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摘要

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)是一种多因子的系统性自身免疫性疾病，可产生多种细胞和体液免疫反应异常，包括调节失调的B细胞产生的自身抗原和自身抗体异常。在空气污染物中有许多已知的AhR(芳基烃受体)配体，如6-甲酰基林多洛[3,2-b]咔唑(FICZ)和2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英(TCDD)。本研究探讨了FICZ/TCDD对dp过敏性SLE B细胞自身抗原/自身抗体和炎症细胞因子产生的影响。采用来自B细胞系dp2诱导的自身抗原/自身抗体和来自dp2过敏性SLE的PBMC评价FICZ/TCDD的疗效。用FICZ/TCDD联合Dp2刺激细胞后，测定细胞自身抗原/自身抗体和炎症细胞因子。结果表明，FICZ/TCDD均能激活AhR的表达，诱导IL-8 mRNA的表达。除烯醇化酶-1外，对IFN-α、IL-6或自身抗原/自身抗体的产生无影响。在Dp2存在的情况下，FICZ/TCDD对AhR或B细胞系中任何自身抗原/自身抗体的表达均无增强作用。虽然Dp2可以诱导dp过敏性SLE患者和非SLE患者的PBMC产生IL-8，但两组之间没有差异，FICZ也没有显示对IL-8的产生有促进作用。综上所述，尽管FICZ/TCDD可以诱导dp过敏性SLE的B细胞产生AhR和IL-8。 There were no augmentation effects on Dp2-induced autoantigen/autoantibody or inflammatory cytokine production by FICZ/TCDD. In the presence of Dp2, FICZ had no augmentation effect on IL-8 production from PBMC derived from patients with Dp-allergic SLE.

关键字

SLE, AhR, FICZ, TCDD, Dp2

简介

系统性红斑狼疮(SLE)是一种多因素的系统性自身免疫性疾病，影响多个器官，包括皮肤、肺、关节、肾脏和心脏[1]。SLE的病因尚不清楚;然而，许多细胞和体液免疫反应的异常，包括调节失调的B细胞产生自身抗体，由于抗原呈递细胞(APC)功能异常导致的免疫细胞激活异常，以及自身抗原的产生，已在SLE患者中报道过[2,3]。自身抗原可以打破自我耐受，引发自身免疫B细胞和T细胞反应。对自身抗原免疫耐受的破坏导致自身反应性B细胞的激活，并可导致自身抗体的增加。据报道，日晒后的光敏性是SLE[2]的临床特征，而在大型城市中心，暴露于吸入污染物可能增加青少年发病SLE儿童的疾病活动风险[4]。

发生过敏的风险与获得对环境过敏原[5]的直接超敏直接相关。翼窦皮噬虫(Dp2) 2群抗原是主要的Dp致敏原之一，已报道在大多数过敏患者中引起IgE免疫应答。Dp2可诱导旁观者激活B细胞产生自身抗原，并刺激dp敏感SLE患者[6]产生自身抗体。

芳基烃受体是一种配体激活的转录因子，是一种外源和内源化学物质的传感器，通过调节靶基因[7]触发细胞反应。AhR的激活导致肝细胞损伤，胸腺退化，癌症和免疫抑制[8]。有许多已知的AhR配体包括2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英(TCDD)[9,10]和6-甲酰基多洛[3,2-b]咔唑(FICZ)(11)。FICZ是由色氨酸(Trp)暴露在UVB光下形成的[11,12]。细胞内形成的FICZ可与AhR相互作用，导致AhR易位进入细胞核，诱导基因表达，并加重炎症[13]。TCDD在高剂量下与人类的许多毒性结局有关，包括严重氯痤疮、神经毒性和肿瘤形成[14]。UVB是一种潜在的狼疮激活因子，FICZ是一种由色氨酸的UVB照射形成的化合物。我们之前的研究显示，在SLE患者中，dp2诱导的自身抗原/自身抗体的产生是通过炎症小体激活[15]完成的。了解FICZ是否可以诱导SLE患者的B细胞产生自身抗原/自身抗体和炎症细胞因子释放是很有用的。在本研究中，我们旨在研究FICZ对来自dp敏感性SLE患者的B细胞中AhR表达和自身抗原/抗体产生的影响。

材料和方法

选择的病人

选取台中退伍军人总医院过敏、免疫和风湿病科门诊的hdm敏感SLE患者(用瑞典乌普萨拉的Pharmacia CAP系统测定螨特异性IgE阳性血清)。SLE的诊断依据1997年美国风湿病学会修订的SLE分类标准。本研究得到台中退伍军人总医院(TCVGH-1063804C和CE16110B)的资助。

细胞培养

为了进行细胞分离和培养，收集16 ml血液样本，使用Ficoll-Paque Plus密度梯度(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)进行密度离心分离pbmc。如前所述，从PBMCs中纯化B细胞。通过FACS分析，B细胞制剂中CD19标志物阳性率为95%。细胞保存在RPMI-1640培养基中，其中含有10%热灭活胎牛血清和1%链霉素/青霉素，加湿的5% CO₂的气氛。

Dp2准备

纯化的重组蛋白Dp2 (RP-DP2C-1)购自室内生物技术公司(Charlottesville, Virginia, USA)。

化学物质

FICZ(≥95%)来自Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA)， TCDD购自Sigma-Aldrich (Stockholm, Sweden)。

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析

总RNA提取使用TRIZOL试剂协议。RNA的浓度和纯度是通过在NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Inc.， Wilmington, DE)中测量260/280 nm波长下的吸光度来确定的。使用SuperScript III第一链cDNA合成试剂盒，按照制造商说明进行反转录合成第一链cDNA。所有PCR检测均使用PCR主混合物进行。用于PCR分析的引物由Clontech实验室(Palo Alto, CA)设计和合成。使用MJ迷你个人热循环仪(Bio-Rad, Foster, CA)确定每个PCR反应的合适温度循环剖面。采用GAPDH作为内部控制。PCR产物装入2%琼脂糖凝胶上，经电泳分离。溴化乙锭染色后，DNA条带在紫外线下可见并拍照。琼脂糖凝胶中DNA条带的强度使用gel - pro分析仪(Media Cybernetics, Inc.， MD)进行量化。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA法测定细胞培养上清中自身抗体水平。Dp2、FICZ或TCDD在指定时间内处理后收集细胞上清，ELISA法定量IL-8、抗pgk -1和抗trimi -21的水平。平板在SpectraMax M2微版阅读器(Molecular Devices, CA, USA)上读取，并使用SOFTmax分析软件(Molecular Devices, CA, USA)进行分析。用线性回归计算这些蛋白表达之间的剂量关系的三重复ELISA值的平均值。

西方墨点法

全细胞裂解物按照前面描述的[4]制备。阻断后，将印迹与抗人PGK-1、trimi -21、Enolase-1和β-actin的抗体孵育，(Santa Cruz Biotechnology;Millipore，马萨诸塞州，美国)在TBS中使用0.1% Tween 20在4℃下过夜，然后在0.1% Tween 20的TBS中洗涤三次10分钟。然后将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗(Millipore, Massachusetts, USA)孵育1小时。用ECL (Millipore, Massachusetts, USA)进行检测，用LAS 3000检测化学发光。采用Multi - Gauge软件v3.0对带强进行分析。

统计分析

使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)进行统计分析。数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。p值≤0.05认为有统计学意义。配对学生t检验用于确定组间的统计学差异。

结果

Dp2、FICZ及Dp2联合FICZ (Dp2+FICZ)对B细胞系mRNA表达的影响

Dp2、FICZ、Dp2+FICZ分别培养4株dp过敏性SLE B细胞系6小时。收集细胞球进行AhR、IFN-α、IL6和IL-8测定。结果显示，Dp2和FICZ均增加了AhR的表达(图1A)。当检测细胞因子时，Dp2 (1.5μg/mL)和FICZ (100nM和500nM)均显著增加IL-8的产量(图1A)。FICZ对IFN-α和IL-6的产生没有影响，尽管IFN-α因Dp2而升高(图1A)。Dp2和FICZ对AhR、IFN-α、IL6或IL-8的表达无协同作用(图1B)。

图1所示。Dp2、FICZ和Dp2联合FICZ (Dp2+FICZ)对B细胞系mRNA表达的影响:来自dp过敏性SLE患者(n=4)的B细胞与Dp2一起在CO中孵育6小时₂孵化器。收集细胞球进行AhR、IFN-α、IL-6和IL-8测定。＊p与缓冲对照相比<0.05 (A)p与Dp2 (B)比较<0.05

Dp2、TCDD和Dp2联合FICZ (Dp2+TCDD)对B细胞mRNA表达的影响

dp过敏性SLE (n=4)的B细胞系与Dp2、TCDD、Dp2+TCDD共培养6小时。收集细胞球进行AhR、IFN-a、IL6和IL-8测量。结果表明，Dp2和TCDD均可增加AhR的表达。当检测细胞因子时，Dp2 (1.5μg/mL)和TCDD (20 nM)均显著增加IL-8的产量(图2A)。TCDD对IFN-α和IL-6的产生没有影响，尽管IFN-α因Dp2而升高(图2A)。Dp2和TCDD对AhR、IFN-α、IL6或IL-8的表达没有协同作用(图2B)。

图2。Dp2、TCDD和Dp2联合TCDD (Dp2+TCDD)对B细胞系mRNA表达的影响:来自dp过敏性SLE患者(n=4)的B细胞与Dp2一起在CO中孵育6小时₂孵化器。收集细胞球进行AhR、IFN-α、IL-6和IL-8测量。＊p与缓冲对照相比<0.05 (A)p与Dp2 (B)比较<0.05

Dp2、FICZ或TCDD对B细胞系自身抗原产生的影响

来自dp过敏性SLE患者(n=4)的B细胞与Dp2、FICZ或TCDD一起培养5天。采集细胞微球测定自身抗原。Dp2诱导B细胞中PGK-1、trimi -21和烯醇化酶-1产生自身抗原(图3A)。Dp2、FICZ和TCDD显著增加烯醇化酶的产量(图3A)。Dp2、FICZ或TCDD对PGK-1、trimi -21和Enolase-1的表达没有协同作用(图3B)。

图3。Dp2、FICZ或TCDD对B细胞系自身抗原产生的影响:来自dp过敏性SLE患者的B细胞(n=4)在CO中用Dp2、FICZ或TCDD治疗5天₂孵化器。收集细胞球测定自身抗原。＊p与缓冲对照相比<0.05 (A)p与Dp2 (B)比较<0.05

Dp2、FICZ或TCDD对B细胞系自身抗体产生的影响

来自dp过敏性SLE患者的B细胞与Dp2一起孵育5天。取细胞培养上清测定自身抗体。结果显示，尽管Dp2和LPS可以上调抗pgk -1和抗trim21的产生，但FICZ和TCDD对抗pgk -1和抗trim21的表达没有协同作用(图4)。

图4。Dp2、FICZ或TCDD对B细胞系自身抗体产生的影响:来自dp过敏性SLE的B细胞(n=4)与Dp2、FICZ或TCDD一起在CO中培养5天₂孵化器。取细胞培养上清测定自身抗体。＊p与缓冲对照相比<0.05

Dp2和Dp2联合FICZ (Dp2+FICZ)对PBMCs分泌IL-8的影响

来自dp过敏性SLE和dp过敏性非SLE的PBMCs与Dp2和Dp2+FICZ一起培养3天。收集细胞培养上清测定IL-8。结果显示，Dp2可促进两组患者IL-8的产生。这两组之间没有显著差异。两组患者在Dp2+FICZ的细胞上清液中IL-8的分泌均未增强(图5A)。当比较dp过敏性SLE和dp过敏性非SLE之间IL-8的产生时，Dp2组和Dp2+FICZ组之间也没有显著差异(图5B)。

图5。Dp2、FICZ和Dp2联合FICZ (Dp2+FICZ)对PBMCs中IL-8表达的影响:来自dp过敏性SLE (n=5)和dp过敏性非SLE (n=4)的PBMCs与Dp2和/或FICZ一起在CO中培养3天₂孵化器。收集细胞培养上清测定IL-8。＊p与缓冲对照相比<0.05 (A)。与Dp2相比无差异(B)。

讨论

研究AhR激动剂FICZ/TCDD对dp致敏性SLE患者自身抗原/自身抗体产生和炎症细胞因子产生的影响。结果表明，FICZ/TCDD在100、500 μ M和20 μ M浓度下均能诱导AhR和IL-8的表达;然而，它们的表达可以被Dp2和FICZ/TCDD一起废除。与Dp2共培养时，FICZ显著降低IFN-α和IL-6的表达，而TCDD不显著降低。

这种差异可能是由于FICZ和TCDD在细胞激活过程中对AhR具有不同的功能和亲和力。有报道称，典型AhR靶标CYP1A1可以有效降解FICZ，导致负反馈循环和短暂的AhR激活。相反，TCDD可以维持AhR的激活[16,17]。TCDD激活AhR导致naïve CD4+ T细胞分化为FoxP3+调节性T细胞(treg)[18]。此外，通过FICZ激活AhR可促进naïve CD4+ T细胞向Th17细胞[19]分化。在多发性硬化的实验性自身免疫性脑炎(EAE)模型中，TCDD在体内激活AhR降低了疾病的严重程度，而FICZ治疗则增加了疾病的严重程度[20]。

FICZ和TCDD可诱导烯醇化酶-1的表达;然而，它的表达可以被Dp2与FICZ或TCDD一起废除。这些结果表明，烯醇化酶-1表达的信号通路可能被Dp2下调。由于FICZ/TCDD对PGK-1/TRIM 21的表达没有影响，因此在Dp2存在或不存在的情况下，他们的抗PGK-1和抗TRIM 21抗体不受FICZ/TCDD的影响。

在B细胞系中，FICZ诱导的AhR和IL-8表达可通过与Dp2共培养而消除，PBMCs中Dp2诱导的IL-8产生可通过FICZ消除。这些结果表明，ficz诱导的AhR和IL-8的产生可能被Dp2抵消。我们之前的报道显示，CPPecp可以通过NLRP3激活来下调dp2诱导的SLE患者自身抗原/自身抗体的产生(21)。有报道称，ficz增强的AhR表达可通过抑制NLRP3转录[22]负向调节NLRP3炎症小体激活。因此，可能是FICZ下调了dp2诱导的炎症小体激活。

通过AhR的激活，可以控制B细胞从造血干细胞阶段到原B细胞、成熟B细胞和自身抗体分泌浆细胞阶段[23]的分化。本研究中，FICZ/TCDD和Dp2通过不同配体激活的转录因子和细胞因子的产生激活AhR。在dp过敏性SLE中，FICZ/TCDD和Dp2可能通过不同的受体和细胞因子的转录因子，扭曲免疫细胞极化，调节疾病活性。本研究的一个局限性是纳入分析的dp过敏性SLE患者数量较少。FICZ/TCDD与Dp2相互作用的确切机制有待进一步研究。

结论

总之，我们证明了Dp2可以激活B细胞增强AhR和细胞因子(IL-8/IFN-α)的表达，以及自身抗原/自身抗体的产生。FICZ/TCDD还能激活B细胞，增强AhR和IL-8的表达。然而，在Dp2存在的情况下，它们对这些自身抗原/自身抗体的产生没有增强作用。同样，在Dp2存在的情况下，FICZ对来自dp过敏性SLE患者的PBMCs中IL-8的产生没有增强作用。

致谢

本研究由台中退伍军人总医院资助(TCVGH-1063804C)。作者衷心感谢台湾台中市退伍军人总医院转化医学中心的协助。

的利益冲突

作者与本稿中提供的资金没有利益冲突。

参考文献

1. Rahman A, Isenberg DA(2008)系统性红斑狼疮。N英语J医学358: 929 - 939。(Crossref)
2. 系统性红斑狼疮发病机制的概念。中国ImmunolImmunopathol63: 19 - 22日。(Crossref)
3. Wozniacka, Lesiak J, Narbutt DP, McCauliffe A, Sysa-Jedrzejowska A(2006)氯喹治疗影响系统性红斑狼疮患者的促炎细胞因子水平。红斑狼疮、15:268 - 275。(Crossref)
4. Fernandes EC, Silva CA, Braga AL, salum AM, Campos LM，等(2015)幼年起病系统性红斑狼疮患者暴露于空气污染物与疾病活动性的关系。关节炎护理中心(Hoboken)67: 1609 - 1614。(Crossref)
5. 海顿RC 3^{理查德·道金斯}(2003)解决家庭环境中呼吸道过敏的普遍问题，Otolaryngol中国36: 803 - 824。
6. 于世杰，廖ec，蔡俊杰(2014)Der p2可诱导系统性红斑狼疮患者B细胞的旁观者激活。免疫生物学219: 958 - 963。(Crossref)
7. Denison MS, Soshilov AA, He G, DeGroot DE, Zhao B(2011)完全相同但不同:芳基烃(二恶英)受体作用分子机制的混杂和多样性。Toxicol Sci124: 22页。(Crossref)
8. Schmidt JV, Carver LA, Bradfield CA(1993)小鼠ahr基因的分子表征。组织，启动子分析和染色体分配。J临床生物化学268: 22203 - 22209。(Crossref)
9. 刘峰，廖超，付娟，吕军，薛强，等。(2014)东南典型电子垃圾回收区稻壳中多环芳烃和有机氯农药:时间趋势、来源及暴露评价。环境Geochem健康36: 65 - 77。(Crossref)
10. Lee J, Prokopec SD, Watson JD, Sun RX, Pohjanvirta R，等(2015)雄性和雌性小鼠对2,3,7,8-四氯二苯并对二恶英的肝脏转录组反应存在显著差异。BMC基因组学16: 625。(Crossref)
11. Fritsche E, Schäfer C, Calles C, Bernsmann T, Bernshausen T, et al.(2007)通过鉴定芳基烃受体作为紫外线b辐射的细胞质靶来增强紫外线响应。美国国家科学研究院104: 8851 - 8856。
12. Rannug U, Rannug A, Sjöberg U, Li H, Westerholm R，等(1995)两种色氨酸衍生的高亲和力ah受体配体的结构鉴定。化学生物2: 841 - 845。(Crossref)
13. Stockinger B, Di Meglio P, Gialitakis M, Duarte JH(2014)芳基烃受体:免疫系统中的多任务处理。为Immunol32: 403 - 432。(Crossref)
14. Hanieh H(2004)了解芳基烃受体在免疫系统中的作用:当前进展和未来趋势。生物医学研究的国际8: 520 - 763。
15. 蔡俊杰(2017)dp2诱导系统性红斑狼疮患者产生自身抗原/自身抗体是通过AIM2而不是NLRP3完成的。风湿性关节炎2: 1 - 6。
16. Smirnova A, Wincent E, Vikström Bergander L, Alsberg T, Bergman J，等。(2016)内源性芳基烃受体激动剂FICZ生成的新的不依赖光途径的证据。化学Res Toxicol29日:75 - 86。(Crossref)
17. Yeager RL, Reisman SA, Aleksunes LM, Klaassen CD(2009)介绍“tcdd诱导的AhR-Nrf2基因电池”。Toxicol Sci111: 238 - 246。(Crossref)
18. Quintana FJ, Basso AS, Iglesias AH, Korn T, Farez MF，等(2008)芳基烃受体对T(reg)和T(H)17细胞分化的控制。自然453: 65 - 71。(Crossref)
19. Veldhoen M, Hirota K, Westendorf AM, Buer J, Dumoutier L，等(2008)芳基烃受体连接t(h)17细胞介导的自身免疫与环境毒素。自然453: 106 - 109。(Crossref)
20. Stockinger B, Di Meglio P, Gialitakis M, Duarte JH(2014)芳基烃受体:免疫系统中的多任务处理。为Immunol32: 403 - 432。(Crossref)
21. 叶春霞，于淑娟，张春春，蔡俊杰(2017)dp2 - Cppecp诱导系统性红斑狼疮患者自身抗原/自身抗体产生及其调节作用。风湿性关节炎2: 1 - 6。
22. 怀伟，赵锐，宋宏，赵军，张磊等(2014)芳基烃受体通过抑制NLRP3转录负调控NLRP3炎性小体活性。Nat Commun20: 4738。(Crossref)
23. Sherr DH, Monti S(2013)芳基烃受体在正常和恶性B细胞发育中的作用。Semin Immunopathol35: 705 - 716。(Crossref)