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摘要

在这项研究中，我们主要关注与手术相关的上气消化道鳞状细胞癌的转移过程。我们尝试在术前、术中及术后血液中检测头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)的分离细胞(CTCs)。基于这一目的，我们实现了一项前瞻性研究，分析手术在9天内对CTC水平的影响。本研究采用了两种广泛应用的技术:实时PCR和细胞搜索。

背景

手术对癌症生物学的影响是一个大问题，从细胞扩散到免疫抑制。转移性疾病仍然是SCCHN癌症的主要死亡原因之一。然而，与其他类型的癌症如乳腺癌或肺癌相比，SCCHN的远处转移发生率仍然较低。目前，迫切需要新的、更好的预后标志物来提高SCCHN患者局部复发和远处转移的预测能力。

转移可以发生在手术中，作为一个级联事件，开始于肿瘤细胞脱离其原发肿瘤部位后，部分或完全上皮间质表型转变。上皮-间充质转化(epithelial - mesenchymal transition, EMT)是一个复杂的形态发生过程，上皮细胞在胚胎发生或癌症进展过程中失去其特征，获得间充质特性。这一步之后，细胞侵入血液或淋巴系统。由于静脉和动脉应力剪切、免疫监视和高流速，一些细胞可能在循环过程中发生凋亡。存活的细胞可以作为单细胞循环，称为循环肿瘤细胞(CTCs)，也可以作为细胞集群，称为循环肿瘤微栓塞(CTM)，具有较高的转移潜力。CTCs可在远处组织中保持休眠状态，从而形成微小转移，并可进展为继发性、明显的宏观转移[1]。

EMT过程受生长因子(TGFβ)等效应因子的诱导和调节，也受缺氧的影响。其特征是上皮标记物(e -钙粘蛋白、细胞角蛋白、咬合蛋白和ZO-1)的丢失，间充质标记物(n -钙粘蛋白、纹蛋白和纤维连接蛋白)的获得和mmp的高表达，这些标记物有助于癌细胞生长和扩散。

先前的研究表明，肉眼证实的SCCHN患者外周血中CTCs的存在可预测癌症复发和/或癌症相关死亡率[2]。事实上，CTCs的检测对SCCHN患者有预测价值，主要是对肿瘤进展的预测。CTCs的缺失可能被认为是无病生存的一个指标。然而，SCCHN患者的CTC状态似乎与TNM疾病分期和淋巴结受累[3]无关。

检测循环肿瘤细胞的能力可能会对癌症患者的预后和治疗产生影响。目前，这个话题还没有得到很好的解决。目前研究最多的CTCs检测方法包括聚合酶链反应(PCR)、微流控芯片、免疫磁富集、流式细胞术和激光扫描细胞术。这些方法检测CTC的敏感性和特异性取决于所使用的标记。一个重要的问题是标记的选择，因为SCCHN与其他细胞类型有许多相互标记[4-6]。

缩写:

头颈部鳞状细胞癌;CTC:循环肿瘤细胞;EGFR:表皮生长因子受体;EpCAM:上皮细胞粘附分子;EMT: Epithelial-mesenchymal过渡;东航:癌胚抗原;CK 18,19:细胞角蛋白18,19;Ef3: E74-like 3;PVA:寻常Pemfigus vulgaris抗原，SCCA:鳞状细胞癌抗原;EphB4:产生促红细胞生成素的肝细胞酪氨酸激酶; RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction; CTM: Circulating tumor Microemboli

方法

病人的特点

本研究纳入40例患者。该研究获得了患者保护伦理委员会(N°CPP: 2010-A00586-33)的批准。所有入选的患者都签署了同意书。他们都于2014年4月至2015年4月在法国洛林癌症研究所(Nancy, France)接受了头部和颈部的SCCHN手术。患者进行了放射诊断，被分配为可手术的SCCHN，既往没有癌症治疗(手术、放疗或化疗)。患者的中位年龄为66(37 - 84)。癌症分期:2例为II期，23例为III期，15例为IV期。

分别于术前第1天、术中第7天和术后第7天采集静脉血。我们用实时定量PCR和CellSearch系统两种不同的方法检测CTCs。

播散性肿瘤细胞检测:细胞搜索系统

细胞搜索系统用于检测播散性肿瘤细胞。在没有头颈癌检测试剂盒的情况下，我们使用了CellSearch上皮试剂盒和EGFR。CellSearch循环肿瘤细胞试剂盒用于全血中上皮来源的循环肿瘤细胞的枚举[7-9]。

CellSearch系统包括两个部分:自动准备系统和CellTracks分析仪(Veridex LLC, USA)。自动准备系统选择ctc，并使用自动和标准化的免疫磁细胞富集检测它们。自动准备系统使用两级磁分离程序分离细胞:第一步包括富集，然后是检测步骤。通过这种方式，使用涂有EpCAM抗体的铁磁流体颗粒进行免疫磁选择。这一步骤产生了游离细胞和血浆排斥，以及肿瘤细胞富集。然后在剩余的epcam阳性细胞中加入渗透缓冲液(用于细胞角蛋白染色)和荧光试剂。荧光试剂包括用于核标记的DAPI，用于检测上皮细胞的抗细胞角蛋白(CK 8,18,19)，以及与异藻蓝蛋白结合的抗cd45抗体用于白细胞排斥。

CellTracks分析仪是一种与分析软件连接的半自动荧光显微镜。该软件在计算机屏幕上检测、捕获和显示四种颜色荧光细胞的图像。操作员确认sctc的存在并手动计数。弥散性肿瘤细胞响应多种标准:阳性核染色(DAPI:紫色)，细胞角蛋白阳性表达(绿色)和CD-45阴性染色。

循环肿瘤细胞的典型图像显示在图1中。细胞核为红色，绿色代表EGFR。该细胞cd45阴性，CK标记阳性，均证实其肿瘤性质(8-18-19)。

图1所示。CTC细胞搜索图像。

播散性肿瘤细胞检测:RT-PCR

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是目前最灵敏的mRNA检测和定量技术。

在我们的研究中，我们使用了iScript Advanced cDNA Synthesis Kit[9]。该试剂盒是一种增强型配方，由无核酸酶水、逆转录酶和dNTPs和寡聚(dt)反应混合物组成。一旦反应混合物准备好，我们使用热循环器(Eppendorf, Le Pecq, France)组成的连续步骤(表1)。

表1。步骤rt - pcr iScript

一步	时机	温度
1	5分钟	25°C
2	30分钟	42°C
3.	5分钟	85°C
4	直到完全冷却	4°C

第一步，称为变性，使核酸的双链分离。第二种叫做杂交，它允许互补的DNA碱基结合。最后一种是DNA伸长，它促进DNA聚合酶进行聚合。

RT-PCR利用荧光报告分子来监测PCR反应每个周期中扩增产物的产生。当DNA处于对数线性扩增相时，荧光量高于本底增加。在本研究中，我们使用SYBR Green (iQ, SYBR Green Supremix, BIO-RAD)作为荧光报告剂。SYBR绿色只有与dsDNA结合时才会发出荧光。荧光的增加与双链DNA的增加相对应。

在我们的研究中，我们使用9个标记进行定量RT-PCR: EphB4, Elf3, CEA, CK 18, CK19, Ep-CAM, EGFR, PVA, SCCA和GAPDH(内参基因)。

统计方法

用Boxplot方法对数字参数进行均值、中位数、第一和第三四分位数、最小值和最大值的描述。定性参数为频率和百分比。用夏皮罗-威尔克斯检验考察各标记分布的正态性。为了恢复分布的正态性，必须改变某些参数(对数变换)。

在三个时间点(术前、术中和术后)采用混合线性模型研究标记物的进展。通过这种方式，我们考虑了任何个体患者的测量重复。为了并排比较时间，完成了两项事后分析。Bonferroni修正允许修正alpha的风险增量。这种分析是对总价值、转换值(使用对数函数)或存储值(Conover方法)进行的。

探索性分析临床参数(定位、血管栓子、淋巴结受累及传播)对标记物值的影响。为此，在每次临床参数中比较每种标记物。对血管栓子、结节受累和传导进行Mann-Whitney试验，而对定位使用Kruskal-Wallis试验。

双侧p < 0.05被认为有统计学意义。所有分析均采用v9.3 (SAS, Cary, NC, USA)进行。

结果

表2展示了两种技术的生物标志物检测结果。RT-PCR结果显示EphB4、CEA、ck18和Ep-CAM (Shapiro-Wilks检验)有显著性差异(p < 0.05)。其他检测标记不显著表达。

表2。结果Rt-PCR和CellSearch

rt - pcr		CellSearch
EphB4	P: 0, 0003	表皮生长因子受体	P: 0 01
东航	P: 0006
CK18	P: 0, 0011
EP-CAM	P: 0, 0299
与rt - pcr		非重要CellSearch
精灵3	P: 0, 0764	CTC上皮工具包	P: 0, 17岁
CK19	P: 0, 2525
表皮生长因子受体	P: 0, 2158
SCCA	P: 0, 6551
PVA	P: 0, 0542

使用上皮试剂盒的CellSearch系统得到的结果无统计学意义(p > 0.05)，而EGFR的表达有统计学意义(p=0.01)。我们进一步分析了EGFR的表达动力学，Boxplot显示了手术发生率(图2)。在所有研究患者中，我们观察到EGFR的表达在术后两小时显著下降(p< 0.05)，并在7天内保持稳定。细胞搜索评估上皮Kit表达观察到同样的情况;然而，数据并不显著(p > 0.1)(图3)。

在四种rt - pcr评估的生物标记物中，显示了统计学上显著的表达(表2)，我们对EphB4特别感兴趣。EphB在H&N癌症中的关键作用已得到公认。图4 (a)显示了个体患者EphB4表达的变化。我们可以注意到EphB4表达的强烈变化，可能与肿瘤细胞数量不足有关。箱线图显示(图4b)在手术后2h标记物表达增加1.5倍，并在7天后恢复到基础(术前水平)。RT-PCR分析的其他具有统计学意义的标记(表2)也提供了相同的图谱，但为了表达清晰，我们没有描述它们。

图2。EGFR结果使用细胞搜索

图3。CTCs上皮检测试剂盒检测细胞

图4。每个患者中EphB4 (RT-PCR)的表达(a)和显示EphB4变化的箱线图(b)

讨论

这项有关手术中肿瘤细胞播散的研究使我们能够陈述一些客观事实。我们首次证明了III期和IV期SCCHN的外科手术是在血液和淋巴管中ctc的起源。此前，少量样本的初步调查表明，原发性乳腺癌和结直肠癌手术中肿瘤操作可诱导肿瘤细胞弥散(12-14)。另一项研究表明，前列腺腺癌根治性手术在术前和处理肿瘤过程中会导致前列腺细胞频繁扩散(15)。这种前列腺细胞的溢出显示出很强的生物学预测能力。

在我们的研究中使用了两种不同的技术来监测患者的血液:细胞搜索系统和RT-PCR。Cell Search为乳腺癌、前列腺癌或结直肠癌患者的预后和监测提供信息。目前，这是FDA批准的ctc检测的唯一技术。从我们的结果(表2)来看，尽管没有针对H&N癌症的特异性试剂盒，但使用上皮试剂盒和EGFR的CellSearch System似乎是可行的。在我们最近的研究中，我们已经在14例接受III期和IV期H&N癌[9]手术的患者中证明了用细胞搜索在颈清扫术后引流中检测DTC的可能性。术后几天，69%的患者的引流管中检测到肿瘤细胞。这项研究使我们能够对这些患者提出不同的治疗方案。细胞搜索系统的主要缺点是结果的量化几乎是不可能的。相反，RT-PCR提供了定量方面，但需要进一步优化以获得更好的检测灵敏度[8]。最近，循环microRNAs被认为是癌症诊断和预后的有前途的生物标志物。 MiRNAs may be considered as novel non-invasive biomarkers but the function of circulating miRNAs needs to be identified for their proper use in evidence-based medicine [11].

结论

在我们的研究中，四种标记物(EGFR, Ephb4, CEA, CK18)显示了与手术相关的显著变化(表2)。与该区域已发现的肿瘤细胞相比，这四种标记物在统计学上显著增加。它可能构成了与手术中释放的细胞相关的肿瘤细胞表型。术后2小时，除EGFR外，其余4种标志物的表达均升高，但术后7 ~ 8天血流中表达水平趋于稳定(图2-5)。标记物表达的增加可能是由于循环肿瘤细胞的增殖或睡眠细胞的积累标记增强

每个患者都有特定的标记进化图谱，有些标记显示特定的图谱(例如:EphB4 vs PVA)(图4和图5)。因此，我们在个体患者中展示了大量的表型模式。当测试的血液样本有少量或没有CTCs变化的迹象时，我们可以认为手术没有影响细胞释放(表2)。如果标记物减少，如EGFR，我们可以假设肿瘤已经完全根除。

这项研究仍有许多问题有待解决。目前尚不清楚是否有兴趣在手术过程中进行医疗治疗，以消除那些播散细胞。这个问题很大程度上取决于CTC和转移的关系。因此，肿瘤细胞的潜在临床意义需要进一步研究，因为它们的存在可能会影响术前和术后的治疗。这个问题是我们正在调查的一个主题。

图5。PVA (RT-PCR)在每个患者中的表达(a)和显示PVA变化的箱线图(b)

同意

我们的研究通过了N°2010-A00586-33 N°CPP10.07.03在Nancy le 10-03-2014进行的伦理认可。发表本研究的书面知情同意以及任何附带的图像都得到了患者的同意。书面同意书的副本可由本刊编辑要求查阅。

资金

法国洛林癌症研究所。

作者的贡献

RM、xw、JM、JLM分别进行操作和数据分析;R M-SC-EB -MP-MR LB-JS负责临床管理;RM撰写了手稿;R M、GF JLM和G D负责研究的概念和设计;RM和G D对手稿进行了广泛的审阅和编辑。所有的作者都参与了手稿的修订，并批准了其最终版本的手稿。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

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