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摘要

神经嵴细胞产生外周神经系统，颅面组织和成人组织特异性干细胞，这有助于组织稳态和再生。成人组织特异性干细胞的误解导致各种疾病。据报道，肌成纤维细胞引起纤维化的衍生自组织特异性干细胞，例如间充质干细胞（MSC）。在这项研究中，我们使用新的方案报告从衍生自饲养的人诱导的多能干多能干细胞（HIPSC）的神经嵴状细胞中肌纤维细胞样细胞的产生。HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞对转化生长因子（TGF） - β刺激敏感，类似于人原发性肾成纤维细胞。TGF-β刺激在HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞中增加了胶原型1A1的表达，并且通过用TGF-β抑制剂治疗抑制这种效果。这些结果表明HIPSC衍生的肌纤维细胞样电池可以是有用的工具体外antifibrotic药物筛选。

介绍

α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性的肌成纤维细胞对组织再生很重要。组织驻留成纤维细胞和间充质干细胞(MSCs)分化成肌成纤维细胞修复组织[1]。然而，在病理条件下也可以观察到肌成纤维细胞，如纤维化[2]。α sma阳性的肌成纤维细胞是纤维化的一个主要原因，它们的水平随着纤维化疾病的发展[3]而增加。肌成纤维细胞由转化生长因子(TGF)-β激活，并以[4]的高速率产生细胞外基质(ECM)蛋白，包括1a1型胶原(Col1a1)。

组织居民成纤维细胞的起源在组织中不同。据报道，肺居民成纤维细胞衍生自造血干细胞，而肝星状细胞（肝脏常规成纤维细胞）衍生自MSC [5]。该研究比较了肾血液细胞（NCCs）[6]和肌纤维细胞样细胞的衍生自人诱导多能干细胞（HIPSC）的神经顶部（NCLC）（NCLC）[7]]。

肾纤维化患者的数量正在增加，预计这种情况将成为一个主要的公共卫生负担，因为没有药物治疗，患者需要透析[8]。一个体外模仿人类的药物筛选方法在活的有机体内必须发展表型，以确定抗纤维化药物。

肾脏居民成纤维细胞是肾纤维化肌纤维素细胞的主要来源[9]。因此，人的原发性成纤维细胞被认为是可用于抗纤维化药物筛选[10]。然而，很少使用这些细胞，因为它们难以获得足够的数字以用于高通量药物筛选而不显示显着的变化。

多能干细胞（PSC）可用于解决这个问题。可以使用PSCS产生足够数量的难以从人类（例如神经元和心肌细胞）的细胞[11]产生。肌纤维细胞样细胞可以从PSC衍生的NCLC [12]获得。NCCS分化成在外周神经系统，颅面组织和成人组织特异性干细胞[13]中发现的各种类型的细胞[13]，也是在肾发育期间的肾成纤维细胞。响应于病理刺激，例如缺氧和肾毒剂，这些成纤维细胞转化为肌纤维细胞，导致肾纤维化[14]。

在这里，我们报道了从hiPSCs生成肌成纤维细胞体外antifibrotic药物筛选。我们修改了最近报道的区分NCLCs和无喂食hiPSCs (Ff-hiPSCs)[15]的协议。Ff-hiPSCs易于培养和扩增[16]，从而产生足够数量的细胞用于筛选。然后我们直接将NCLCs分化成肌成纤维细胞样细胞[12]。hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞表达αSMA、FSP-1 (S100A4)和5’外切核苷酶(CD73)，这些在肌成纤维细胞中表达在活的有机体内商品化的人原发性肾成纤维细胞[17-19]。此外，TGF-β刺激增加了这些细胞中Col1a1的表达，而TGF-β/Smad抑制剂SB431542以剂量依赖的方式抑制了这种作用。总之，这些结果表明，hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞在抗纤维化药物筛选中是有用的。

材料和方法

hiPSCs文化:本研究使用201B7 hiPSCs。在含有5 ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(FGF) 2 (ReproCELL)的ReproStem培养基(ReproCELL)中维持小鼠胎儿成纤维细胞的- hipscs。Ff-hiPSCs在iMatrix-551 (Nippi)涂层的细胞培养板上使用StemFit AK03N (Ajinomoto)，如前所述[16]。

NCLC的分化：衍生自201B7的NCLC在-HIPSCS中，在低附着培养皿中与含有10ng / ml FGF和10ng / ml表皮生长因子（EGF）的KBM（Kohjin Bio）的低附着培养皿培养。培养基每2天交换。十四天后，将细胞转移到纤连蛋白（康宁）涂覆的培养皿中。在培养14天后，使用Moflo Astrios仪器（Beckman Coulter）收集CD271（P75NGFR）/ CD57（HNK1）双阳性细胞，然后在肌纤维细胞分化培养基中培养。201B7 FF-HIPSCS在涂有IMATrix-551的6孔板中培养。总共10,000个FF-HIPSCS在STEMFIT AK03N中亚被递过并培养4天。细胞在补充有10μmSB431542（Sigma）和1μMChir99021（Wako）的KBM中分化。培养媒体每天都交换。在7天后收获细胞并在肌纤维细胞分化介质中培养。

肌成纤维细胞样细胞的分化:hipsc来源的NCLCs在含10%胎牛血清(GIBCO)的αMEM (Invitrogen)中培养至少3周。每7天交换一次文化媒体。当细胞融合90%时传代。

荧光激活细胞分选（FACS）：FACS是根据制造商协议的使用MOFLO Astrios工具进行的。含有同种型对照和不含抗体标记的细胞的FACS分析产生了类似的结果;因此，后者用作对照群体。使用Tryple选择CTS溶液（寿命技术）收获细胞，在FACS缓冲液中冲洗（含有1％牛血清白蛋白，0.5×B27,5mM EDTA和100​​u / mL青霉素 - 链霉素的KBM），与含有人的FACS缓冲液温育Trustain Fcx Fc受体阻塞溶液（1:20; Biolegend）5分钟，然后用Alexa氟缀合的一抗粘合1小时。使用以下一抗抗体：小鼠单克隆抗CD271-FITC（1:20; Biolegend），小鼠单克隆抗CD271-PE（1:20; Biolegend），小鼠单克隆抗CD57-APC（1:20; BioLegend），小鼠单克隆抗CD73-PE（1:20; BD Pharmingen），大鼠单克隆抗CD44-PE（1:20; Biolegend）。使用以下主要同种型对照抗体：FITC-共轭小鼠IgG1（1:20; Biolegend），PE缀合的小鼠IgG1（1:20; Biolegend），APC-缀合的小鼠IgM（1:20; Biolegend）和PE- 缀合的大鼠IgG2B（1:20; Biolegend）。使用FlowJo V10（Flowjo，LCC）分析FACS数据。

实时PCR：根据制造商说明，使用CellAmp™RT-PCR直接RNA准备试剂盒(Takara)从细胞中纯化总RNA。αSMA和Col1a1的表达与GAPDH的表达归一化。底漆是从Takara购买的。根据生产商说明书和7500 Real-time PCR系统(Applied Biosystems)，使用一步SYBR®PrimeScript™PLUS RT-PCR试剂盒(Takara)，在25µl的最终体积中进行实时PCR。每个PCR包含40个循环，退火温度为60℃。

免疫细胞化学:细胞用4%多聚甲醛灌注固定30分钟，用磷酸盐缓冲盐水冲洗3次，在TNB (Tris-NaCl阻断)溶液中孵育20分钟(载体实验室)，用一抗标记1小时，然后用Alexa荧光标记的二抗(1:250;室温下静置1小时。使用小鼠单克隆抗-αSMA (1:200;和兔单克隆抗s100a4 (1:200;Abcam)。

统计分析：所有量化数据均以均数±标准差表示。使用未配对学生t检验比较两个平均值。P <0.05为差异有统计学意义。

结果

- hipsc -derived肌成纤维细胞样细胞具有与人原发性肾成纤维细胞相同的特征:肾成纤维细胞/肌成纤维细胞源自NCCS [14]，并且已经开发了方案以产生来自HIPSC的肌纤维细胞样细胞[12]。这些细胞可用于抗纤维化药物筛选。然而，尚不清楚髋关节衍生的肌纤维细胞样细胞是否表达与人原发性肾成纤维细胞相同的标记。

人原发性肾成纤维细胞在市场上可以买到。然而，对它们的数据表进行比较发现，不同产品之间的标记物表达模式不同(表1)。CD73和FSP-1是公认的成纤维细胞特异性标记物，αSMA在人类原发性肾成纤维细胞中表达[4,17-20]。我们研究了hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞是否表达这三种标记物。

表格1。商业可用的人原发性肾成纤维细胞标记物的表达

	αSMA	CD73.	FSP-1	vwf.	KRT18
DV生物学，PB-PU001	+
AvantiCell kf - hn - 051	+	+	+
细胞生物学，H-6016	-			-	-

肌成纤维细胞样细胞由经荧光激活细胞分选(FACS)处理的NCLCs分化而来(图1A)。在本协议中，基于馈线的hiPSCs (Of-hiPSCs;201B7)，悬浮培养。14天后，在贴壁条件下再培养14天(图1B)，然后分选CD271/CD57双阳性NCLCs。CD271/CD57双阳性细胞百分比较低(7.01±0.86%，n=3)(图1C)。NCLCs在含10%胎牛血清(FBS)的αMEM中培养至少3周，诱导其分化为肌成纤维细胞样细胞(图1D)。几乎100%的of - hipsc来源的肌成纤维细胞表达CD73(99.11±0.45%，n=3，图1E)， αSMA和FSP-1(100%， 148/148细胞双阳性，图1E)。他们还表达了公认的成纤维细胞标记物CD44和HSP47(数据未显示)。因此，of - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞表达与人原发性肾成纤维细胞相同的标记物。

图1所示。-hipscs分化为肌纤维细胞。一个,肌纤维细胞分化的方案。B，非附着的神经球（第1天和第14天）和附着的神经球（第28天）的形态，从而产生NCLC。比例尺，500毫米。C，CD271/CD57双阳性NCLCs的定量分析值代表平均值±SD (n=3，生物三重复)。D，肌成纤维细胞的形态(第35天和第49天)。比例尺，500毫米。E,Myofibroblast标记分析。流式细胞术检测cd73阳性细胞，免疫染色检测aSMA-和fsp -1阳性细胞。比例尺，100毫米。检测aSMA和FSP-1的阳性细胞百分率(n=148)。值代表平均值±SD (n=3，生物三重复)。

我们接下来研究TGF-β刺激是否会增加这些细胞中纤维化基因的表达，如Col1a1。据报道，胎牛血清含有多种生长因子，包括TGF-β。为了排除培养基中TGF-β的影响，在TGF-β刺激前，在无胎牛血清的情况下培养of - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞3天(图2A)。饥饿培养和TGF-β刺激均未引起形态学改变(图2B, C)。在TGF-β刺激下Col1a1表达明显增加，而αSMA表达增加，但不明显(图2D)。Col1a1表达两个很多(很多。12 - 0509和。12 - 1109)商用人类原发性肾成纤维细胞也显著增加,以应对TGF -β刺激,当观察到Of-hiPSC-derived myofibroblast-like细胞(图2 e, F)。然而,TGF -β的影响刺激αSMA表达这两个之间的不同。在TGF-β刺激下，12-0509试剂盒中αSMA的表达轻微或显著增加，但在12-1109试剂盒中没有变化(图2E, F)。这些数据表明，hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞可以产生纤维化蛋白Col1a1，类似于人原发性肾成纤维细胞。

图2。TGF-b刺激增加了of - hipsc来源的肌成纤维细胞和人原发性肾成纤维细胞中Col1a1基因的表达。一个,TGF-B刺激的方案。B，肌成纤维细胞在含10% fbs培养基或无fbs饥饿培养基中培养3天。比例尺，200毫米。C，TGF-b刺激肌成纤维细胞48小时的形态。比例尺，200毫米。D-F,Col1a1和aSMA基因在hipsc来源的肌成纤维细胞(D)和人原发性肾成纤维细胞(Lot. 12-0509, E;细胞在饥饿培养基中培养3天，然后用TGF-b刺激。TGF-b刺激后6、24和48小时测量表达。值代表平均值±SD。* P <0.05和** P <0.01与非刺激细胞（n = 3，生物三份）。

Ff-hiPSCs分化肌成纤维细胞样细胞方案的建立:肌成纤维细胞样细胞与人原发性肾成纤维细胞具有相似的纤维化相关表型，通过NCLCs从of - hipscs分化而来。然而，NCLC的分化效率非常低(图1C)。为了克服这一问题，并开发一种工业应用的方案，我们设计了一种从Ff-hiPSCs中生成肌成纤维细胞样细胞的方法。Ff-hiPSCs比Of-hiPSCs更容易培养，扩张更快，成本更低，因此适合工业应用[16]。

为了克服这一问题，并开发一种用于工业应用的方案，我们基于先前的方案[12,21]设计了一种方法，从Ff-hiPSCs中生成肌成纤维细胞样细胞。Ff-hiPSCs以10000细胞/孔的密度接种在6孔板中，扩展4天，然后在F12/ dmembased KBM神经干细胞培养基(KBM)中培养，该培养基含有10µM SB431542和1µM CHIR99021(图3A)。7天后，我们使用之前描述的[21]协议观察细胞迁移(图3B)。90%以上的细胞为CD271/CD57双阳性(93.81±1.86%，n=3)(图3C)。接下来我们研究了是否可以忽略FACS，因为这个过程会损伤细胞。无流式细胞术传代NCLCs，在含10%胎牛血清的αMEM中培养至少3周。来自Of-hiPSCs的肌成纤维细胞样细胞与来自Ff-hiPSCs的肌成纤维细胞样细胞无形态学差异(图3D)。几乎100%的ff - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞表达CD73(99.23±0.62%，n=3，图3E)， αSMA和FSP-1(100%， 113/113细胞双阳性，图3E)，类似于of - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞。

图3。Ff-hiPSCs分化为肌成纤维细胞。一种那肌纤维细胞分化的方案。B.那培养细胞的形态(第0天和第7天)。比例尺，500mm。C那定量分析CD271/CD57双阳性神经嵴干细胞。值代表平均值±SD (n=3，生物三重复)。D.那肌成纤维细胞的形态(第8天和第28天)。比例尺，500毫米。E.那Myofibroblast标记分析。流式细胞术检测cd73阳性细胞，免疫染色检测aSMA-和fsp -1阳性细胞。秤条，100μm。通过确定阳性细胞的百分比（n = 113细胞）来评估ASMA和FSP-1的表达。值代表平均值±SD (n=3，生物三重复)。

接下来我们评估了这些细胞的纤维化相关功能。TGF-β处理ff - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞的方法与of - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞相同(图4A)。TGF-β刺激并未引起ff - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞的明显形态改变(数据未显示)，这与我们在of - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞中的发现相似。TGF-β刺激后Col1a1和αSMA的表达显著增加(图4B)。这与TGF-β刺激下，of - hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞和人原发性肾成纤维细胞中Col1a1表达的增加是一致的(图2D-F)。

TGF-β/Smad抑制剂SB431542可抑制TGF-β刺激的肌成纤维细胞样细胞中Col1a1表达的增加:我们开发了一种制备足够数量的肌纤维细胞样细胞的方法，用于高通量药物筛选。使用此协议，1×10^4.Ff-hiPSCs为7.25±1.56×10^5.具有相同基因组背景的肌成纤维细胞，并且在第28天（n = 3）没有划大次变化。接下来，通过使用常见的抗纤维化药物筛选方法（图4C），研究了FF-HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞是否以浓度依赖性方式响应抗纤维化药物，例如TGF-β抑制剂。（图4C）。小分子SB431542是众所周知的TGF-β/ Smad抑制剂，据报道抑制纤维化表型[22-24]。以浓度依赖性方式（图4D，E），Sb431542在TGF-β刺激的FF-HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞中的COL1A1和αSma的抑制表达（图4D，E）。由ELISA检测到的细胞外COL1A1蛋白的水平也通过SB431542（数据未显示）降低。这些数据表明FF-HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞可用于抗纤维化药物筛选。

图4。TGF-B刺激在FF-HIPSC衍生的肌纤维细胞中增加COL1A1和ASMA基因表达，并被抗纤维化TGF-B / SMAD抑制剂SB431542抑制。一种那TGF-B刺激的方案。B.那肝源性肌纤维细胞中COL1A1和ASMA表达的定量分析。将细胞在饥饿培养基中培养3天，然后用TGF-B刺激。TGF-b刺激后6、24和48小时测量表达。值代表平均值±SD。* P <0.05和** P <0.01与非刺激细胞（n = 3，生物三份）。C，使用/不使用SB431542处理TGF-b的方案。D，COL1A1和ASMA基因表达在TGF-B刺激的HIPSC衍生的肌纤维细胞中的抑制率。将细胞在饥饿培养基中培养3天，然后用/不含SB431542用TGF-B处理。以后测量表达48小时（n = 3，生物三份）。E,抑制率数据的总结。值代表平均值±SD (n=3，生物三重复)。

讨论

我们证明HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞表现出类似的纤维化相关表型作为人原发性肾成纤维细胞。因此，这些HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞可用于鉴定新的抗纤维化药物。

通过伤口愈合和组织再生在各种器官中形成纤维化组织[1]。因此，纤维化组织形成对于稳态是重要的。然而，纤维化过程的错误化导致各种疾病，例如慢性肾病。在这种条件下观察到肌纤维细胞的过增殖和过度激活，导致ECM量增加和器官功能的丧失。

本研究试图开发一种新的工具，用于研究纤维化和使用hiPSCs识别新药。肌成纤维细胞样细胞由Of-hiPSC-和Ff-hiPSC-derived NCLCs生成。先前报道的iPSCs分化为NCLCs的效率仅为10-80%[12,21]，而我们的方法则高达90%以上，这表明我们已经开发出了一种从hiPSCs分化生成NCSCs的有效方法。

然后使用hipsc来源的NCLCs生成肌成纤维细胞样细胞，使用以前用于诱导hipsc来源的NCLCs的MSCs的方法[12,21]。当肾纤维化发生时，MSCs是肌成纤维细胞的来源[3,16]。在体内， MSCs的αSMA呈阴性，但在病理应激信号[1]作用下则呈阳性。MSCs在塑料培养皿等刚性基质上体外培养，模拟促纤维化微环境，可分化为表达α sma的肌成纤维细胞[23,25]。这可能解释了为什么在塑料培养皿中用MSC分化培养基培养的ipsc来源的NCLCs能自动分化成肌成纤维细胞样细胞，以及为什么人原代肾成纤维细胞在体外培养时表达αSMA而在体内不表达。

HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞表达了人肾成纤维细胞的重要标记，例如αma，Fsp-1，CD73，CD44和Hsp47 [17-19]。目前尚不清楚这些标志物是否足以定义肌纤维细胞的特征，因此我们研究了它们的纤维化表型。

在TGF-β刺激的纤维化期间，αsma阳性肌纤维细胞的水平增加，这些细胞分泌到细胞外空间中的细胞[4,26-28]。因此，我们刺激了具有TGF-β的HIPSC衍生的肌纤维细胞样细胞，并将其与商业人原发性肾成纤维细胞的水平与其水平的COL1A1和αsma表达进行了比较。在TGF-β刺激时，在人IPSC衍生的肌纤维细胞样细胞和人原发性肾成纤维细胞中增加COL1A1的表达，而αsma在这些细胞之间变化。αsma表达在肝脏衍生的肌纤维细胞样细胞中比在TGF-β刺激后的人原发性肾成纤维细胞中增加。TGF-β刺激后αSMA表达的水平可能反映了NCLC和/或其年龄的纯度。被认为是更异质的商业人的原发性肾成纤维细胞。实际上，根据他们的数据表，100％的细胞批次。12-0509和很多。12-1109是CD73阳性，而30.1％和93.8％分别为αsma阳性分别为0.7％和82.3％。这表明细胞均匀性在TGF-β刺激上提出了αSMA表达的差异。 Alternatively, differences in age may be responsible. Human primary renal fibroblasts were collected from healthy adults (Lot. 12-0509 is from a 76-year-old Caucasian male, while Lot. 12-1109 is from a 60-year-old black female), while hiPSC-derived cells have fetal characteristics. Expression of Col1a1 and αSMA was much higher in hiPSC-derived myofibroblast-like cells than in primary cells. Embryos grow at a fast rate, and NCCs therefore rapidly expand and differentiate into a variety of cell types, including αSMA-positive myofibroblasts, which secrete a large amount of Col1a1. However, adult tissue-specific stem cells do not proliferate rapidly or produce a large amount of collagen in the healthy state. This may explain the differences in expression of αSMA and Col1a1 between the cells used in this study.

为了研究hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞是否对药物发现有用，我们用抗纤维化化合物SB431542对它们进行了治疗。这抑制了TGF-β刺激的细胞纤维化表型的获得。尚不清楚我们的hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞是否与人肾成纤维细胞完全相同。然而，hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞在TGF-β刺激下表现出纤维化表型，而抗纤维化化合物的治疗抑制了这一现象。此外，我们还可以产生大量具有相同基因组背景的肌成纤维细胞样细胞[29-32]。使用这些细胞进行高通量药物筛选比使用原发肾脏成纤维细胞成本更低。因此，我们认为hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞可以成为研究纤维化和发现抗纤维化药物的有用工具。

结论

总之，本研究表明，hipsc来源的肌成纤维细胞样细胞可用于发现抗纤维化药物。此外，通过阐明干细胞控制肾脏稳态的机制，这些细胞可能有助于识别其他候选药物。

承认

我们感谢盐野木实验室的成员在研究过程中提供的有益建议。

利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

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