编辑信息
主编
Yukio Yoneda
金泽大学
文章类型
研究文章
出版的历史
收稿日期:2018年10月19日
接受日期:2018年10月29日
发布日期:2018年10月31日
版权
©2018张p .这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放获取文章，在注明原作者和来源的情况下，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制。
引用
张鹏，孙艳，薛华，王鑫，连科(2018)毛细管电泳-化学发光法测定人尿中萘普生。全球药物治疗3:DOI: 10.15761/GDT.1000159
河北省总医院生殖遗传家族科，石家庄市
河北省总医院生殖遗传家族科，石家庄市
石家庄医学院，石家庄050000
邯郸市第一医院，邯郸056005
河北医科大学公共卫生学院，石家庄050017
DOI: 10.15761 / GDT.1000159
建立了毛细管电泳-化学发光(CL)联用检测萘普生的方法3.铁(CN)6在碱性溶液中。在30 mmol L的浓度下进行分离1pH 10.0硼酸盐缓冲液。在10 ~ 2000 μ L范围内，标度曲线呈线性−1检测限和定量限均为2.7 μ L−18.8 μg L−1,分别。该方法用于人尿样品中萘普生的检测，结果令人满意
毛细管电泳;化学发光;鲁米诺;K3.铁(CN)6];甲氧萘丙酸
萘普生(6-甲氧基-α-甲基-2-萘乙酸)是一种非甾体抗炎药(NSAID)，在许多疾病的治疗中被广泛用于中度疼痛缓解[1,2]。因此，非甾体抗炎药会导致胃溃疡，并在受伤或手术后促进出血。此外，它们还伴有其他严重的副作用，如肾衰竭，以及一些轻微的副作用，如恶心呕吐、腹泻、便秘、食欲下降、皮疹、头晕、头痛和嗜睡[3-5]。此外，它们还会与其他药物相互作用;特别是，它们可降低利尿剂的作用，并可拮抗高血压[6]。建立一种简便、灵敏的测定药品和生物液体中萘普生的方法，对毒理学研究具有重要意义。
不同的分析技术，包括流动注射化学发光法(FL-CL)[7]、差分脉冲伏安法(DPV)[8]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[9]、高效液相色谱法(HPLC)等多种检测方法被用于萘普生检测[10,11]。但在分析萘普生时，气相色谱-质谱法往往需要化学衍生化来提高检测灵敏度，HPLC法系统操作维护复杂，样品消耗大，试剂价格昂贵。FL-CL法和DPV法分离能力差，不能用于复杂生物样品中萘普生的测定。
毛细管电泳(CE)具有分离效率高、运行时间短、仪器简单、操作成本低、样品体积小等优点。它已被证明是生物样品分析中最强大的技术之一[12-14]。化学发光(CL)检测因其高灵敏度、低成本、低功耗和与微加工技术的高兼容性而成为一种有吸引力的CE检测方案[15,16]。毛细管电泳-化学发光检测(CE-CL)用于萘普生的分离和定量研究报道较少。
本研究以鲁米诺与铁氰化钾(K)的反应为基础，建立了用CE-CL法测定萘普生的方法3.铁(CN)6])在碱性溶液中。对影响检测灵敏度的一系列参数进行了优化，并对方法的验证进行了系统的研究。在线性度、回收率、精密度和灵敏度方面取得了令人满意的结果。该方法可用于尿样中萘普生的测定。
萘普生购自中国药品与生物材料鉴定研究所(中国北京)。鲁米诺购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。分析试剂等级K3.铁(CN)6]、硼酸钠和氢氧化钠购于天津化学试剂总厂(天津，中国)。硼酸盐缓冲液离子强度计算使用HP 3D CE缓冲计算器1.00版(Hewlett-Packard corp, USA)进行。载体电解质和标准品的水溶液由milliq净水系统(Millipore, Bedford, MA, USA)的18.2 MΩ*cm水制备，使用前通过0.22 μm膜过滤。
CE-CL系统由高压电源(北京彩路科学仪器公司，中国北京)和实验室自制的CL检测器组成(系统原理图如图1)。简单地说，在分离毛细管(50cm×75 mm, Yongnian光纤，河北，中国)的一端去除长度为1cm的聚酰亚胺涂层。将裸端插入530 mm i.d反应毛细管(永年光纤)，深度1.5cm，通过燃烧聚酰亚胺涂层在反应毛细管上形成1 cm的检测窗口。采用四向有机玻璃连接固定分离毛细管、反应毛细管和两根CL溶液输送毛细管。为了连接最密集的CL信号，检测窗口位于光子计数光电倍增管(PMT)的正前方。整个CL检测系统被封装在一个黑盒子里。
图1所示。CL系统原理图:泵;2.鲁米诺的解决方案;3.K3.铁(CN)6)解决方案;4.分离毛细管;5.黑盒;6.PMT;7.反应毛细管;8. grounding electrode; 9. waste vial.
尿液样本采集自无药物的健康志愿者。将萘普生标准水溶液加入2.0mL尿样中，4000rpm离心10 min，将上清液转移至2ml小瓶中进行CE-CL分析。
所有新生毛细血管用0.1mol L依次冲洗1NaOH, 0.1mol L1HCl和水作用20min，然后用运行缓冲液平衡30 min。每次运行后，用运行缓冲液处理分离毛细管10 min。在16 kV电压下电动注射5 s，施加16 kV分离电压。运行缓冲液(30mmol L1采用硼酸盐缓冲液(pH10.0)。试剂溶液为0.2 mol L1NaOH含有5×10-4 mol L1发光氨和0.2 mol L1NaOH含有4×10-4 mol L1K3.铁(CN)6]以10µL min的速度进料−1由一个泵(LongerPump corp.，保定，中国)(图1)。
鲁米诺与K的CL反应3.铁(CN)6在服用萘普生的情况下
发现萘普生能增强鲁米诺与K的CL反应3.铁(CN)6](图2)。为了优化反应条件，将载流子流量、流速、鲁米诺浓度、K3.铁(CN)6]的浓度。在不同的实验中，取100.0µg L1在CE-CL系统中注射萘普生溶液，记录萘普生的CL强度(峰面积)。
图2。FA萘普生标准溶液在100.0 μ L浓度下的电泳图−1。
因为发光氨和K反应3.铁(CN)6在碱性条件下生产CL，初步考察了溶液中所含碱性对CL排放的影响。4×10的CL排放强度－4摩尔L1K3.铁(CN)6), 5×10－4摩尔L1在NaOH、NaHCO存在下的发光氨体系3., Na2有限公司3.在相同的浓度检测。结果表明，含NaOH的碱性介质中CL释放最强，因此选择NaOH溶液作为反应介质。进一步研究了NaOH浓度在0.1 ~ 0.5 mol L范围内变化对萘普生测定灵敏度的影响1。结果表明，随着NaOH浓度的增加，CL强度逐渐增大，直到0.2 M时达到最大CL信号;NaOH浓度进一步升高导致CL信号减弱。基于这些结果，NaOH浓度为0.2 mol L1被选作进一步的研究。
当流速为10µL min时，CL反应最强−1CL溶液。高流速将更多CL试剂输送到反应毛细管，从而促进发光反应。但它增加了不希望的背景，导致高基线强度，稀释了样本，因此降低了萘普生的CL信号。
保持K3.铁(CN)6]集中在4×10－4摩尔L10.2 mol L的NaOH浓度1，在1×10范围内考察了鲁米诺浓度对CL强度的影响－48×10－4摩尔L1(如图3所示)。从图中可以看出，CL强度随着鲁米诺浓度的增加而增加，在5×10处CL强度达到最大值－4摩尔L1，当浓度大于5×10时－4摩尔L1，基线变得不稳定，信噪比下降。因此，一个5×10－4摩尔L1选择鲁米诺溶液为最佳溶液。
图3。发光氨浓度与CL反应的关系。
从人类尿液样本(a)中获得，样品中添加了50.0 μg L的萘普生−1(B)。
K的作用3.铁(CN)6]浓度对CL信号的影响也进行了研究，保持鲁米诺浓度为5×10－4摩尔L10.2 mol L的NaOH浓度1。结果表明，当K3.铁(CN)6不同于1×10－46×10－4摩尔L1， CL信号略有增加;在4×10以上，CL强度曲线趋于平缓－4摩尔L1K3.铁(CN)6](图4)。因此，一个4×10－4摩尔L1K3.铁(CN)6]进行后续实验。
图4。K之间的关系3.铁(CN)6]浓度和CL反应。
背景电解质浓度会影响焦耳加热、电渗透流量、离子强度和毛细管内产生的电流，对分离性能有显著影响。硼酸盐缓冲液浓度在10 ~ 50m mol L范围内的影响1在pH 10.0下进行了研究。结果表明，硼酸盐浓度为30 mmol L时，峰高最大1，迁移时间随硼酸盐浓度的增加而延长。因此，硼酸盐浓度选择为30 mmol L1用于后续研究。
缓冲液的pH值会改变萘普生及其干扰物的电荷和迁移率，是影响CE分离的重要参数之一。因此，通过实验研究硼酸盐缓冲液的pH在7.0 ~ 11.0范围内。结果表明，在7.0 ~ 10.0 mmol L范围内，随着pH的增加，迁移时间和峰高逐渐增加1。当pH值大于10.0时，峰值高度降低，迁移时间延长，基线噪声增大。因此，选择pH 10.0对缓冲液参数进行进一步优化。
在10 ~ 20 kV的电压范围内进行电泳，考察了分离电压对萘普生迁移时间和分离度的影响。随着分离电压的升高，迁移时间缩短，峰高增加，但分辨率降低。考虑到分离电压选用16kv进行实验。
通过评价回归线考察其线性关系，并由相关系数生成。这些曲线是通过在人尿中加入不同浓度的萘普生来制备的。实验结果表明，在最佳条件下，萘普生浓度在10 ~ 2000 μ L范围内，峰面积与萘普生浓度呈线性关系−1。相关系数为0.9994。尿液的检出限(LOD，基于信噪比为3,S/N = 3)和定量限(LOQ, S/N = 10)均为2.7 μ L−18.8 μg L−1,分别。
按照上述程序，所提出的方法被应用于人尿中萘普生的分析。采用尿中不同加标浓度(20.0、50.0、100.0 μ L−1)检验方法的回收率和精密度(表1)。低浓度时尿中萘普生的日内精密度(%，RSD)为3.8%，中、高浓度时均≤2.8%。不同浓度的平均加样回收率为96.0% ~ 103.4%。在3天(n=6)的时间内，在相同的三个浓度水平上测定日间回收率和精密度。低浓度水平下的日间精密度(%，RSD)为5.5%，中、高浓度水平下≤3.8%。测定准确度为94.0% ~ 97.8%。结果表明，该方法在低浓度条件下也有较好的精密度。从无萘普生和加药的人类尿液样品中获得的典型电图如图5所示。
图5。以50.0 μg L加入萘普生的人尿样(a)和尿样的电泳图−1(B)。
表1。人尿中萘普生的测定。
添加(μg L)−1） |
发现(μg L)−1） |
恢复(%) |
相对标准偏差(%) |
|
盘中 （n= 6) |
20.0 |
19.2±0.7 |
96.0 |
3.8 |
50.0 |
48.3±1.2 |
96.6 |
2.5 |
|
100.0 |
103.4±2.9 |
103.4 |
2.8 |
|
Inter-day （n= 6) |
20.0 |
18.8±1.0 |
94.0 |
5.5 |
50.0 |
48.9±1.7 |
97.8 |
3.4 |
|
100.0 |
95.3±3.6 |
95.3 |
3.8 |
本文建立了一种测定萘普生的CE-CL检测法。CE技术的高分离效率和CL系统对被分析物的高选择性使该方法能够在实际的复杂基质中测定萘普生。方法评价表明，测定人尿中萘普生的线性、精密度和准确度良好。所开发的CE-CL技术成本较低，简单，快速，不需要复杂的样品预处理，产生的有机废物最少。
感谢河北省自然科学基金(no . H2018206122)的资助。
Yukio Yoneda
金泽大学
研究文章
收稿日期:2018年10月19日
接受日期:2018年10月29日
发布日期:2018年10月31日
©2018张p .这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放获取文章，在注明原作者和来源的情况下，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制。
张鹏，孙艳，薛华，王鑫，连科(2018)毛细管电泳-化学发光法测定人尿中萘普生。全球药物治疗3:DOI: 10.15761/GDT.1000159
图1所示。CL系统原理图:泵;2.鲁米诺的解决方案;3.K3.铁(CN)6)解决方案;4.分离毛细管;5.黑盒;6.PMT;7.反应毛细管;8. grounding electrode; 9. waste vial.
图2。FA萘普生标准溶液在100.0 μ L浓度下的电泳图−1。
图3。发光氨浓度与CL反应的关系。
图4。K之间的关系3.铁(CN)6]浓度和CL反应。
图5。以50.0 μg L加入萘普生的人尿样(a)和尿样的电泳图−1(B)。
表1。人尿中萘普生的测定。
添加(μg L)−1） |
发现(μg L)−1） |
恢复(%) |
相对标准偏差(%) |
|
盘中 （n= 6) |
20.0 |
19.2±0.7 |
96.0 |
3.8 |
50.0 |
48.3±1.2 |
96.6 |
2.5 |
|
100.0 |
103.4±2.9 |
103.4 |
2.8 |
|
Inter-day （n= 6) |
20.0 |
18.8±1.0 |
94.0 |
5.5 |
50.0 |
48.9±1.7 |
97.8 |
3.4 |
|
100.0 |
95.3±3.6 |
95.3 |
3.8 |
