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摘要

糖尿病是一个全球性的医疗保健问题，涉及巨大的医疗保健和个人成本。尽管降糖药物可以控制血糖，1型(T1D)和2型(T2D)糖尿病患者经常出现微血管并发症，增加发病率和死亡率。目前的干预措施依赖于谨慎的血糖控制和健康的生活方式选择，但这些措施在逆转或完全预防主要微血管并发症、糖尿病周围神经病变(DPN)、糖尿病视网膜病变(DR)和糖尿病肾病(DKD)方面无效。二甲胺四环素是一种具有抗炎和抗凋亡特性的四环素类抗生素，已被提出作为糖尿病的保护剂。然而，目前尚无研究报道评价米诺环素在T1D和T2D模型中治疗所有微血管并发症(DPN、DR和DKD)的疗效。因此，我们在链脲佐菌素诱导的T1D和db/db T2D模型中进行了代谢分析，并比较了二甲胺四环素与胰岛素和吡格列酮在两种模型中预防并发症的效果。二甲胺四环素部分改善了T1D和T2D动物的DR和DKD，但效果不如胰岛素和吡格列酮，对两种模型的DPN均无改善。这些结果表明，在T1D或T2D相关微血管并发症患者中，二甲胺四环素不太可能改善现有治疗方法之外的结果。

关键字

糖尿病，二甲胺四环素，肾病，周围神经病变，视网膜病变

缩写

DKD:糖尿病肾病;DPN:糖尿病周围神经病变;博士:糖尿病视网膜病变;STZ:链脲霉素;T1D: 1型糖尿病;T2D: 2型糖尿病。

介绍

1型糖尿病(T1D)和2型糖尿病(T2D)都与并发症有关，包括糖尿病周围神经病变(DPN)、糖尿病视网膜病变(DR)和糖尿病肾病(DKD)[1]。血糖控制对预防并发症只有部分有效。因此，更好地理解疾病的病理生理学是开发有效治疗的关键。

利用T1D和T2D小鼠模型，我们和其他人探索了容易发生并发症的组织中的转录组变化，并确定了致病途径，包括炎症[3]、氧化应激[4]、凋亡[5]和线粒体功能障碍[6]。这些观察确定了可能减轻末端器官损伤的潜在治疗靶点。

二甲胺四环素是一种四环素类抗生素，在其抗菌特性之外发挥广泛的生物学作用，使其成为一种有吸引力的治疗糖尿病并发症的药物。它具有抗炎、抗凋亡、抗血管生成以及神经保护作用。有报道称，它可改善DPN[8]、神经痛[9]、DR[10,11]和DKD[12,13]，可能与抗炎、抗氧化和抗凋亡作用有关[10-13]。然而，在T1D和T2D小鼠模型中，没有研究报道二甲胺四环素对所有三种并发症的同时作用。

,我们评估二甲胺四环素治疗DPN疗效,博士,和DKD完善内转和T2D模型胰岛素或吡格列酮相比,常用的糖尿病患者(图1)。我们发现二甲胺四环素没有改善DPN,尽管这部分改善,DKD内转至博士和T2D动物,分别。

图1所示。研究设计。本研究由八组组成:(1)未经治疗db / +控制,(2)minocycline-treateddb/+对照，(iii)未经处理的T1Ddb/+ STZ小鼠，(iv)二甲胺四环素处理的T1Ddb/+ STZ小鼠，(v)胰岛素治疗的T1Ddb/+ STZ小鼠，(vi) T2D未处理db/db(vii)二甲胺四环素处理的T2Ddb/db(viii)吡格列酮治疗的T2Ddb/db老鼠。未经治疗的组只吃标准的食物。米诺环素剂量为55 mg/kg/d，吡格列酮剂量为15 mg/kg/d。治疗开始于6周龄小鼠，持续10周至16周龄小鼠研究结束。每2周记录体重和空腹血糖(FBG)水平。16周时，进行代谢、DPN、DR和DKD表型分析

材料和方法

动物

雄性C57BLKS (BKS) db/+小鼠(对照)和BKS db/db小鼠购自Jackson Laboratories (BKS)。Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J，库存号:000642;巴尔港，ME)。动物被饲养在由密歇根大学实验动物医学中心提供的特殊的无病原体的住房中，并自由获得水和食物。所有的方案都是按照糖尿病并发症联盟(http://www.diacomp.org)和美国国立卫生研究院(NIH)实验室动物护理和使用指南(第8版)概述的指南进行的。所有的协议都是由密歇根大学动物保护和使用委员会批准的。

动物模型和研究设计:诱导5周龄T1D db/+小鼠腹腔注射50 mg/kg溶解在柠檬酸缓冲液(pH 4.5)中的链脲佐菌素(STZ, Sigma Aldrich, St Louis, MO)，连续5天(db/+ STZ)[14]。瘦素信号缺陷的db/db小鼠作为T2D模型[14]。糖尿病定义为空腹血糖(FBG)水平超过300 mg/dL[15]。从6周龄开始，小鼠被随机分配到二甲胺四环素(db/+ MINO, db/+ STZ MINO, db/db MINO)或吡格列酮(db/db PIO)治疗组(图1)，并分别饲喂在此基础上添加55mg /kg/天二甲胺四环素或15mg /kg/天吡格列酮的- 76a标准鼠粮。米诺环素和吡格列酮均购自密歇根大学密歇根医学院，并由研究饮食(New Brunswick, NJ)合成为- 76a。所有其他组保持标准的鼠粮(未经处理)。根据制造商的说明，从6周龄开始，通过LinBit(来自加拿大多伦多的LinShin公司)给db/+ STZ胰岛素组注射胰岛素，直到研究终止(即10周和14周)，每4周更换一次植入物。研究持续时间为10周，在动物16周时结束。在对每种并发症进行表型分析后，小鼠被安乐死，腹腔注射150mg /kg戊巴比妥钠。从上腔静脉采血，进行糖化血红蛋白(%HbA1c)分析和血浆处理。 Hind paws were isolated for intraepidermal nerve fiber density (IENFD) analysis.

代谢表型:每2周称重一次。在整个实验期间，每2周使用AlphaTRAK血糖仪(Zoetis, parsippanyi - troy Hills, NJ)测量空腹血糖(FBG)。在研究结束时，使用制造商说明书(Mouse Hemoglobin A1c Assay Kit, cat# 80310;CrystalChem, Elk Grove Village, IL)。血清脂质谱由辛辛那提市小鼠代谢表型中心(MMPC)分析(辛辛那提大学医学中心，OH, USA;www.mmpc.org)。

DPN表型:采用糖尿病并发症联盟(www.diacomp.org/shared/protocols.aspx)概述的方法测量DPN。神经传导速度(NCVs)作为测量研究结束时腓肠感觉和坐骨-胫骨运动神经大纤维神经功能的指标，如前所述[16]。IENFD是对小神经纤维的解剖测量。用泛轴突标记泛素c末端水解酶L1 (UCHL1;1:20 00;Proteintech, Rosemont, IL)[17]。每只小鼠成像3个随机场(1024×1024像素分辨率，3.3 μm光学切片厚度，FluoView 500共聚焦显微镜，20×1.2物镜，Olympus，东京，日本)。MetaMorph (Molecular Devices, San Jose, CA)每堆叠10张图像，IENFD用每毫米纤维计数表示。

DR表型:使用糖尿病并发症联盟的方案评估DR。简单地说，在研究结束时，用凋亡DNA切割ELISA(细胞死亡检测，罗氏应用科学，印第安纳波利斯，IN)测量视网膜DNA碎片，并归一化到视网膜湿重[18]。

DKD表型:DKD的评估采用糖尿病并发症联盟的方案和之前报道的[19]。在研究的最后72小时，将小鼠置于代谢笼中，测量其尿白蛋白-肌酐比值(ACR)。收集最后24小时的尿液，使用Albuwell M和肌酐伴检(Exocell, Philadelphia, PA)[20]分析白蛋白和肌酐。将灌注后的左肾组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片至3µm厚度，用周期酸-希夫(PAS)[19]染色，观察肾小球肥厚情况。每只小鼠随机抽取15簇肾小球进行肥厚分析。通过计算每个肾小球的pas阳性面积相对于总面积来确定肾小球指数。根据我们发表的[19]方案，MetaMorph用于肾小球和pas阳性区域的量化，并使用数码相机拍摄显微镜图像。

统计分析

采用GraphPad Prism 7[21]进行统计分析。数据正态性用Brown-Forsythe f检验确定。正态分布数据有统计学意义的差异(P < 0.05)采用单因素方差分析，然后采用Tukey的后验进行多重比较。数据集对非正态分布数据进行log2转换，并重新运行Brown-Forsythe f检验。当log2变换归一化分布时，采用单因素方差分析，然后采用Tukey多重比较后验。当log2变换没有归一化分布时，在原始的、未转换的数据集上使用非参数Kruskal-Wallis检验，Dunn的多次比较后验。数据以平均值±平均值标准误差(SEM)表示。

结果

二甲胺四环素对T1D和T2D小鼠的代谢表型影响不大。在整个研究中，与非糖尿病对照组(db/+)相比，T1D db/+ STZ小鼠表现出显著的体重减轻(图2A和2C)和FBG升高(图3A-3C)。在研究结束时，与对照组相比，T1D db/+ STZ小鼠中较高的FBG表现为HbA1c %的增加(图3C和3D)。T1D db/+ STZ小鼠的脂质谱与db/+对照组大致相似，除了它们表现出更高的胆固醇水平，甘油三酯、非酯化脂肪酸(NEFAs)和磷脂没有差异(图4)。二甲胺四环素没有影响体重(图2C)、末端%HbA1c(图3D)、或T1D db/+ STZ小鼠的脂质谱(图4)，尽管与对照组相比，终端FBG略高，但明显高(图3C)。二甲胺四环素对对照组db/+小鼠也无影响。相比之下，与对照组相比，胰岛素部分恢复了T1D db/+ STZ小鼠的终末体重(图2C)、FBG和%HbA1c(图3C和3D)。与对照组相比，它还显著降低了T1D db/+ STZ小鼠的甘油三酯和NEFAs水平，但没有降低胆固醇或磷脂水平(图4)。

图2。纵向和末端体重。在6周、8周、10周、12周、14周和16周测量体重，并显示为对照组db/ +和db/+ MINO对抗:(A) T1Ddb/ + STZ,近年来db+ STZ mino, t1ddb/+ STZ INS，和(B) T2Ddb/db, T2Ddb/db米诺,T2Ddb/dbPIO。(C) 16周时测量的体重。INS,胰岛素;米诺,二甲胺四环素;PIO,吡格列酮。数据为平均值±平均值标准误差(SEM)。双向方差分析与Tukey多重比较检验。＊＊＊P< 0.001,而db/ +控制;＃＃P< 0.01, # # #P< 0.001,而近年来db/+ STZ或对T2Ddb/db；N = 7-10只小鼠

图3。纵向和终末期血糖状况。在6、8、10、12、14和16周记录FBG，并显示为对照db/ +和db/+ MINO对抗:(A) T1Ddb/ + STZ,近年来db+ STZ mino, t1ddb/+ STZ胰岛素，(B) T2Ddb/db, T2Ddb/db米诺,T2Ddb/dbPIO。16周时测量终末体重(C)和糖化血红蛋白百分比(D)。INS,胰岛素;米诺,二甲胺四环素;PIO,吡格列酮。数据为平均值±SEM。双向方差分析与Tukey多重比较检验。＊＊＊P< 0.001,而db/ +控制;＃P< 0.05, # # #P< 0.001,而近年来db/+ STZ或对T2Ddb/db；N = 7-10只小鼠

图4终端血脂水平。(A)甘油三酯、(B)胆固醇、(C)非酯化脂肪酸(NEFAs)和(D)磷脂在16周时被测量。INS,胰岛素;米诺,二甲胺四环素;PIO,吡格列酮。数据为平均值±SEM。双向方差分析与Tukey多重比较检验。＊P< 0.05, * *P< 0.01, * * *P< 0.001,而db/ +控制;＃P< 0.05, # #P< 0.01,而近年来db/+ STZ或对T2Ddb/db；N = 7-10只小鼠

在实验期间，与对照组相比，T2D db/db小鼠表现出显著的体重增加(图2B和2C)和FBG升高(图3B和3C)。在研究结论中，与对照组相比，T2D db/db小鼠FBG升高与HbA1c %升高并行(图3C和3D)。与对照组相比，T2D db/db小鼠存在严重的血脂异常，胆固醇、NEFAs和磷脂增加，但甘油三酯未改变(图4)。在T2D db/db小鼠中，米诺环素轻微降低了终末体重(图2C)，但没有改善终末血糖控制(图3C和3D)。它也轻微但不显著地扰乱了T2D db/db小鼠的NEFAs(图4C)。此外，二甲胺四环素对T2D db/db动物的代谢谱无影响。另一方面，吡格列酮对T2D db/db小鼠的影响更大，显著提高了它们的体重(图2B和2C)，但降低了它们的终端FBG和%HbA1c至db/+水平(图3C和3D)。吡格列酮也改善了T2D db/db小鼠的NEFAs，但对胆固醇和磷脂没有影响(图4)。总体而言，二甲胺四环素仅对糖尿病小鼠的代谢表型有轻微影响，而胰岛素和吡格列酮分别显著改善了T1D和T2D小鼠的多种代谢标准。

二甲胺四环素不能改善T1D和T2D小鼠的DPN表型

stz诱导的T1D db/+小鼠出现微血管并发症，包括DPN、DR和DKD[14,22,23]。如预期的那样，T1D db/+ STZ小鼠的大纤维感觉和运动nvs相对于对照组db/+动物显著降低，尽管小纤维IENFD仅趋于较低值(P = 0.052;图5 a-5c)。在T1D db/+ STZ或db/+对照组小鼠中，二甲胺四环素对这些DPN指标均无影响。相反，与对照组相比，胰岛素使T1D STZ db/+小鼠的大纤维传导正常化，IENFD增加(图5A-5C)。我们之前报道过肥胖、瘦素信号缺乏的T2D db/db小鼠发生DPN[3,20]。正如预测的那样，与对照组相比，本研究中T2D db/db的动物在大纤维和小纤维测量中均表现出明显的神经病变(图5A-5C)。二甲胺四环素对这些T2D动物的DPN表型没有影响。然而，吡格列酮对大纤维ncv确实有显著影响。综上所述，二甲胺四环素对糖尿病小鼠DPN无明显改善作用，而胰岛素和吡格列酮分别对T1D和T2D小鼠DPN表型有显著改善作用。

图5。末端DPN和DR表型。(A)腓肠感觉神经和(B)坐骨运动神经的末端大纤维神经传导速度(NCVs)。(C)末端小纤维表皮内神经纤维密度(IENFD)。(D)相对于湿视网膜组织重量，通过视网膜DNA碎片表达的视网膜末端凋亡。所有8组小鼠在16周时测量了所有指标。INS,胰岛素;米诺,二甲胺四环素;PIO,吡格列酮。数据为平均值±SEM。双向方差分析与Tukey多重比较检验。 **P< 0.01, * * *P< 0.001,而db/ +控制;＃P< 0.05, # #P< 0.01, # # #P< 0.001,而近年来db/+ STZ或对T2Ddb/db；N = 4-10只小鼠

米诺环素可改善T1D小鼠的DR和T2D小鼠的DKD

视网膜细胞凋亡是DR进展的替代物，当相对于湿视网膜组织重量进行量化时。如预期的那样，与对照组相比，T1D db/+ STZ小鼠视网膜凋亡增加(图5D)。在T1D db/+ STZ小鼠中，米诺环素和胰岛素均显著降低视网膜凋亡。在T2D db/db小鼠的视网膜中也观察到凋亡增加(图5D)，吡格列酮可改善这种情况，但二甲胺四环素治疗无效。因此，二甲胺四环素改善了T1D小鼠模型的DR表型，而不是T2D小鼠模型。

与db/+对照组相比，T1D db/+ STZ和T2D db/db小鼠ACR升高(图6A和6B)，肾小球面积和系膜指数增加(图6A和6B)。在T1D db/+ STZ小鼠中，二甲胺四环素对这些参数均无影响，但在T2D db/db动物中，二甲胺四环素部分地阻止了肾小球肥大和肾小球指数的增加。二甲胺四环素对T2D db/db小鼠的ACR没有影响，而吡格列酮治疗可防止T2D模型中DKD的所有方面。

图6。终端DKD表现型。通过(A) 24小时尿量和(B)白蛋白/肌酐比值测定肾功能的终末指标。(C)肾小球面积和(D)系膜指数是肾脏组织病理学的终末指标。所有8组小鼠在16周时测量了所有指标。INS,胰岛素;米诺,二甲胺四环素;PIO,吡格列酮。数据为平均值±SEM。双向方差分析与Tukey多重比较检验。＊P< 0.05, * *P< 0.01, * * *P< 0.001,而db/ +控制;＃P< 0.05, # #P< 0.01, # # #P< 0.001,而近年来db/+ STZ或对T2Ddb/db；N = 4-7只小鼠

讨论

多项研究表明，在小鼠模型和T1D和T2D患者的神经、视网膜和肾脏组织中，炎症、氧化应激、细胞凋亡、免疫和能量代谢失调是一致的特征[3-6,24-32]。我们和其他人[8-13,33-36]因此研究了二甲胺四环素，其抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[7]，可能作为DPN、DR和DKD的治疗药物。尽管一些报告显示,二甲胺四环素的改善方面每一个并发症(8、10 - 13 34-36),当前的研究是第一次同时二甲胺四环素对DPN的影响,博士,DKD相比在STZ-induced内转至模型和瘦素signaling-deficient T2D noble背景模型。在T1D db/+ STZ小鼠和T2D db/db小鼠中，我们还分别对比了米诺环素与胰岛素和吡格列酮的治疗效果。

在研究开始10周时，T1D和T2D动物出现了严重的糖尿病，包括终末FBG和%HbA1c升高(图3)，以及血清脂质谱扰乱，尤其是T2D动物(图4)。二甲胺四环素并不影响体重和光纤光栅在我们实验内转和T2D军团并没有对血脂的影响在近年来的老鼠与先前的报道是一致的(9日,11日,34岁,36岁,37)和T2D鼠标[13]模型和人类[38]。虽然我们没有预料到二甲胺四环素会影响代谢参数，但我们预测，由于其抗炎、抗凋亡和抗氧化作用，它可以预防糖尿病并发症。二甲胺四环素还具有良好的药代动力学(PK)特性，包括良好的神经系统渗透和人类[39]血清半衰期长。然而，二甲胺四环素对糖尿病微血管并发症的保护作用充其量是适度的，并且在不同的糖尿病模型之间存在差异。

在我们的研究中，在T1D db/+ STZ和T2D db/db动物中，使用米诺环素(55 mg/kg鼠粮)10周对ncv或IENFD、大纤维和小纤维测量的DPN均无影响(图5A-5C)。与我们的研究结果一致的是，在stz诱导的T1D大鼠[37]中，每天25 mg/kg二甲胺四环素8周对NCV或IENFD缺乏没有影响。相比之下，米诺环素在[8]剂量40 mg/kg连续3天的情况下改善了腓肠nc和疼痛相关行为。在短期治疗试验后也报道了类似的二甲胺四环素对疼痛的疗效[9,33,40]，尽管鞘内二甲胺四环素(10nmol)并没有改善机械异位性疼痛，这是通过10周大的小鼠[41]的Frey单丝进行评估的。尽管数据有限，一项为期6周的试验(100 mg，每日两次与安慰剂对照)对50名T2D DPN受试者进行了治疗，结果表明，在接受米诺环素治疗和安慰剂的受试者中，振动感觉改善和疼痛感觉降低，尽管在米诺环素组[38]中改善更大。根据多伦多DPN[42]专家小组(Toronto Expert Panel on DPN[42])，该试验需要注意的是，未评估定量ncv和IENFD，这是在DPN临床试验中证明药物有效性的要求。小鼠研究的变化和这一唯一临床试验的结果表明，二甲胺四环素可能有短期的有益作用。显然，还需要在小鼠和人身上进行进一步的研究，以确定米诺环素治疗的长期益处。相比之下，胰岛素在T1D db/+ STZ小鼠中完全正常化了小纤维和大纤维DPN指标(图5A-5C)，如预期的[2]。然而，令人惊讶的是，在T2D db/+动物中，吡格列酮改善了大光纤NCVs，但没有改善小光纤ienfd(图5A-5C)，这与我们之前在相同的T2D模型[26]中观察到的效果相反。 We anticipate this discrepancy between studies is related to a variation in gut microbiota that can affect the metabolic phenotype [43] and hence DPN, a possibility we are currently examining.

在目前的研究中，二甲胺四环素降低了T1D db/+ STZ动物视网膜中DR的替代标记DNA片段，但对T2D db/db动物没有影响(图5D)。我们的结果同意博士二甲胺四环素治疗的积极作用在近年STZ大鼠模型给每天两次用二甲胺四环素(22.5毫克/公斤)10天[34],以及近年来STZ大鼠治疗2.5或5毫克/公斤二甲胺四环素每天4或8周(10、11),或50毫克/公斤每天4周[35]。二甲胺四环素对T2D db/db小鼠没有影响(图5D)，据我们所知，目前还没有关于二甲胺四环素对T2D小鼠模型治疗的比较报道。我们确实观察到胰岛素和吡格列酮分别降低了T2D db/db组和T1D db/+ STZ动物的视网膜凋亡，这是T1D模型[44]的预期结果(图5D)。我们推测二甲胺四环素在T1D而非T2D队列中的疗效与糖尿病类型有关。与DPN一样，我们关于二甲胺四环素在T2D中对DR缺乏疗效的单一报道有待进一步证实，并探索其在T1D和T2D中的差异效应。

在我们的研究中，在每个模型中，二甲胺四环素对DKD进展的影响是不同的(图6)，在T2D db/db小鼠中，DKD在某些方面有改善，但在T1D db/+ STZ动物中没有影响。与我们的结果一致的是，stz诱导的T1D大鼠每天服用米诺环素(50 mg/kg) 4周，肾脏组织学指标(通过肾脏肥大和小管间质纤维化指数[36]评估)没有改善。相反，另一项对T1D STZ大鼠的研究发现，每天服用20 mg/kg二甲胺四环素，持续4或16周，蛋白尿[12]降低，肾细胞凋亡和肾小球硬化降低，但肾小球面积没有变化。与我们在T1D中的结果相反，用米诺环素治疗T2D db/db小鼠，部分地防止了肾小球肥大和系膜扩张，但不影响ACR(图6A和6B)。我们的数据与T2D db/db模型的平行研究一致，在8 - 20周的小鼠中，每日服用米诺环素(5 mg/kg) 12周的方案改善了肾脏组织学(TUNEL凋亡，系膜面积分数)[13]。我们的数据也与两项人类临床试验一致，二甲胺四环素治疗对ACR[38]没有影响。因此，临床试验和我们的研究表明，二甲胺四环素对肾小球生长和系膜基质扩张有影响，但对蛋白尿无影响。具体来说，二甲胺四环素在T2D中可能对肾小球系膜细胞和/或肾小球巨噬细胞有特定的治疗作用，这些细胞直接参与肾小球系膜的扩张，但对早期糖尿病的足细胞改变影响很小或没有影响，这些改变通常表现为蛋白尿。

结论

综上所述，关于二甲胺四环素对糖尿病微血管并发症的潜在影响的文献并不一致。差异可能源于啮齿类动物模型(大鼠与小鼠)、药物剂量和治疗时间、治疗开始时动物的病程和年龄以及糖尿病类型的差异。我们的研究通过对具有相同遗传背景的T1D和T2D小鼠的并排比较确定了二甲胺四环素的疗效。我们发现二甲胺四环素有改善T1D和T2D小鼠微血管并发症的潜力，可以改善T1D小鼠的DR和T2D小鼠的DKD，但对两种模型的DPN均无明显影响。虽然在T1D和T2D队列中分别通过胰岛素或吡格列酮控制血糖，比二甲胺四环素更能挽救微血管并发症，但患者仍有可能从二甲胺四环素辅助治疗中获得潜在益处，即:在良好的血糖/代谢控制之外，二甲胺四环素可能会发挥更大的作用。在我们的研究以及其他报道的啮齿动物[8,10-13,34-36]和人类研究[38,45-47]中，二甲胺四环素耐受性良好，不良事件很少，支持其在建立良好、表型良好的动物糖尿病模型和人的进一步研究。

资金

这项研究工作使用辛辛那提MMPC测定血清脂质谱(DK059630)和密歇根州MMPC测定DPN表型(U2CDK110768)。资金由国家卫生研究院提供(1R24082841 to e.l.f.、S.F.A、f.c.b和S.P.;U2CDK110768和R21NS102924到E.L.F.;R01EY020582, R01EY029349和R01EY020823到S.F.A.;凯洛格眼科中心核心视觉研究中心;P30DK081943和P30DK89503到S.P.);诺和诺德基金会(NNF14OC0011633 to E.L.F.);米尔斯坦，内森和罗斯研究基金(给S.A.E.);新兴疗法的神经网络和A. Alfred Taubman医学研究所(给S.A.E.和E.L.F.)。

作者的贡献

S.A.E, P.D.O, l.m.h.和E.L.F.设计了这些研究。S.A.E P.D.O。,L.M.H J.M.H, F.E.M, H.Z.进行了研究。S.A.E P.D.O。,L.M.H S.F.A, F.C.B,焦燕雄,E.L.F.分析数据。s。a。e。s。n。m。g。s。s。s。s。s。s。s。s。s。s。s。s。s。所有作者都批准了最终版本。

确认

作者感谢密歇根大学的Crystal Pacut女士在ELISAs方面的技术专长。他们还感谢Stacey Sakowski Jacoby博士的专业编辑协助。

相互竞争的利益

P.D.O.目前受雇于Eli Lilly，但P.D.O.的所有捐款都是在他受雇于密歇根大学期间做出的。礼来公司并未以任何方式参与本文所述的研究。

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