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摘要

持续的高风险人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌(CC)发展的必要条件。HPV的癌变是基于病毒E6和E7蛋白干扰细胞增殖控制的能力。盆腔淋巴结(PLN)的转移状态是术后辅助治疗决策的关键参数，因为它与CC复发有很强的相关性。为了补充亚临床淋巴结转移的组织病理学评估，我们评估了商用HPV E6 / E7 mRNA试剂盒的应用，以检测CC患者淋巴结和肿瘤中的病毒信使rna。

宫颈原发肿瘤45例，PLN 152例(每例3 ~ 4例)。采用PCR(聚合酶链反应)方法，使用通用引物PGMY和反向线印迹杂交(RLB)与37种感染肛门生殖道的HPV类型相对应的类型特异性寡核苷酸探针进行分型。在RNAlater (Invitrogen)中收集PNL，并使用MiniMag (Biomerieux)系统提取mRNA。采用等温实时PCR (NucliSENS EasyQ HPV, Biomerieux)检测HPV 16、18、31、33和45型对应的E6和E7 mrna。

42例患者肿瘤中检出HPV;鉴定出的病毒类型为HPV16 (n = 32)、HPV18 (n = 5)、HPV31 (n = 3)、HPV45 (n = 2)、HPV59 (n = 1)和HPV73 (n = 1)。由于mRNA检测系统不包括这些病毒类型，后2例未纳入本研究。同时排除2例HPV阴性肿瘤。组织学和病毒学结果之间存在高度相关性。72%的组织学阳性PLN为E6-E7 mRNA阳性;而93%(125/134)的PLN阴性患者E6-E7 mRNA检测也呈阴性。然而，有8%(9/134)的阴性PLN检测到病毒信使。

患者随访时间有限(4年)，除2例患者死亡(均为HPV 45阳性)外，研究中所有患者均无复发记录。

HPV在PLN中的存在可能表明转移，因为病毒不能产生病毒血症或侵入组织，只能通过癌细胞“运输”。HPV mRNA的存在表明病毒基因组转录，这一过程仅发生在CC转移细胞的淋巴结中，因为这些病毒只能在上皮起源细胞中复制。因此，在阴性盆腔淋巴结中这些mrna的发现指出了一个非常早期的转移，在分子水平上可以检测到，但在组织学诊断上无法观察到。

通常用于宫颈疾病管理的商业HPV E6/E7 mRNA检测试剂盒也可用于在没有高复杂性实验室的医院评估PLN活检。该测试可能是一种补充形态学观察的工具，特别是当PLN不表现出与入侵相容的特征时，从而优化监测和决策。

关键字

HPV, E6-E7mRNA，宫颈癌，亚临床转移，淋巴结，盆腔淋巴结切除术

介绍

流行病学和分子研究表明，人乳头瘤病毒(HPV)与肛门生殖道肿瘤前病变和肿瘤病变的发展有关。pv完全是物种和组织特异性的，因为它们只在上皮组织中复制;晚期病毒蛋白(衣壳)的复制和表达仅发生在具有一定程度分化的细胞中。pv不会杀死它们感染的细胞;而是与之共存，不穿透基底膜，不形成病毒血症[1,2]。

已知的病毒类型超过100种，根据DNA同源性进行分类。其中近一半是在肛门生殖道检测到的，它们的遗传变异与它们的致癌性有关。在分类学上对应的病毒类型A7(HPV 18、39、45、59和68)A9种类(HPV 16、31、33、35、52和58)包括大多数所谓的高的风险类型，即16型和18型占全世界所有前驱病变和鳞状浸润性癌症的60-75%，几乎没有区域差异。几乎所有的腺癌仅由hpv 16、18和45引起[3-5]。16型和18型的侵袭性更强，病变发展得更早，比其他致癌类型有更大的发展风险。

HPV致癌是基于某些高风险病毒蛋白干扰细胞增殖控制的能力。在严重的肿瘤前病变和癌症中，病毒DNA经常被整合到受感染细胞的基因组中。这包括破坏E2病毒基因，导致病毒癌蛋白E6和E7的过度表达，以及细胞基因组的不稳定。体外实验表明，高风险的HPV E6和E7癌蛋白分别与肿瘤抑制细胞蛋白p53和pRB(视网膜母细胞瘤蛋白)具有高亲和力结合，并随后降解它们。其他靶细胞也会受到E6和E7的影响。由于病毒癌蛋白的相互作用，有丝分裂过多，凋亡机制失活，导致持续的遗传不稳定，从而诱导恶性转化[6,7]。

目前存在几种方法策略，包括商业测试来检测病毒mrna[8]。它们大多针对高危的HPV E6和E7癌基因[9]。与DNA检测只提供感染和病毒类型的信息不同，E6和E7 mRNA的检测确定了宫颈癌中最常见的HPV基因型(16、18、31、33和45)，并且还指示了这些病毒的癌蛋白E6和E7的表达，这与恶性转化直接相关。因此，该检测对病毒致癌活性的阳性预测值高于DNA[8]。最近的几项研究表明，这些检查可能在临床上有用，因为它们在检测宫颈疾病方面具有更大的特异性[9,10]。

在宫颈、外阴和阴茎癌患者的组织学正常淋巴结中，使用PCR等高灵敏度技术检测HPV DNA，导致人们猜测它可能预示着组织学检查中忽视的早期转移或微转移[11-16]。淋巴结转移是术后辅助治疗决策的重要参数，因为它与复发有很强的相关性。根治性子宫切除术联合盆腔淋巴结切除术是Ib-IIa期宫颈癌广泛应用的治疗方法，生存率在80%以上[17-19]。尽管结果良好，但仍有20%的患者出现复发并最终死亡[20]。

阴性pln患者的复发风险较低，但其绝对数量占所有宫颈癌复发率的50%[18,19]。在pln阴性患者中，许多危险因素被提出并评估，如肿瘤大小、间质浸润、淋巴血管浸润、显微参数浸润等，它们的存在将决定辅助放疗(RT)，但不同研究的数据并不一致和统一[21,22]。

pln阴性患者的严格RT适应症尚未明确，因此确定可能受益于辅助治疗的风险群体非常重要。

淋巴结中HPV DNA的存在可能是转移的一个指标，因为病毒DNA被整合到癌细胞基因组中。然而，不同研究的结果一直存在争议。[13 - 16]。在我们之前的研究组中，我们注意到在无肿瘤的pln中存在HPV DNA并不一定意味着转移，但可能与主动免疫反应有关[14]。为了将病毒在组织学阴性PLN中的存在与早期转移联系起来，病毒应该被证明是真正活跃的，而不仅仅是一个乘客。HPV活性的一个信号是其信使rna (mrna)的检测，这表明病毒基因组转录。由于这些病毒只能在上皮细胞中表达，因此这种表达预计只会发生在转移性宫颈癌细胞中。

另一方面，诊断工具是必要的，以补充手术和形态学信息，以确定疾病的整体状态。

客观的

为了补充检测亚临床淋巴结转移的组织病理学评估，我们评估了一种商用试剂盒在宫颈癌手术患者原发肿瘤和淋巴结中检测病毒E6/E7 RNA信使的应用

患者、材料和方法

45名在阿根廷公立医院接受治疗的IB期宫颈癌患者(年龄19-67岁，平均40.5岁)纳入研究。只有以前没有接受过放疗的患者被纳入研究。所有患者都被要求在提供了每个医院伦理委员会批准的项目的基本信息后签署知情同意书。

为病理和病毒学研究收集样本

研究了45例原发性宫颈肿瘤活检和152例盆腔淋巴结(PNL)，平均每位患者3至4个PLN。为避免标本被污染或降解，术中依次切除如下:1)3-4个盆腔PLN，识别并与病理结果比较;2)宫颈肿瘤;每次更换手术刀和镊子。

从每个PLN和肿瘤中收集约0.5 cm的部分用于病毒学研究。为了存档，在可能的组织学检查的情况下，切除部分的印记在无菌玻璃载玻片(无RNAse)上进行，该载玻片固定并保存在病理学部。

将获得的PLN片段和原发肿瘤在无菌培养皿中切割和分离，并置于含有RNAlate (Invitrogen)的Eppendorf管中，以避免组织mRNA的降解。其余材料与往常一样固定用于病理研究(10%福尔马林缓冲)。在每个步骤中，我们都非常小心地避免在肿瘤和pln之间造成污染，每次都要更换镊子和手术刀。

如果在手术标本中看不到肿瘤或只有先前提取的锥体材料可用，则从固定和石蜡包埋的材料中切出5个5µm的连续切片。

从肿瘤中提取病毒DNA

每个新鲜肿瘤的碎片根据组织大小，在大约100-500ul消化缓冲液(10 mM Tris (pH 8.3) 0.45% Tween-20, 0.45% Igepal CA-630中添加500 mg/ml蛋白酶K)中重悬，然后在56°C下孵育3小时，直到完全消化。该产物作为后续PCR分析的模板。

当只有固定和石蜡包埋材料时，将组织切片去蜡化、水化并用补充蛋白酶K的缓冲液消化。按照制造商的说明，用色谱柱(Qiagen)提取和纯化核酸。

一旦获得DNA，将其悬浮在TE缓冲液中，并在-20°C下保存直至分析。

淋巴结病毒RNA提取纯化

每个PLN预先放置在2ml含有1ml裂解缓冲液(NucliSens lysisbuffer, BioMerieux)的微管中;然后使用均质机Pro200 (Pro Scientific)设备均质15-30秒，在37°C干燥块中孵育30分钟。

净化:将100 ul裂解液稀释于含有900 ul裂解缓冲液(NucliSens lysisbuffer, BioMerieux)的1.5 ml微管中。取100 ul稀释液，并在900 ul裂解缓冲液(NucliSens lysisbuffer, BioMerieux)中进一步稀释。该稀释液使用NucliSens MiniMag (Biomerieux)系统纯化mRNA。经过多次连续的步骤，包括将材料粘接到磁性颗粒上，并用不同的缓冲溶液洗涤，最后进行洗脱。将纯化的mrna转移到新的1.5 ml管中，在-70°C保存直至分析。

HPV检测和基因分型

对于HPV检测，使用通用共识引物PGMY09, 11进行直接PCR检测，该引物扩增了嗜粘性HPV基因组L1区450bp的片段[23]。

PGMY09, 11 PCR在终体积为50微升的培养基上进行，其中含有1X缓冲液，3 mM MgCl2, 80 nM PGMY09引物，80 nM生物PGMY11引物，20nM混合生物HLA-DQ引物，每种dNTP各200 uM和0.025 U/ml Taq DNA聚合酶(Fermentas)。使用以下程序进行扩增:在95°C下初始变性3分钟，随后45个循环:95°C, 30秒/ 55°C, 90秒/ 72°C, 120秒，最后在72°C下延长5分钟。随后通过逆行杂交(RLB) (CHUV)在带负电荷的尼龙膜上使用特异性生物素化寡聚探针进行分型[24]。杂交体检测采用ECL试剂盒(Amersham)进行化学发光，并遵循制造商的规范。该系统的优势在于它可以识别37种HPV类型，并在一次检测中分析40个样本。该技术经世卫组织HPV LabNet验证。

淋巴结中E6、E7癌基因信使的检测

采用核酸序列扩增(NASBA)和实时检测(RealTime-PCR)相结合的反应检测mRNA，使用分子信标探针(NucliSENS EasyQ HPV, Biomerieux)，可以检测宫颈癌中最常见的HPV基因型(HPV: 16、18、31、33和45)的E6和E7癌蛋白mRNA。根据制造商的适应症遵循该方案，采用活检方法，因为该试剂盒准备用于脱落的宫颈细胞(如先前在淋巴结病毒RNA的收集纯化中所述)。

术后随访采用标准对照方案，对纳入研究的患者进行为期3年的前瞻性随访。所有患者均接受新辅助治疗。

结果

组织学结果

组织学上发现腺癌6例(均为IB1期)，鳞状细胞癌39例(Ia期1例，IB1期27例，IB2期8例，IIA期1例，IIIB期2例)。

HPV在肿瘤中的检测和分型

PCR RLB检测45例42例肿瘤的HPV;鉴定出的病毒类型分别为HPV16 (n = 32)、HPV18 (n = 5)、HPV31 (n = 3)、HPV45 (n = 2)、HPV59 (n = 1)和HPV73 (n = 1)。后2例因mRNA检测系统未纳入本研究。同时排除2例HPV阴性肿瘤患者。

表1显示了通过PCR和RLB检测在肿瘤中发现的病毒类型，通过mRNA E6-E7检测在pln中发现的病毒类型。5例混合感染中，HPV 18 + 16 2例，HPV 16 + 18 + 31 1例，HPV 33 + 16 1例，但在各自的pln中均未发现。然而，在100%的病例中，在PLN中发现的类型与肿瘤中检测到的类型相同。

表1:通过PCR和RLB检测肿瘤中的病毒类型，通过E6-E7 mRNA检测pln中的病毒类型

人乳头状瘤病毒类型	积极的肿瘤通过 PCR-RLB n =41	PNLs呈E6-E7 mRNA阳性
HPV16	32 (76%)	24
HPV18	5 (12%)	-
HPV31	3 (7%)	2
HPV33	2 (4 7%)	-
HPV45	2 (4 7%)	6
HPV59	1 (2,3%) *	-
HPV73	1 (2,3%) *	-

PCR-RLB在肿瘤中，HPV基因分型是通过使用37种病毒类型特异性寡聚探针进行pcr -反向杂交进行的。

E6 / E7 mRNA在淋巴结(PLN)中，检测五种最常见的宫颈癌高危型HPV (HPV 16、18、31、33和45)的病毒E6/E7 mrna。

5例混合感染中，HPV 18 + 16 2例，HPV 16 + 18 + 31 1例，HPV 33 + 16 1例，但在各自的pln中均未发现。

组织学和病毒学结果之间存在高度相关性(表2)。72%的组织学阳性PLN为E6-E7 mRNA阳性;而93%(125/134)的PLN阴性患者E6-E7 mRNA检测也呈阴性。然而，有8%(9/134)的阴性PLN检测到病毒信使。

表2:组织学与E6 / E7 mRNA结果的相关性

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组织学	E6/E7 mRNA (+)	E6/E7 mRNA (-)
PNL阳性(nº18)	13 (72%)	5
PNL阴性(nº134)	9	125例(93%)
总数(nº152)	22	130

组织学阳性PLN:伴有淋巴结转移的淋巴结。

组织学阴性的PLN:无转移淋巴结

E6 / E7 mRNA在淋巴结(PLN)中，检测五种最常见的宫颈癌高危型HPV (HPV 16、18、31、33和45)的病毒E6/E7 mrna。

术后监测:在前瞻性4年评估期间，2例患者死亡，其中1例经组织学和E6-E7 mRNA检测为pln阳性，另1例经两种方法检测均为pln阴性;在这两个病例中，原发肿瘤中发现的病毒类型都是HPV 45。在其余的患者中，到目前为止没有复发，即使是在组织学和/或信使检测呈PLN阳性的病例中。

讨论

由于高达15%的CC和PNL阴性患者会复发，因此提高对肿瘤细胞隐匿转移扩散的检测至关重要。HPV在PLN中的存在可能表明转移;由于病毒不能产生病毒血症或侵入组织，它只能通过癌细胞“运输”。然而，基于DNA病毒检测的测试只能提供有关感染存在和最终病毒类型的信息，但如果应用于PLN评估，则无法证明其活性和复制性。此外，病毒DNA在PLN中的存在并不一定意味着转移，因为研究表明它可能是免疫反应的结果。在阴性PLN中，在生发中心淋巴细胞的细胞核和/或细胞质中或内皮毛细血管细胞和巨噬细胞的皮质区发现HPV DNA[14]。

病毒mRNA的存在表明病毒基因组的转录;在PLN中，它只能发生在转移性宫颈癌细胞中，因为这些病毒，如前所述，只能在上皮细胞中复制。大多数已发表的研究涉及HPV mRNA E6-E7的检测与宫颈组织疾病和管理有关

有几篇已发表的论文提到在转移淋巴结中检测HPV 16 E6 / E7转录本[25-27]，他们在固定样本中应用了RT-PCR技术。所有研究都表明，检测病毒mrna是比病毒DNA更敏感的转移检测指标[27]。d rst M和col.发现hpv阴性PNL患者的无复发生存期明显更长。在常规组织病理学检查无肿瘤的宫颈癌患者中，hpv - mrna阳性的PLN具有独立于肿瘤大小的预后价值;他们得出结论，直径大于20mm的肿瘤可能会受益于使用HPV-mRNA作为分子标记的进一步风险分层。

虽然在癌症中有RNA检测的历史[28,29]，但这种类型的测试存在方法上的困难，因为它通常需要使用新鲜的生物材料，无RNase试剂，并在保护RNA完整性和防止细胞RNase污染以及样品之间的条件下工作。

用于检测HPV E6-E7 mRNA的诊断商业试剂盒的可用性在一定程度上简化了病理学实验室的实验条件。本研究中使用的检测方法可以检测全球宫颈癌中最常见的5种HPV高危类型(HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33和HPV 45)的病毒癌蛋白E6-E7对应的RNA转录本。这比DNA测试对病毒致癌活性有更高的阳性预测值。几项研究表明，这些检测可能在临床上有用，因为它们对检测宫颈疾病具有更高的特异性[30-32]。

在我们的研究中，HPV 16是肿瘤中最常见的病毒类型(76%)，HPV 18(12%)是第二流行的病毒类型。其他病毒类型如HPV 59和HPV 71也被检测到，这些病例必须被排除在研究之外，因为它们不存在于E6- E7 mRNA检测到的组中。组织学观察结果与病毒学结果之间存在高度相关性，因为在93%的组织学阴性pln中未检测到病毒信使;然而，在9例pln中，该方法发现组织学检查中未注意到的亚临床转移的证据。值得注意的是，这些病例对应的活检块在解剖病理学上与往常一样被修剪，以确认组织标本内没有隐藏的转移细胞。

在组织学上呈阳性的PLN病例中，72%的病例被确诊，如果考虑到临床样品中RNA的不稳定性及其在处理过程中可能发生的降解，则灵敏度是可以接受的。另一方面，进行mRNA分析的活检可能不能代表整个淋巴结，因为肿瘤细胞的分布可能不均匀。本研究中使用的检测方法是为宫颈脱落细胞设计的，因此必须验证其用于活检材料(数据未显示)，这需要进一步操作材料，从而导致降解的可能性。

d rst M等[27]研究表明，组织学阴性淋巴结患者前哨PNL中存在HPV E6-E7 mRNA与5年随访无复发生存率降低有关。在我们的研究中，患者的随访时间有限(4年)，除2例死亡外，在研究期间，所有入组患者均无复发记录。在一项超过5000名患者的队列研究中提到，淋巴结切除术越大，当pln为阴性时，生存时间越长;因此，淋巴结切除术可能具有治疗价值[17]。在我们的研究中，在早期pln阳性(组织学或mRNA检测)的病例中，切除肿瘤和淋巴结可能已经切除了恶性细胞。另一方面，也应该注意到所有患者都接受了新辅助治疗。长期随访可以证实这一点。

为宫颈病理设计的E6-E7 mRNA检测商用试剂盒也可用于评估PLN活检;方法简单，可在低复杂度的医院实验室进行。HPV E6-E7 mRNA的检测增加了一种诊断工具，可用于补充组织学发现，特别是当pln没有表现出宏观和微观的侵袭迹象时，从而优化监测和决策。

致谢

我们感谢Silvia Nuñez和Joaquin González的技术支持。

给予的支持

本研究得到了阿根廷国家科技部国家机构Promoción Científica y Tecnológica (PICT1259/2011)的支持。

利益冲突

所有作者声明他们没有与本文所考虑的主题相关的财务或其他利益。

伦理批准

本项目由各医院参与伦理委员会批准。

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