伦比亚卡利的一个临床实验室(Alvarez-Medina实验室)进行的。患者血浆样本用于临床血糖检测。采用标准离心法提取血浆，在早餐(空腹)前8小时抽取患者血样。取10ml血样，室温(25-28°C)保存20分钟。然后，样品在3000rpm离心10分钟，以分离用于检测的血浆。根据美国糖尿病协会(ADA)的协议，对患者的血浆样本进行葡萄糖分析。所采用的方法是基于葡萄糖氧化酶/过氧化物酶-己糖激酶试验。取1 mL试剂与10µL血浆样品混合，37°C孵育10分钟。血糖水平测定采用BTS 310a，波长540 ~ 546 nm。

血糖水平分为以下3组:

1.140mg /dL或以下=正常

2.140毫克/分升- 199毫克/分升=糖尿病前期

3.200毫克/分升或更高=糖尿病

血浆DNA葡萄糖传感器的活体荧光检测

测定方法:取3组患者的血浆样品;在哥伦比亚卡利的一个临床实验室进行正常、糖尿病前期和糖尿病患者的检查。来自23例患者的样本用于分析。这些样品与酵母DNA葡萄糖传感器混合，以不同的比例，并受顶点30-50秒。虽然不同比例的酵母DNA葡萄糖传感器:使用血浆(也就是说,1:1, 2:1, 3:1)，只有3:1的比例效果最好。250µL的总样本量按3:1的比例(170µL的DNA葡萄糖传感器:80µL的血浆样品)用于葡萄糖的荧光检测。从每个样品的最终荧光中减去酵母的天然固有荧光(1900 FSU)。然后根据荧光强度与临床血糖浓度的关系将结果分为3组，如上所述。因此，DNA葡萄糖传感器的荧光结果也按血糖组分为3组(也就是说,正常，糖尿病前期和糖尿病患者)。因此，这些组是基于来自荧光强度范围的平均值。虽然从23名患者中收集了样本，但在指定的调查中只显示了15例。

结果

DNA葡萄糖传感器的构建。

葡萄糖传感器的DNA传感器的有效组装(图2)被高荧光强度(也就是说,1900fsu)的酵母DNA葡萄糖传感器暴露在YPD葡萄糖培养基中，与生长在无葡萄糖培养基中的DNA葡萄糖传感器相比，显示最小的荧光(<50 FSU)。PCR分析也证实了构建的DNA葡萄糖传感器的组装，不同的遗传部分完全组装(图1)。然后，将该DNA葡萄糖传感器亚克隆到pYES2载体中，装置有效宿主在INVSc1感受质细胞中，如图2所示(图2)。

蛋白质分析

在暴露于不同浓度的葡萄糖(包括411 mg/dL)后，通过2D-DIGE和HPLC-MS/MS进行评估，葡萄糖DNA传感器过表达不同的蛋白质(图4和图5)。分析和识别每个蛋白的不同点代表蛋白质的增加或减少。斑点表示从许多表达蛋白中选择的蛋白，使用激光豆(图3)。至少有6个被识别的蛋白表达增加(也就是说,丙酮酸激酶1、磷酸甘酶、蛋白质二硫异构酶等)，而至少6种蛋白的表达被鉴定为下降(也就是说,甘酰胺核糖核酸合成酶，硫氧还蛋白还原酶，谷氨酸合成酶等)。例如，当葡萄糖DNA传感器暴露在葡萄糖中，与代谢相关的蛋白质(也就是说,丙酮酸激酶1、s-腺苷甲硫氨酸合成酶2、甘氨酸核糖核酸合成酶、磷酸甘露酶和蛋白质二硫异构酶)和葡萄糖调节蛋白表达量较高。这些蛋白的上调明显不同于对照或未转化的酵母细胞，在这些酵母细胞中，参与葡萄糖感知的蛋白被下调或表达不高。

图3。葡萄糖DNA传感器蛋白质2D-DIGE凝胶二维(2D-DIGE)凝胶显示我们的DNA传感器蛋白质在不同强度下的荧光。在高效液相色谱质谱和激光鉴别下，选择表达较高蛋白的最亮点进行分析。

图4。暴露于患者血清样本后葡萄糖传感器的DNA电泳条带。葡萄糖传感器DNA电泳凝胶带，暴露于不同患者血液样本后，表达不同的荧光(体外试验)。葡萄糖传感器的DNA凝胶带，从左到右依次为:Lane 1。分子DNA标记(1kb)。巷2。正常的患者样本;该凝胶的亮度最低，血糖浓度(100.2 mg/dL)和DNA浓度(18.5 ng)均最低。巷3。前驱糖尿病患者样本;该凝胶的亮度第二低，血糖浓度(135.9 mg/dL)和DNA浓度(52.5 ng)第二低。巷4。 Controlled diabetic patient sample; this gel showed the second highest brightness, and the second highest concentration of both glycaemia (185.7 mg/dL) and DNA (77 ng). Lane 5. Uncontrolled diabetic patient sample; this gel showed the highest brightness, and the highest concentration of both glycaemia (411 mg/dL) and DNA (85 ng).

图5。DNA传感器用于糖尿病血糖检测的假设机制。这一机制基于以下步骤(#1到#6):#1 =酵母细胞。2 =葡萄糖分子与酵母细胞接触。#3 =细胞膜中的离子通道葡萄糖分子激发的离子通道。细胞质中用于细胞内葡萄糖运输的第二信使系统(即GLUT和激酶)(Olson和Pessin, 1996)。诱导代谢级联以激活细胞核中的DNA传感器。细胞核中DNA传感器的转录产生荧光报告蛋白。根据葡萄糖浓度激发生物光子发射荧光。(46）

全血葡萄糖DNA传感器的体外分析

葡萄糖传感器的DNA电泳凝胶带在暴露于不同水平的血糖患者的血液样本后显示不同的荧光(也就是说,正常,前驱糖尿病,糖尿病)。因此，来自葡萄糖传感器的DNA凝胶带显示出不同的强度，取决于患者的血糖水平。因此，亮度水平与DNA浓度和血糖水平相关，来自正常患者的样本表达的亮度最低，DNA浓度(18.5 ng)和血糖浓度(100.2 mg/dL)最小;来自糖尿病前期患者的样本中亮度第二低，DNA (52.5 ng)和血糖(135.9 mg/dL)浓度第二低;对照组糖尿病患者的样品表现出第二高的亮度，第二高的DNA (77 ng)和血糖浓度(185.7 mg/dL);来自未受控糖尿病患者的样本表达了最高的亮度，以及最高的DNA浓度(85 ng)和血糖浓度(411 mg/dL)(图4)。

患者血浆中血糖的体内临床测定

我们的在活的有机体内结果与在体外尽管我们收集了23例患者的样本，但在上述调查中只显示了15例患者的结果(图4)。结果是基于每组(即组1 =正常，组2 =糖尿病前期，组3 =糖尿病)荧光强度范围的均值(表1)。当DNA葡萄糖传感器与患者血浆混合时发出的荧光强度与患者临床检测的血糖水平之间存在相关性。因此，根据荧光强度的范围，不同组样品的荧光平均值(也就是说,组1(正常)，组2(糖尿病前期)，组3(糖尿病))与同等水平的血糖血症相关。这些相关性如表1所示，因此，暴露于正常患者血浆样本的DNA葡萄糖传感器的荧光平均值显示出最低的强度(1068.8 FSU±141.4)和最低的血糖水平(<140 mg/dL);糖尿病前期患者样本平均血糖水平为第二高(4783.3 FSU±144.3)，血糖水平为第二高(140 ~ 199 mg/dL);糖尿病患者样本平均血糖浓度最高(6712 FSU±1118)，血糖水平最高(>200 mg/dL)。

表1:根据葡萄糖DNA传感器荧光和临床血糖浓度对患者进行分组。

	病人	性别 (女/男)	年龄	葡萄糖荧光(前苏联)	血糖(mg / dL)
组1 (正常)	19	女	40	1000	104
	18	女	34	940	106
	16	男性	64	1000	108
	15	女	60	1100	110
	17	女	67	1000	110
	10	男性	46	960	130
	11	女	62	1350	135
	7	女	60	1200	138
				意思是=1068.8SD =±141.4
组2 (相)	23	男性	76	4700	151
	8	男性	52	4700	190
	22	女	66	4950	196
				的意思是= 4783.3SD =±144.3
组3 (糖尿病)	21	男性	65	7400	218
	13	男性	42	7500	243
	21	男性	51	7500	346
	12	男性	56	5200	370
				的意思是= 6712SD =±1118

*注±SD =标准差

*患者分组类型:正常、糖尿病前期和糖尿病

相反，阴性对照是一株未转化的酿酒酵母，没有显示荧光。因此，与对照或未转化的酵母细胞相比，葡萄糖酵母DNA传感器在较高和较低浓度的葡萄糖下都显示出更高水平的荧光。

讨论

标准化的生物砖部分与合成的序列如ADH1蛋白、SNF3转运体、核糖体开关TC适体和荧光报告蛋白的组装是有效的，这反映了我们的葡萄糖酵母DNA传感器对葡萄糖的敏感性在体外而且在活的有机体内在人类血浆样本中。结果证实了该装置在检测与葡萄糖存在相关的蛋白质(葡萄糖通常存在于真核糖蛋白中)和/或检测葡萄糖本身方面的有效性。其他报告显示葡萄糖与人类糖蛋白[7]有关。

明确的证据，我们的酵母DNA葡萄糖传感器的功能观察在体外DNA葡萄糖传感器的荧光与葡萄糖浓度之间的直接相关性，以及携带该传感器的酵母细胞的生长、葡萄糖浓度和荧光之间的直接相关性(数据未显示)。此外，我们的研究结果显示，血糖浓度与DNA之间存在直接的相关性，证实了DNA传感器的准确性。这些结果也证明了DNA传感器对糖尿病患者的特异性。以前的报道也证实了DNA传感器细胞的荧光和检测[7]的敏感性之间的直接相关性。

同样，功效酿酒酵母作为葡萄糖传感器的理想活性细胞(底盘)已被证实，由于这种酵母的巨大遗传机制与糖代谢[22]相关。此外，加入ADH1蛋白、SNF3转运体和核糖体开关TC适体等遗传部分，提高了细胞的效率和能力酿酒酵母检测不同或特定浓度的葡萄糖[7]。ADH1蛋白和葡萄糖的SNF3转运体，以及核糖体开关TC适体，增强了传感器的灵敏度，即使是对极低水平的葡萄糖。我们要记住真核生物酿酒酵母细胞可能携带自身的核糖体开关。此外，选定的启动子在受控的碳分解代谢抑制下增强了DNA传感器对葡萄糖的检测。因此，当传感器接触到样本时，传感器蛋白质会检测到血液中的葡萄糖分子。初始反应取决于葡萄糖浓度。一旦启动子激活转录，根据葡萄糖浓度，一定水平的转录被翻译成蛋白质。当高水平的葡萄糖可能抑制ADH1蛋白的激活时，核糖体开关适体确保蛋白质的转录和翻译。当核糖体开关TC适体构成打开时，蛋白表达增加[7](图2)。转录蛋白的基因与一种蛋白的基因融合，该蛋白根据其表达发出荧光，这与血浆样品中的葡萄糖浓度直接相关。其他作者建议，当游离蛋白数量超过核糖体蛋白数量时，抑制核糖体蛋白的操纵子基因，从而形成开/关开关系统[36,37]。核糖开关也被认为是一种响应极端环境条件的信号机制，如氧化应激[38]。因此，核开关可能在本文描述的DNA传感器中发挥重要作用，因为葡萄糖易受氧化条件[39]的影响。

因此，我们在此提出一种假设的DNA葡萄糖传感器与葡萄糖分子之间的相互作用机制(图5)。该机制基于以下步骤:酵母DNA葡萄糖传感器细胞与葡萄糖分子接触，酵母细胞膜上的离子通道被激活，细胞质中用于细胞内葡萄糖转运的第二信使系统(即GLUT和激酶)诱导细胞内DNA传感器激活的代谢级联反应，细胞核内DNA传感器转录后产生荧光报告蛋白。最后根据葡萄糖浓度激发生物光子发射荧光[40-42]。

2D-DIGE和LC-MS/MS分析表明，与未转化的酵母对照相比，我们的遗传葡萄糖传感器设备能够在酵母DNA传感器中诱导差异反应，即使两种酵母系统生长在相似的条件和相似的葡萄糖浓度下。参与或与葡萄糖代谢相关的蛋白质表达水平较高。如图3所示，葡萄糖酵母DNA传感器证实了这些蛋白的上调，并且与葡萄糖代谢高度相关，表明这些蛋白可能也通过支持酵母蛋白的翻译和氨基酸的生物合成来帮助DNA传感器检测葡萄糖[43,44]。在我们的DNA传感器中高度表达的蛋白质包括s-腺苷甲硫氨酸合成酶2、甘氨酸核糖核酸合成酶、磷酸甘醇合成酶和蛋白质二硫异构酶[41,45]。此外，这些蛋白质可能反过来调节传感器设备蛋白质的表达。部分上调蛋白参与调控传感器装置蛋白表达，包括谷氨酸合成酶和翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)类似物，均对糖酵解酶[5]的下调有抑制作用。2D-DIGE和HPLC-MS/MS技术的高灵敏度也确保了感兴趣的蛋白质的正确识别，因为许多传统的分子生物学技术不够敏感，无法识别这些蛋白质在不同调控状态[21]。

各组DNA葡萄糖传感器荧光表达量(也就是说,正常、糖尿病前期和糖尿病患者)与血糖临床试验的相关性良好，证实了使用光学GloMax系统时传感器检测的准确敏感性。也许，这可以用活细胞对外部发光源[46]诱导的光子发射的主动光学行为来解释。这种光光子活性类似于自荧光，可能随时间而变化。同样，生物系统，包括有机体，可能遵循这个可变模式，直到自发光学活动水平恢复[47]。因此，有机体和/或细胞可以被具有特定光谱和强度的光-光子源激发。因此，生物似乎是在宽光谱范围的光子的持续作用下。因此，更有可能的是，一种形式的电磁场发射也参与了生物系统的荧光，如DNA葡萄糖传感器[1]。

结论

我们的DNA传感器表现出高度的敏感性，能够检测非常低水平和高水平的葡萄糖，相当于临床血糖值。DNA传感器的这一特性非常有利，因为检测血液中较低的血糖水平将允许临床医生诊断受试者的糖尿病前期和/或低血糖。由于我们的DNA传感器允许检测高和低水平的葡萄糖，这一设备可以用于多种目的，因此使我们的DNA传感器非常划算。

构建DNA传感器2021版权所有。保留所有权利的遗传部分，并能够检测低和/或高水平的葡萄糖在体外而且在活的有机体内在短时间内的人类血浆样本中(也就是说,不到一分钟)。

这种具有成本效益的DNA传感器很好，因为我们的传感器可以用于糖尿病或糖尿病前期条件的早期诊断，从而允许更早的临床干预。葡萄糖水平和DNA传感器的荧光强度之间的直接相关性显示了使用该技术以识别特定类型的糖尿病患者的优势，因为有时很难用不同的方法建立准确的相关性。

确认

这项工作得到了哥伦比亚马尼萨莱斯国际创意园实验室的支持。我们感谢德克萨斯州奥斯汀的Clonetex系统公司提供合成序列，并在实施这项工作期间提供技术援助。此外，感谢医学博士塞西莉亚·阿图罗(Cecilia Arturo)在医疗建议和为患者提供帮助方面的贡献，以及劳伦斯·维兰纽瓦(Lawrence Villanueva)博士对手稿的编辑。

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