看看最近的文章

摘要

柑橘类水果是许多国家最重要的收入来源之一，在地中海地区广泛种植。柑橘果实在采后包装、贮藏和运输过程中会发生霉菌感染等多种病害。因此，柑桔果实采后病害的防治是影响果实品质和保质期的关键。

在本研究中，DiaClean®水技术是基于电解1.25% NaHCO_3.以硼掺杂金刚石电极溶液作为一种替代杀菌剂处理柑橘类水果的方法，用于水果保鲜。利用该工艺不同阶段产生的化合物总混合物的等量来调查其细胞毒性效应，作为评价人类健康和环境风险的指标。用培养的结缔组织成纤维细胞(L-929细胞系)进行检测，通过测定细胞内线粒体脱氢酶的活性来检测细胞活力。

结果清楚地证明了电解NaHCO的使用_3.在柑橘果实的保鲜中，急性期的电解是非常有效的;抗菌和细胞毒性化合物的出现仅限于该过程的液相阶段。风干后未观察到可能对人体健康和环境有害的细胞毒性作用。

关键字

cItrus果实，保存，贮藏，活性氧种类，细胞毒性，细胞培养

缩写

BDD:硼掺杂金刚石电极，ROS:活性氧

介绍

柑橘类水果是许多国家最重要的收入来源之一，在地中海地区广泛种植。在采后包装，储存和运输期间，可能需要几周，柑橘类水果可以通过各种疾病感染。其中，由绿色霉菌引起的疾病青霉菌digitatum是最严重的一种，可能造成高达90%的产品损失。因此，柑桔果实采后病害的防治是影响果实品质和保质期的关键。

各种杀菌剂和除草剂的使用，如imazalil(杀菌剂)、噻苯达唑(杀菌剂和除草剂)、嘧霉胺(杀菌剂)等，减少了采后虫害[2]，但广泛的应用导致了抗性菌株的产生，降低了它们的效果。此外，使用这种杀菌剂[3]也会对人类健康和环境造成风险。事实上，在过去几年里，已经制定了兼顾有效性和低健康和环境风险的替代战略。

这个问题的非常有希望的技术之一似乎是使用在食品工业过程中成功进行测试的电解水[4]并反对新鲜水果和蔬菜的采后衰变[5-7]。因此，使用硼掺杂的金刚石（BDD）电极进行柑橘水果洗涤水的电解被证明是有效的，并且可以通过添加NaHCO来增加_3.对电解前的水[8-10]。这项技术是基于在电化学中使用金刚石作为电极材料的想法。特别是BDD电极在氧化有机和无机化合物[11]方面表现出了优异的电化学性能。反应活性主要与生成羟基自由基[12]或超氧阴离子自由基[10]有关。然而，具体的作用方式目前尚不清楚，也不清楚其产生可能对人类健康和环境有害的长期化合物的可能性。

在本研究中，基于电解NaHCO的DiaClean®水技术_3.使用BDD电极的溶液用于柑橘类水果保存。使用在保存过程的不同阶段产生的化合物的总混合物的等分试剂研究其对培养的结缔组织成纤维细胞的活力的影响，从而评估可能的健康和环境风险。据我们所知，以前尚未检查后续工艺阶段的细胞毒性。

材料和方法

根据DiaClean®技术制备电解水

将2.5 L的供水(15°C)注入DiaClean®Kit设备(WaterDiam France SAS;Franken，法国)，电解电流为4.0 a，体积流速为200 L/h。电解时电压为25v。在电解过程中，水通过循环冷水冷却盘管冷却，以避免温度上升超过20°C。30分钟后，总电荷0.8 Ah/L被送到水中，这与Fallanaj的报告中描述的类似et al。［10］．电解水用0.45 μ m多孔膜过滤器过滤无菌后加入到细胞培养中。

电解1.25%水溶液NaHCO的制备_3.解决方案

2.5 L供水含1.25% (w/v) NaHCO_3.解决方案（31.25 G Nahco_3.在电流为4.0 a，体积流速为200 L/h的情况下，用上述DiaClean®Kit设备进行电解。电解时电压为8v。30分钟后，向NaHCO注入总电荷0.8 Ah/L_3.然后过滤无菌并加入细胞培养物中的溶液。

概述所有用电解水和NaHCO进行的实验_3.解决方案

以电解水和NaHCO的制备为基础_3.如上所述的解决方案，我们进行了以下实验，以进一步了解在该过程的哪个阶段可能发生细胞毒性效应:

1供水±电解的细胞毒性

1.1供应水

1.2电解后直接供应0.8 Ah/L的电解水

1.3用0.8 Ah/L电解水供应，室温下储存15分钟

2 1.25% NaHCO的细胞毒性_3.解决方案±电解

2.1 - 1.25% NaHCO_3.解决方案在电解

2.2 - 1.25% NaHCO_3.用0.8Ah / L电解后直接溶液，在室温下储存15分钟后，2小时和5天

2.3 - 1.25% NaHCO_3.总电荷量为0.05 - 0.1 - 0.2 - 0.4 - 0.6 - 0.8 Ah/L

3电解1.25% NaHCO处理后柑橘果实的细胞毒性_3.解决方案

未经处理/未保存的BIO柑橘类水果(橙子、柠檬和葡萄柚——选择水果是为了避免任何疾病或表面伤害)用40°C的供水水仔细地预先清洗，并在新鲜制备的电解NaHCO中浸泡45至60秒_3.(总电荷0.8 Ah/L)，在常光下风干24 h，室温下再保存24 h。然后每个水果用25 ml供水水(20℃)冲洗，用消毒后的洗涤液进行细胞毒性试验。

细胞培养及培养条件

L-929小鼠结缔组织成纤维细胞;ACC 173;德国莱布尼兹微生物与细菌研究所;德国布伦瑞克);内部通道93 - 97;根据EN ISO 10993-5: 2009推荐用于体外细胞毒性评估。细胞通常在37°C、5% CO的潮湿气氛的培养箱中进行批量培养₂和95%的空气。培养基为RPMI 1640，添加10%胎牛血清，100单位/ml青霉素和100µg/ml链霉素。

细胞毒性试验

调查是根据EN ISO 10993-5: 2009(体外细胞毒性测试)进行的，并进行了一些修改。

将L-929细胞从80至90％的汇合质量培养物中取出，并在200μL培养基中以5,000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。接种后24-48小时，将细胞暴露于浓度（高达50％）的无菌供应水作为溶剂对照和来自各种实验设计的溶液，如详细描述的。在连续暴露3天后，检查细胞培养物形态学上，通过使用XTT（Xenometrix Ag; Allschwil，Switzerland）的细胞内的线粒体脱氢酶活性测量细胞活力。

XTT是2,3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-硫苯酚] -2H-四唑-5-羧氧化物的钠盐，具有淡黄色。活细胞的线粒体脱氢酶切割XTT的四唑鎓环，得到溶于水溶液的橙色甲烷晶体。所得橙溶液的强度直接与细胞活力和代谢活性相关[13,14]。

为测定暴露后细胞活力，抽吸培养基±加入的溶液，加入含10% XTT的新鲜培养基200µL/孔。在37°C下与四唑染料孵育120分钟后，使用BioTEK Elx 808双波长酶联免疫吸附测定仪在450 nm和690 nm处测定每孔的光密度。将不同提取液稀释后的光密度与相应试剂对照进行比较，并以平均值±标准差计算相对细胞活力。所有实验都是在三次或四次重复中进行的。采用双尾Wilcoxon-Mann-Whitney u检验进行统计分析。

结果与讨论

由于培养基渗透压降低，供给水的添加导致连续暴露3天后结缔组织成纤维细胞活力呈浓度依赖性下降(图1)。因此，进一步的实验只在最大添加水量为50 vol%的情况下进行，所有的数据都以相对值表示，与含有相同数量的供水而不进行任何处理的未处理对照相比。

图1所示。培养的结缔组织成纤维细胞(L-929)的活力随培养基中供应水浓度的增加而随渗透压的降低而呈剂量依赖性降低。暴露时间为3天。数据代表平均值±标准差(n = 3)。

电解铝水总费用是0.8啊/ L没有影响培养的成纤维细胞的活力(图2)后直接电解和15分钟后在室温下储存表明没有细胞毒性化合物生成能够减少发病率的绿色模具unpreserved表面柑橘类水果。在以前的调查中，已经测试了电解水在工业食品加工中的使用和防止新鲜水果和蔬菜的采后腐烂[5-7]。然而，电解过程中酸化或向水中添加各种有机和无机盐增强了其抗菌功效。特别是NaHCO的引入_3.[15]对柑橘果实的保鲜效果显著，是一种有效的抑菌剂青霉菌腐烂(8、9)。

图2。直接电解水(总电荷为0.8 Ah/L) (A)和室温保存15 min后(B)对培养结缔组织成纤维细胞(L-929)连续暴露3天后活力的影响。两种实验设置在处理过的细胞和相应的对照组之间都没有显示出显著的差异。数据代表平均值±标准差(n = 3)。

根据电解NaHCO的有效性_3.就像fallanj演示的那样et al。[8-10]为了青霉菌抑制，是含有1.25％NaHCO的细胞毒性的数据_3.如这里所示。而培养的结缔组织成纤维细胞暴露于1.25% NaHCO_3.(图3A)，电解后的NaHCO对细胞活力无影响_3.(总电荷0.8 Ah/L)直接电解后，在长达5天的存储时间后，产生了显著的细胞毒性效应(图3B-3F)。然而，随着贮藏时间的延长，细胞毒性逐渐降低，但在贮藏5天后，在试验浓度> 10 vol%下，细胞毒性仍有统计学意义。这说明电解NaHCO_3.结果产生了细胞毒性化合物，这似乎是该过程在柑橘果实保鲜的抗菌功效。为了测试总电荷是否变化适用于1.25% NaHCO_3.在0.05 ~ 0.8 Ah/L的总电荷范围内进行细胞毒性试验。如图4所示，电解NaHCO_3.以电荷依赖的方式产生细胞毒性化合物。

这两个结果都清楚地表明，电解1.25% NaHCO_3.产生了细胞毒性和抗菌化合物。虽然工艺阶段还不完全清楚，但有一些关于生成化合物的报告。宋et al。[16]报道了电化学产生的活性氧(ROS)可能是微生物抑制的原因。此外，BDD电极本身也可能产生包括超氧阴离子自由基和过氧化氢在内的ROS[10,17]。

图3。Nahco 1.25％的影响_3.溶解在电解(A)之前,供水后直接电解的总电荷0.8啊/ L (B)和存储在室温下15分钟后(C), 2 h (D), 12 h (E)和5天(F)的活力的结缔组织纤维母细胞(L - 929)后3天的连续曝光。值得注意的是，储存时间会缓慢地降低电解NaHCO的细胞毒性_3.，但在5天后浓度高于10%时仍显著。数据代表平均值±标准差(n = 3)。

图4。Nahco 1.25％的影响_3.对培养的结缔组织成纤维细胞(L-929)持续暴露3 D后，总电荷分别为0.05 Ah/L (B)、0.1 Ah/L (C)、0.2 Ah/L (D)、0.4 Ah/L (E)和0.6 Ah/L (F)。注意电解NaHCO_3.显然以电荷依赖性方式产生细胞毒性化合物。数据代表平均值±标准差(n = 3)。

在本研究的最后一系列实验中，测试了新制备的电解NaHCO是否适用_3.对未保存的水果进行风干和贮藏也可能产生细胞毒性和有害化合物。橙子、柠檬和葡萄柚风干后的表面呈粉状，很容易洗掉并收集起来。与对照组相比，这种洗涤提取物在所有浓度的测试分析中不再显示细胞毒性作用(图5)。这表明电解NaHCO主要产生细胞毒性化合物_3.如图3和图4所示，这是减少霉菌发病率所必需的，在表面风干后不再存在。此外，实验还表明，在最高浓度下，所有洗涤提取物的细胞活力都有所增加，这可能表明，处理后的水果可能以一种不仅提高其货架期，而且可能导致水果品质的改善的方式保存。

图5。橙(A)、柠檬(B)和葡萄柚(C)表面洗涤提取物对培养结缔组织成纤维细胞(L-929)连续暴露3天后活力的影响注意，与未经处理的对照组相比，洗涤提取物中没有一种是细胞毒性的，也不会降低细胞活力。此外，最高的试验浓度可增加所有提取物的细胞活力。数据代表平均值±标准差(n = 4)。

结论

综上所述，电解NaHCO的使用_3.在柑橘果实的保鲜中，急性期电解是非常有效的;抗菌和细胞毒性化合物的出现仅限于该过程的液相阶段。风干后未观察到可能对人体健康和环境有害的细胞毒性作用。

参考

1. Macarisin D, Cohen L, Eick A(2007)柑橘果实侵染过程中，digitatum青霉抑制宿主组织产生过氧化氢。植物病理学97: 1491 - 1500。［Crossref］
2. Kanetis L, Förster H, Adaskaveg JE(2007)采后新型杀菌剂偶氮菌酯、氟二恶英和嘧霉胺对柑桔绿霉病的防治效果比较。工厂说91: 1502 - 1511。
3. şişmant，türkezh（2010）瘤伞菌的毒理学评价特别参考遗传毒性和致畸潜力。Toxicol工业卫生26：641-648。［Crossref］
4. Kim C, Hung YC, Brachett RE(2000)氧化还原电位在电解氧化和化学改性水灭活食品相关病原体中的作用。J食品防63: 19到24。［Crossref］
5. Al-Haq MI, Seo Y, Oshita S, Kawagoe Y(2002)电解氧化水对抑制葡萄孢病梨果腐病的消毒效果。食物Res Int35: 657 - 664。
6. (2009)不同贮存条件下中性和酸性电解水的理化性质及杀菌效果。J食品英格91: 582 - 586。
7. Guentzel JL, Lam KL, Callan MA, Emmons SA, Dunham VL(2010)利用电解氧化水处理桃、葡萄采后灰霉病和褐腐病。国际食品微生物学杂志143: 54-60。［Crossref］
8. fallanj F, Sanzani SM, Zavanella C, Ippolito A(2013)通过使用导电金刚石电极电解提高盐添加对柑橘采后病害的控制。J植物病理学研究95: 373 - 383。
9. Fallanaj F, Sanzani SM, Youssef K, Zavanella C, Salerno MG, Ippolito A(2015)控制采后柑橘腐烂的新视角:电解水的使用。Acta Hort.1065: 1599 - 1606。
10. Fallanaj F, Ippolito A, Ligorio A, gargananese F, Zavanella C, Sanzani SM(2016)电解碳酸氢钠可抑制柑橘果实中的青霉菌，并诱导对绿色霉菌的防御反应。采后生物抛光工艺115: 29。
11. 甘ini D, Mahé E, Michaud PA, Haenni W, Perret A, Comninellis C(2000)废水处理中羧酸在硼掺杂金刚石电极上的氧化。J: Electrochem12: 1345 - 1350。
12. Marselli B, Garcia-Gomez J, Michaud PA, Rodrigo MA, Comninellis C(2003)硼掺杂金刚石电极上羟基自由基的电生成。J Electrochem Soc150：D79-D83。
13. Roehm NW, Rodgers GH, Hatfield SM, Glasebrook AL(1991)利用四唑盐XTT进行细胞增殖和活力的改进比色法测定。J lmmunol冰毒142: 257 - 265。［Crossref］
14. Brosin A, Wolf V, Mattheus A, Heise H(1997)使用XTT-assay评估不同表面活性剂和金属盐在人角质形成细胞(HaCaT)中的细胞毒性。一种可行的皮肤刺激物体外试验方法。Acta Dermato-venereologica77: 26 - 28日期间。［Crossref］
15. Smilanick JL, Margosan DA, Mlikota F, Usall J, Michael IF(1999)利用碳酸盐和碳酸氢盐防治柑橘绿霉，以及商业采后措施对其效果的影响。工厂说83: 139 - 145。
16. 郑杰，Kim C, Yoon J(2009)电化学消毒过程中电极材料对氧化剂生成和微生物失活的影响。水物43: 895 - 901。
17. 郝军，邱胜，李华，陈涛，刘辉，李丽(2012)氧化水中羟基自由基对大肠杆菌失活的影响。国际食品微生物学杂志155: 99 - 104。(crossref)