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文化的方法

饲料基础培养

标准的人多能干细胞(hPSCs)培养具有支持细胞，如失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)喂养细胞，可帮助细胞生长，向培养基中分泌几种重要的生长因子，有助于维持多能性和防止分化[1]。以饲料为基础的培养适合于hPSCs菌落的日常维护，而mef是最常用的饲料细胞，特别是因为它们支持所有类型的胚胎干细胞作为菌落[2]的健壮生长。然而，由于MEF具有复杂和不确定的异质性，各种人类细胞类型，如人成纤维细胞，输卵管，包皮和骨髓来源的基质细胞，可以作为喂养细胞代替MEF[2]。以饲料为基础的培养适合于常规的hPSCs维护、基因工程和单细胞克隆，但不用于临床应用。

Feeder-free文化

无饲料培养，如添加激活素A和FGF-2的KSR，已被证明支持在未分化状态下的人类胚胎干细胞[1]的自我更新。

非菌落型单层(NCM)扩张

由于集落培养或悬浮培养存在异质性和悬浮环境等缺点，不适合药物筛选或单细胞分析，单细胞非集落型单分子膜(NCM)培养已发展起来。多能干细胞的二维单层培养需要足够的细胞数量和细胞密度。HPSCs可以通过将单层细胞粘附到带弱负电荷的塑料容器上进行繁殖。细胞外基质蛋白和蛋白多糖首先从细胞中分泌形成基质，并附着在塑料容器上，如带负电荷的聚苯乙烯。细胞通过细胞表面的特定细胞表面受体附着在基质上。因此，使用具有更好表面的现有培养容器进行附着会导致更快的细胞附着[2]。

高密度(约1.4 × 10)分离细胞(单细胞)⁵/厘米²)使用Rho激酶(ROCK)抑制剂或JAK抑制剂1在Matrigel包覆聚苯乙烯板上培养，其早期24 h的单细胞电镀效率较高。此外，hPSCs可以在人重组laminin-512包覆聚苯乙烯表面的NCM上培养，而无需使用ROCK抑制剂，在这种生长条件下的hPSCs一般具有遗传稳定性和多能性[3]。

这种培养的优点是无需喂养，生长速率可调，产生均匀的hPSCs，细胞快速生长，细胞在低温保存后快速(2-4天)恢复(与集落培养1 - 3周相比)。特别是，用NCM培养的hPSCs对畸胎瘤的形成非常有效，如果以块状[2]生长，可以转化为集落型培养。

一批文化

批量培养是一个部分封闭的系统，其中大部分所需的物质被装载到生物反应器容器中，只有气体交换和pH值调整所需的物质被添加或去除。

灌注文化

灌注培养是一种通过灌注不断提供新的培养基，并将消耗的培养基除去，从而形成恒定的培养环境，使细胞培养时间更长的培养方法。

悬挂的文化

预期hPSCs的临床效果，从10⁷-10年¹⁰都是必不可少的。生物反应器的悬浮培养可以用于这一目的的大规模生产，通过悬浮培养培养的hPSCs保持多能性和染色体稳定。在众多类型的生物反应器中，旋转容器和搅拌槽生物反应器提供了一个工作容积为50 mL至200 L的玻璃容器和均匀的生长环境，并可以通过实时监测温度、氧水平、酸度、生长因子消耗和代谢产物浓度[5]来精确控制培养条件。悬浮培养的一个主要缺点是与水动力剪切力[5]相关的细胞损伤。另一个缺点是生长速率根据悬浮培养条件的不同而不同。随着细胞聚集体的大小和不规则性增加，可发生凋亡细胞丢失、细胞分化和异质性。此外，ROCK对hPSCs的长期抑制作用尚不清楚。

环境因素

除了上述培养基和细胞外基质外，还有促进hPSCs生长的物理和生理环境，如温度、湿度、渗透、酸度、生长表面硬度、细胞密度等。传统的hESC培养在正常的氧水平下进行，而早期在体内的哺乳动物胚胎在缺氧条件下发育。生理水平低氧浓度(2 - 3%)可减少hESC的自发分化，使hESC克隆恢复提高6倍，并在不影响多能标记[6]表达的情况下减少染色体畸变。多能干细胞传统上是在基质基质的MEF上作为菌落生长，并分化为胚状体(EB)聚集体。细胞内信号通路、细胞密度、配体受体相互作用等细胞间连接对hPSCs的微环境有很大影响。随着单细胞死亡和存活机制的发现，可以选择各种培养形式，如菌落、单细胞、单细胞非菌落型单层细胞和悬浮聚集体[1]。

参考文献

1. Chen KG, Mallon BS, McKay RD, Robey PG(2014)人多能干细胞培养:维持、扩展和治疗的考虑。细胞干细胞14: 13 26。［Crossref］
2. Pamies D, Bal-Price A, Simeonov A, Tagle D, Allen D，等人(2017)干细胞和干细胞衍生模型的良好细胞培养实践。动物实验的替代品:ALTEX34: 95 - 132。［Crossref］
3. 陈凯坤，Mallon BS, Hamilton RS, Kozhich OA, Park K，等(2012)人胚胎干细胞的非集落型单层培养。干细胞研究9: 237 - 248。［Crossref］
4. 微流体的起源和未来。自然442: 368。
5. Serra M, Brito C, Correia C, Alves PM(2012)用于临床应用的人类多能干细胞的工艺工程。生物技术的发展趋势30: 350 - 359。［Crossref］
6. Forsyth NR, Musio A, Vezzoni P, Simpson AHR, Noble BS(2006)生理性氧增强人类胚胎干细胞克隆恢复和减少染色体异常。克隆和干细胞8: 16-23。［Crossref］