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摘要

作品简介:最近的研究表明紫杉烷——乳腺癌治疗常用的化疗药物——可能会增加乳腺癌幸存者患淋巴水肿的风险。本研究的目的是分析多西他赛对淋巴内皮细胞(LEC)的影响，并确定可能解释这种临床关系的细胞机制。

方法:培养人真皮LEC在体外在不同浓度多西紫杉醇和LEC的情况下，分析增殖、迁移、小管形成和淋巴基因表达。

结果:多西他赛，浓度为100µM，对LECs有细胞毒性，导致增殖受损。在较低浓度(1和10 μ M)时，多西他赛通过减少LEC的迁移和小管形成而损害LEC的功能。高浓度多西他赛(100µM)处理后，LECs中淋巴标记podoplanin、LYVE1和FLT4表达下调，而PROX-1表达未下调。

结论:高浓度多西他赛可诱导LEC死亡，损害LEC增殖和淋巴基因表达。相反，低浓度的多西他赛可显著损害LEC的迁移和小管形成。因此，多西紫杉醇的这些不良反应可能提供了一种细胞机制，使临床观察到紫杉烷治疗增加了癌症患者淋巴水肿发展的风险。

关键字

多西他赛，淋巴内皮细胞，化疗，淋巴标记物，LEC死亡，LEC迁移

介绍

淋巴水肿是一种慢性疾病，其特征是由淋巴液积聚和纤维脂肪组织沉积引起的组织肿胀。在美国，淋巴水肿最常见的原因是乳腺癌的治疗，20-40%的妇女在进行腋窝淋巴结清扫后发生淋巴水肿[1,2]。这种手术过程阻断了淋巴毛细血管，导致淋巴管渗漏导致间质液体的进行性积聚，淋巴泵功能受损导致组织纤维化，以及脂肪沉积。

淋巴水肿患者主诉为肢体肿胀、疼痛、沉重、手臂功能减退、皮肤改变和增厚、疤痕组织形成和反复感染。因此，淋巴水肿导致严重的生活质量损害[1,3]。然而，尽管淋巴水肿很常见，而且是发病的主要原因，但对这种疾病的治疗仍然是姑息性的，主要依靠按摩、皮肤护理和[3]压缩绷带。这些疗法对一些患者有效，但不能治愈，而且在时间和治疗费用方面都很昂贵;因此，姑息治疗往往与依从性差和疾病进展有关。因此，识别可能导致淋巴水肿发展的危险因素以及对这种疾病的新的治疗选择是一个重要的生物医学目标。

众所周知，肥胖和淋巴结池放疗会增加腋窝淋巴结清扫后发生淋巴水肿的风险[4-7]。最近的研究表明紫杉烷化疗也可独立增加乳腺癌相关淋巴水肿的风险[4-9]。这是很重要的，因为这类化疗药物通常用于治疗乳腺癌患者。例如，一些研究表明，接受紫杉烷化疗的患者与接受其他类型化疗药物(如蒽环类药物)或不接受化疗的患者相比，发生淋巴水肿的风险更高[4,7-9]。更重要的是，一项超过5000名乳腺癌患者的大型研究表明紫杉烷化疗是手臂肿胀和淋巴水肿症状的独立预测因子。虽然紫杉烷治疗与淋巴水肿的发展之间的临床联系很强，但缺乏分析这种联系的细胞机制的研究。因此，本研究的目的是评估多西他赛化疗对淋巴内皮细胞(LEC)的直接影响。我们发现LECs暴露于不同剂量的多西他赛在体外结果导致增殖受损，小管形成和淋巴迁移。此外，我们发现多西他赛暴露降低了LECs淋巴基因的表达。综上所述，我们的结果表明多西他赛可能对LECs有毒性，即使低剂量也可能损害淋巴功能。

材料和方法

细胞培养

原代人真皮LECs (PromoCell, C-12217，海德堡，德国)在含有青霉素、链霉素和补充混合物(均来自PromoCell)的内皮细胞生长培养基中在37°C和5% CO2条件下生长。

细胞生存能力分析

MTT分析(Thermo Fisher Scientific, V13154, Waltham, MA)比色法定量细胞活力，并依赖于四唑染料MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑被酶从活细胞转化为福玛氮的事实。4 x 104英寸

将200µl培养基播种于96孔板上过夜。然后在37°C下暴露于不同浓度(0,0.01,0.1,1,10,100µM)的DMSO中多西紫杉醇(SelleckChemicals, S1148, Housto n, TX) 24小时。临床研究中多西紫杉醇的峰值血药浓度(Cmax)约为3µM[10]。由于许多临床变量可能会影响多西他赛在患者体内的药代动力学，因此我们选择对数尺度上的大剂量范围[11,12]。MTT法根据厂家推荐进行测定，上清液在570 nm处用分光光度法测定光密度。

细胞增殖

Ki-67染色检测细胞增殖情况。简单地说，将400µl培养基中的LECs (4 × 104)置于4孔玻璃腔载玻片(Thermo Fisher Scientific, LabTek II)上过夜，然后用不同浓度(0、1、10、100µM)多西紫杉醇处理24小时。然后在室温下用4%多聚甲醛(Thermo Scientific, J19943K2)固定细胞15分钟，用0.03%吐温20 (PBST;Fisher Scientific, BP337, Hampton，新罕布什尔州)。细胞

用0.03% PBST和5%驴血清(Southern Biotech, Birmingham, AL)在室温下阻断1小时。在LEC中加入兔抗ki -67抗体(Abcam, ab16667, Cambridge, MA)，孵育5小时。LECs用PBST洗三次，并用Alexa Fluor染色

594标记驴抗兔IgG (H+L)抗体(Thermo Scientific, a - 2207)在黑暗中2小时。用PBST洗涤两次后，用0.1% DAPI暴露LECs 10分钟，进行蓝色核染色，洗涤后用盖片固定。共聚焦显微镜(Zeiss, LSM 880, Oberkochen, Germany)对玻片成像，手工计数阳性细胞。每一剂量至少分析4孔。

LEC迁移

LEC将迁移至融合细胞培养单层中的缝隙。将100µl培养基中的LEC（1 x 104）接种在带有硅胶插入物（Ibidi，81176，Martinsried，Germany）的迁移35 mm培养皿上24小时，硅胶插入物在单层细胞中形成间隙。24小时后取出硅酮嵌件，将细胞暴露于不同浓度（0、1、10、100µM）的多西紫杉醇中。在培养24小时后对细胞进行检查，并通过光学显微镜评估细胞迁移到移除的插入物形成的缝隙中的情况。光镜图像取自代表性样本。

基质凝胶试管形成试验

当LEC被植入凝胶基质层时，会自发形成圆形管状结构，反映出它们的集体组织能力。冷液体基质凝胶（康宁，康宁，纽约）用于涂覆4孔室载玻片（Lab-Tek II）或96孔板的底部，并使其固化30-60分钟。将多西紫杉醇以不同浓度（0、1、10、100µM）添加到LEC（4 x 104）中。孵育3小时后对LEC进行成像。从腔室载玻片或平板上的预设位置记录显微镜图像。针对每种情况，从14个不同的高功率场手动计算单个圆形管状结构。

LEC基因表达

将LECs (3 × 105)播种在6孔板上过夜。细胞洗涤后置于含多西紫杉醇(0,10,100µM)的培养基中孵育，37℃孵育6小时。用PBS洗涤LEC，用TRizol (Invitrogen)裂解并冷冻。将细胞解冻，用氯仿涡旋，离心提取核酸，将核酸转移到1.5 ml的异丙醇管中，孵育10分钟，离心。弃上清，用75%乙醇沉淀核酸，漩涡、离心、风干，重悬于蒸馏水中。将8µl RNA、1µl dsDNase buffer和1µl dsDNase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)分别加入到PCR管中，置于冰上，37℃孵育2分钟。加入4µl Maxima cDNA H Minus Synthesis Master Mix (Thermo Fisher Scientific)和6µl nuclease-free water进行反转录。将得到的cDNA冷冻保存，通过检测PROX-1、PDPN、LYVE-1和FLT4分析淋巴细胞基因表达。

定量PCR:每个样品在384孔板上分别加入1µl cDNA和1.25µl引物(LYVE-1, PDPN, FLT4，或PROX-1，均来自Qiagen, Hilden, German) 6.25µl SYBRgreen (Qiagen)和4.5µl馏水。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物也用于该管家基因的qPCR作为参考。样本进行三次重复，数据使用Applied Biosystems QuantStudio (Thermo Fisher Scientific)进行分析。

统计分析

采用GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.， San Diego, CA)软件进行统计分析。对结果进行了总结，并用图形表示+标准差。多组之间的分析采用单因素方差分析（ANOVA），p<0.05被认为是显著的。事后测试（Dunnett多重比较测试）用于比较治疗组和对照组。

结果

大剂量多西紫杉醇对LECs具有细胞毒性，并可降低细胞增殖

高剂量多西紫杉醇(100 μM)培养LECs 24小时后，细胞活力显著下降，MTT法评估80%以上的处理细胞死亡(图1;p < 0.01)。相比之下，较低剂量(0.01-10 μM)的暴露对细胞存活率的影响最小。

图1。多西他赛对LECs的细胞毒性。LEC暴露于不同剂量的多西他赛24小时，然后采用MTT法评估细胞活力。对照组的LECs用不含decetaxel的DMSO处理，被认为是100%的活菌。(* * p < 0.01)

接下来，我们分析了细胞增殖标记物Ki67的表达，以确定不同剂量的多西紫杉醇处理24小时是否会调节LEC增殖(图2)。而低剂量的多西紫杉醇(1和10 μM)不影响LECs中Ki-67的表达。与对照组相比，高剂量doectaxel (100 μM)可使Ki-67表达降低35% (p<0.05)。

图2。多西他赛与LEC增殖。A。LEC暴露于不同剂量的多西紫杉醇24小时，然后对Ki-67进行免疫荧光染色以显示增殖的细胞，DAPI显示所有细胞核。量化各组增殖细胞比例(* p<0.05)B。有代表性的Ki-67和DAPI免疫荧光显微镜图像

多西他赛损害LEC的迁移

细胞迁移是细胞对刺激作出反应的定向运动。LEC在淋巴管生成、发育、损伤反应、伤口修复和癌症进展中需要迁移。据报道，多西紫杉醇可以稳定微管，防止它们的解聚，从而可以调节细胞的运动[10,14]，因此，我们分析了暴露于多西紫杉醇后的LEC迁移，方法是用硅酮植入细胞，然后将植入物提起，创建一个统一的，单层LECs边缘之间的标准化空间。到24小时时，未处理的LEC移至闭合间隙，填补了插入物产生的间隙(图3)。相比之下，使用任何剂量多西他赛(docetaxel)治疗的LEC，即使低至1 μM，间隙仍然存在。似乎没有任何部分反应，迁移似乎在所有测试剂量完全被抑制。这些结果表明，即使是低剂量的非致死剂量多西他赛也能显著抑制LEC的迁移，因此可能损害淋巴功能，而不会导致细胞死亡。

图3。多西他赛与LEC迁移。A。LEC作为单分子层植入，并由硅胶插入物产生一个缺口，然后将其抬起。LEC暴露于不同剂量的多西他赛24小时。细胞迁移的百分比由LEC闭合间隙的能力测定(**** p<0.001)。B。显示了具有代表性的显微图像。细胞层的边缘用红色虚线标记

多西他赛损害LEC小管的形成

接下来，为了确定多西他赛对LECs与附近细胞形成连接能力的影响，我们进行了基质小管形成实验。未经处理的控制LECs形成完整的管状环状结构。每一个管都是完整的LECs圆。低剂量多西他赛(1 μM)对LECs小管形成影响不大。然而，中等剂量(10 μM)的细胞暴露导致小管形成的显著损害，使完整圆形结构的数量减少了35% (p<0.05，图4)。(p < 0.05)。以这种方式治疗的LECs未能组织起来，呈现出与细胞损伤和即将死亡相一致的圆形外观。

图4。多西他赛与LEC管形成。A。LEC在基质上播撒，在不同剂量的多西紫杉醇中孵育3小时。计算每个高倍视野图像的小管形成数量(** p<0.01)。B. 显示了具有代表性的显微图像。红色箭头表示部分管道中断

多西他赛损害LEC基因表达

最后，为了检测多西紫杉醇对淋巴基因表达的影响，分析了多西紫杉醇治疗6小时后LEC中PROX-1、podoplanin（PDPN）、LYVE-1和FLT4的mRNA表达。低剂量多西紫杉醇（1和10μM）治疗对PROX-1、PDPN、LYVE-1和FLT4 mRNA的表达只有中度和不显著的影响。相反，高剂量多西紫杉醇治疗（100μM）显著降低PDPN、LYVE-1和FLT4的mRNA表达，但不降低PROX-1的表达（图5）。

图5。多西他赛与LEC基因表达。LEC暴露于不同剂量的多西他赛6小时后，采用实时荧光定量PCR检测PROX-1、PDPN、LYVE-1、FLT4 mRNA表达(* p<0.05)。

讨论

最近许多研究将乳腺癌患者使用紫杉烷化疗与上肢淋巴水肿的发展联系起来[4-9]。虽然这些研究中的统计相关性是显著的，但调节这种潜在关联的机制仍不清楚。在这项研究中，我们发现高剂量的多西他赛对LECs是有毒的，导致细胞死亡，并损害淋巴基因如PDPN, LYVE-1和FLT4的增殖和表达。更重要的是，我们发现低或中剂量的多西紫杉醇，即使是短期使用，对LEC迁移和小管形成有显著影响。

多西他赛对LECs的毒性可能与其微管功能活性机制有关。多西紫杉醇稳定微管并阻止其解聚的能力，从而停止微管的动态活动并阻止有丝分裂。此外，微管是细胞迁移的重要贡献者。微管的活性也可能直接影响基因的表达，微管的解聚与转录因子[15]的表达有关。

重要的是，我们的研究表明，不同剂量的多西紫杉醇对LECs的影响非常不同。多西他赛损害迁移功能所需的剂量最少，其次是阻断组织进入导管所需的剂量，最后是淋巴基因表达(如FLT4)、诱导细胞死亡和阻断增殖所需的剂量。这些发现的意义

乳腺癌患者的多西他赛在不同剂量下对LECs可能有不同的效果。化疗输注时或前后血清多西他赛水平升高可引起淋巴损伤。相反，在给药低谷时降低血清水平可能损害淋巴功能。多西他赛对LEC迁移的不良影响可能是这种药物与淋巴水肿发展之间关联的最重要的决定因素，因为淋巴后侧支淋巴的形成通常发生在腋窝淋巴结清扫后。例如，Suami和他的同事利用犬腋窝淋巴结清扫模型显示，绕过腋窝的侧支淋巴在手术后不久就形成，并提供了四肢间质液体[16]引流的新途径。因此，紫杉烷化疗导致的LEC功能的微小改变可能会损害侧支淋巴的形成，并增加随后发生淋巴水肿的风险。其他研究也表明，多西他赛诱发的淋巴功能障碍可以调节癌症复发或转移的风险。这一假设是基于发现多西紫杉醇治疗小鼠模型通过复杂的VEGFR3依赖和VEGFR3独立机制[17]调节LEC功能，从而提高肿瘤细胞存活率和侵袭性。其他研究表明紫杉醇-另一种广泛使用的紫杉烷药物-通过诱导自噬机制[18]抑制LEC迁移和分支点形成，增加肿瘤转移。显然，需要进一步的研究来研究这些影响; however, our results are intriguing and provide a mechanistic explanation for epidemiological studies demonstrating increased rates of lymphedema in patients treated with taxane chemotherapy.

这项研究有几个局限性。首先，我们在细胞培养中使用的多西紫杉醇剂量和治疗时间的范围不一定反映患者中LECs暴露的剂量。此外，多西紫杉醇通常在腋下淋巴结清扫手术前几周给予，并重复给药，但其在LEC中的活动持续时间尚不清楚。此前的一项临床研究表明，静脉注射[10]100mg/m2后，最高血清浓度(Cmax)约为3µM。多项研究表明，Cmax为1.6µg/ml ~ 4.1µg/ml[12]，约为1.3µM ~ 3.3µM。因此，本研究中使用的剂量选择包括高于和低于这一范围。虽然需要注意的是，在患者中，多西他赛到达LEC的实际剂量尚不清楚，但根据其输送方式，可能会在局部淋巴系统中增加。Teher Nassar等研究表明，PLGA[聚乳酸-羟基乙酸]纳米胶囊中的多西紫杉醇优先被淋巴系统吸收，并在口服后1.5小时积聚在肠系膜淋巴结，[19]持续存在8小时。最近，也有报道说，局部多西他赛治疗导致较高的淋巴积聚比传统i、 五,。交付方法[20]。此外，多西紫杉醇的浓度可能取决于许多不同的因素，包括肝酶功能、患者年龄、患者种族、药物相互作用等[11,13]。最后，多西紫杉醇也可能对淋巴平滑肌细胞有显著影响，这些细胞可能独立改变淋巴系统的生理学，增加淋巴水肿的风险。

结论

总之，我们的研究表明，多西紫杉醇治疗，即使是低剂量，也对LEC的迁移和功能有显著影响。高剂量的该药对LECs有细胞毒性，并诱导增殖受损。这些发现为紫杉烷化疗乳腺癌患者淋巴水肿增加提供了可能的机制解释。未来的研究需要分析紫杉烷治疗的效果体内。

作者贡献

BJM和RPK构思并设计了实验。AMW和JEB完成了所有的实验。AMW, JEB和RPK撰写了手稿。AMW, JEB, HJP, JS和CLL协助细胞培养，数据分析和校对。

竞争利益

作者声明没有利益冲突。

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