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摘要

多糖（PS）是从食用、药用植物中分离出来的，艾米莉亚·索奇福利亚。通过人宫颈癌细胞系（Hela）中的MTT测定研究多糖的细胞毒性活性。PS降低了HeLa细胞的可行性，以及IC₅₀值为40 μg/ml，且呈浓度依赖性。PS可使细胞内活性氧水平以浓度依赖性的方式升高，提示其作用机制。该化合物的抗癌活性正在进一步研究中。

关键字

多糖，Emilia，宫颈癌，HeLa细胞系，MTT法，ROS法

介绍

天然产物在药物开发中占有重要地位。目前大约有一半的临床药物来自天然产品。山茱萸(l)菊科(Compositae)是一种草本植物，产于台湾和印度。伊米莉亚sonchifolina据报道又具有抗热活动[2,3]抗菌活性[4]镇痛和抗炎活动[5-7]，抗癌活性[8-10]抗氧化活性[11-14]，抗糖尿病[15];Antije，Couto，Gao，Cheng等人。[16-19]抗惊厥活性[20]。据报道，该植物的空中部分含有生物碱[21]类黄酮和萜烯[22]。山茱萸据报道，提取物通过P53介导的ATM / FAS信号传导激活HCT 116人结肠直肠癌细胞中的外在和内在途径的凋亡[23]。山茱萸开花前用作色拉植物，叶和茎用作蔬菜[24]。

宫颈癌是全世界女性癌症死亡的第四大常见原因[25]。70%的宫颈癌发生在发展中国家。据估计，2012年有528000例宫颈癌患者，266000例死亡[26]。这大约占癌症总病例和总死亡人数的8%。在低收入国家，它是癌症死亡的最常见原因。在里面发达国家，宫颈筛查计划的广泛使用显着降低了宫颈癌的速率[27]。据报道多糖具有抗肿瘤性质。例如，Lentinan是一种β-1-6，由雌克蘑菇产生的葡聚糖，Lentinus edodes，具有对人类肿瘤的抗癌作用。我们早期的研究表明，从药用蘑菇中分离出的多糖，灵霉素，具有增强人淋巴细胞[29]DNA修复能力。

传统的主张促使我们选择这种植物作为研究对象。从多糖中分离得到多糖(PS)山茱萸并对其在HeLa宫颈癌细胞株中的细胞毒性和抗氧化活性进行了研究。

材料和方法

化学品

所有的化学品都是从班加罗尔的默克公司获得的。

隔离的多糖

从印度喀拉拉邦郊区收集全植物材料。通过微米的方法分离多糖，通过Mizuno [30]的方法，具有轻微的修饰。过滤沸腾和植物茎后获得的水提取物并浓缩至其原始体积的约三分之一，冷却乙醇约加入萃取物的体积并在4℃下保持48小时。将提取物在低温下离心。将得到的沉淀物溶于水中并用相等体积的甲甲基三甲基铵氢氧化物再沉淀并保持过夜。将上清液再次分离并用冷冻乙醇沉淀。离心后，将所得沉淀物干燥并装载在DEAE纤维素柱上并用去离子水（25ml级分）洗脱。用苯酚硫酸试剂[31]测试多糖级分，用于确认。然后将级分在低温下蒸发并冻干以获得浅棕色粉末。通过IR，NMR和ESR分析进一步表征化合物。 The compound was dissolved in double distilled water for the studies.

细胞培养

人宫颈癌细胞系，HeLa单层贴壁于组织培养瓶中，完整的DMEM (GIBCO)添加10% (v/v)胎牛血清(FBS)，含100mg /l青霉素和66.6 mg/l链霉素。细胞在37℃、5% CO的湿化培养箱中培养₂. 在实验过程中，使用1XPBS-EDTA清洗细胞，使用0.25%的胰蛋白酶进行胰蛋白酶化，用完整的DMEM中和，以1500 rpm离心5分钟，吸取上清液，而将颗粒悬浮在完整的DMEM中进行播种或培养。

细胞毒性试验

使用MTT（3-（4,5-二甲基）评估细胞活力thiazol-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化）染料。简单地说，将5000个细胞/孔接种在96孔板中，并使其粘附过夜。用不同浓度（25-250µg/ml）的PS处理细胞E.sonchifolia48h后，加入MTT（5mg/mL），培养3.5h，然后吸入培养基并通过添加二甲基亚砜（DMSO）增溶福尔马赞晶体。5分钟后，使用Bio-Rad 680型色度计在570 nm处以655 nm为背景参考读取显影颜色作为光密度（OD）。

活性氧(ROS)测定

将HeLa细胞（15000个细胞）接种在96孔/板上，并用不同浓度（25-250µg/ml）的PS处理E.sonchifolia完全去除培养基，用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。用二甲基亚砜(DMSO)制备20 mM二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)原液。用1XPBS(1:2000)稀释DCFH-DA，制成5µM的工作浓度。每孔取50µl的DCFH-DA, 37℃暗箱孵育30 min，然后取出DCFH-DA，每孔加入100µl的1XPBS，在480 nm(激发波长)和530 nm(发射波长)读取。同时，用阿拉玛蓝测定细胞活力，并与ROS读数归一化。实验至少进行了三个独立的实验，每个实验不少于四个重复。

结果

多糖的分离G.lucidum回答了苯酚硫酸测试，给出了典型的颜色反应，表明存在碳水化合物。三吸收带特性(H-O-H弯曲)1637厘米。-1， (OH) 3448.64 cm.sup。－1and (C=O bond)1636.83 cm.sup.-1 were observed. The band between 1000-1100 (1110 cm^－1）β-葡聚糖存在是特征。在HNMR光谱中，H.Sup.-1在小于4.8ppm（4.685,4.682,4.677ppm）的情况下观察到，这表明组分糖具有β（1,6）配置。

PS降低了HeLa细胞的可行性，以及IC₅₀在48小时（图1）时，发现HeLa细胞的值为40μg/ml，呈浓度依赖性。使用DCFH-DA测量细胞内活性氧（ROS）产生水平。PS以浓度依赖性方式增加HeLa细胞中ROS的产生（图2）。结果表明PS诱导HeLa细胞产生ROS，这可能是其发挥细胞毒性作用的机制之一[32]。

图1所示。ESP对HeLa细胞活性氧的影响。

图2。ESP对HeLa细胞活力的影响。

讨论

据报道，该植物的醇提物(上部分)具有细胞毒性，并具有抗EAC和抗dalton淋巴瘤腹水的活性。多糖是水提物的主要成分。

生物活性多糖和多糖结合的蛋白调节的能力是由于这些大分子的结构分集和可变性，因此可能是由于这些大分子的结构性分集。与蛋白质和核酸不同，多糖含有重复的结构特征，其是通过糖苷键合彼此连接的单糖残留物的聚合物[33]。在这些大分子中，多糖提供了携带生物信息的最高能力，因为它们具有最大的结构性变异潜力。例如，四种不同糖单体的可能排列的数量可达35,560个独特的四糖，而四个氨基酸只能形成24种不同的筛选[33]。因此，这种多糖结构的这种巨大潜在可变性为各种细胞间相互作用的精确调节机制提供了必要的灵活性。证据表明，多糖的活性也取决于它们的构象，组成和尺寸，高分子量级分是更活跃的，而来自相同源的低分子量的馏分显示出没有活性[34]。

化学修饰通常是为了提高多糖的抗肿瘤活性和其临床质量(主要是水溶性)。当与化疗联合使用时，它们的活动在临床上尤其有益。

活性氧在细胞凋亡中起重要作用。在凋亡过程中，细胞活性氧（ROS）产生的增加通常被各种刺激物（如APO-1/Fas/CD95配体）所增强[35-42]。活性氧浓度的增加刺激各种细胞类型的凋亡细胞死亡[43,44]，表明活性氧在凋亡过程中的产生有助于细胞死亡。

草药多糖是具有多种治疗潜力的天然化合物。我们对特定结构函数关系和多糖特异性受体的理解的持续发展应该为进一步发展具有新细胞毒性活性的这些化合物提供基础。作为山茱萸作为一种药用植物，将其应用于病害管理将是一个很有前景的途径。

确认

作者感谢Saif的人，Iit Mumbai为帮助获得化合物的结构细节。

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