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重组chaperonin 10 (rCpn10)治疗类风湿性关节炎是有效的。Chaperonin 10 (Cpn10)被认为是先前在妊娠血清中发现的免疫抑制早期妊娠因子(EPF)的代表。因此，我们认为rCpn10的免疫抑制活性可能与内毒素耐受有关。此外，Cpn10在妊娠血清中没有升高，使其成为EPF的不良候选。虽然Cpn10/EPF的故事提供了一个诱人的理论基础，但Cpn10就是EPF, Cpn10具有抗炎活性的证据远非令人信服。

早期妊娠因子(EPF)最初在1977年《柳叶刀》的一篇论文中被描述为存在于人类妊娠血清中的一种免疫抑制因子，可以通过玫瑰花结抑制试验(RIT)[1]检测到。淋巴细胞通过CD2与绵羊红细胞自发形成花环，这种活性可被抗淋巴细胞、抗血清或抗CD2抗体[2]所抑制。将淋巴细胞与妊娠血清(而非正常血清)孵育，可显著降低抑制玫瑰花结形成所需的抗淋巴细胞抗血清的浓度。EPF可能更准确地描述为RIT活性，因为在本研究中没有确定实际的因素[1]。该活性在其他哺乳动物的妊娠血清中被鉴定，包括牛、马、猪和老鼠，尽管存在一致性问题。在人类中，RIT活动一直持续到怀孕28周，但在31周时恢复到基线水平[4-6]。通过RIT检测，EPF被证实为热休克蛋白10 (Hsp10)，也被称为伴侣蛋白10 (Cpn10)[7,8]。

在观察到类风湿性关节炎在怀孕期间通常会得到改善[9]的支持下，重组Cpn10 (rCpn10)随后被CBio Ltd.开发为免疫调节生物制剂(XToll)[10]。一项随机、双盲、多中心的人体试验支持rCpn10(每周两次静脉注射5-10 mg)对治疗类风湿关节炎(RA)症状有效的观点。试验结果发表在《柳叶刀[11]》杂志上。随后有报道称rCpn10治疗多发性硬化症[12]和牛皮癣[13]的疗效，也进行了一项治疗狼疮的试验(NIH美国临床试验NCT01838694)。

然而，在RA试验结果[11]公布后，提出了一些保留意见。发表在《柳叶刀》杂志上的一篇评论认为，内毒素耐受性可能起了一定作用;rCpn10是在细菌中产生的，因此可能被低水平的内毒素[14]污染。内毒素耐受是一种被广泛描述的现象，即反复暴露于内毒素导致抗炎/免疫抑制免疫调节[15,16]。

Invion公司从参与RA试验[11]的少数患者获得了去识别芯片、DAS28和药代动力学数据，该公司购买了CBio，目前不从事XToll的开发。1820年rCpn10的平均Cmax+SD 115ng /ml_1／2(1)+在纳入RA试验的患者亚组(n=3)中测定SD 0.11小时。PBMC在基线(T0)和静脉注射10mg rCpn10 56天后获得，每周两次(T56)。4例患者(GSE112809) PBMC的配对(T0/T56)微阵列数据通过品控评估。这4例患者在此期间的DAS28评分均有改善(5.67 - 2.81,5.58 - 4.4,4.83 - 3.54,6.3 - 5.58;配对t检验p=0.048)与[11]一致。通过对4例患者的T56和T0进行配对比较，确定差异表达基因(DEGs)。分析发现，在T56处有328个上调的DEGs和139个下调的DEGs(使用p<0.05截断值)(补充文件)。使用基因集富集分析(fGSEA)，将上调的DEGs与公开的来自(i)人外周血经LPS处理的[17]和(ii)人外周血经单磷酸脂质A (MPLA)[17]处理的转录谱进行比较，这是一种toll样受体4(像LPS)和toll样受体2激动剂。观察到显著富集(i) LPS, NES=1.31, FDR=0.037和(ii) MPLA, NES=1.43, FDR=0.0038(图1a)。使用Ingenuity上游调节剂分析下调基因，发现免疫抑制细胞因子IL-10 (p=0.043)和TGFβ1 (p=0.045)可能与几个基因下调有关(图1b)，与[11]、DAS28评分改善和内毒素耐受[16]一致。 As patient numbers were low and low stringency cut-offs were used, these results might be viewed as indicative only, but they are consistent with induction of endotoxin tolerance by rCpn10 (as suggested [14]). Endotoxin contamination of recombinant proteins is hardly new, although bioassays or murine systems that reliably predict endotoxin tolerance (e.g. from repeated low dose endotoxin exposure) are arguably not well developed [18,19]. Humans are as much as 100,000 fold more sensitive to LPS than mice [20].

妊娠血清中RIT活性的分子基础尚不清楚，RIT检测的选择性和特异性也不清楚。因此，我们调查了蛋白质组学文献，以确定人类妊娠血清中是否确实存在Cpn10(或Hsp10)。在6项研究中[21-25]，只有一项研究鉴定了1个Hsp10肽[26]，尽管在这些研究中还鉴定了100-800个其他蛋白。Hsp10本质上并不难用质谱检测[27,28]。使用抗体捕获ELISA(检测限0.5 ng/ml) [29]， Cpn10水平大多在或低于检测限，没有迹象表明怀孕小鼠的水平显著升高(图2)。Cpn10已被证明在非怀孕人群中循环(平均6.5+SE 5ng /ml，范围0-115,n=23)[29]。因此，缺乏怀孕期间Cpn10升高的良好证据，因此缺乏EPF的候选物质。最后，其他介导母亲耐受的因素已被确定为[30]，尽管可能涉及[31]的因素范围很广。

图1．采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平台对4例经rCpn10治疗的类风湿关节炎患者的pbmc来源的RNA进行基因表达微阵列分析。微阵列数据转换为表达量，并通过affy Bioconductor软件包进行鲁棒多阵列平均(RMA)和基因ID转换进行归一化。采用arrayqualitymetrics Bioconductor包进行质量控制。采用基于limma Bioconductor包的配对t检验，鉴定T0 (rCpn10处理开始前)和T56 (rCpn10处理56天后)之间的差异表达基因(DEGs) (p < 0.05, fold change > 1.0)。(a)上调的DEGs(经过rCpn10处理后)(n=328)被用于pre- ranking Gene Set Enrichment analysis。这些实验使用fGSEA (R)和预先排序的基因表达折叠变化数据，这些数据来自于经LPS或MPLA处理90分钟的人类血液微阵列(GSE72557)。在这328个rCpn10上调基因中，两个数据集中存在295个。其中，102(32+38+32)被fGSEA鉴定为LPS和/或MPLA刺激的核心富集基因。(b)通过独创性途径分析(Ingenuity Pathway Analysis, IPA)上游调控功能(直接和间接)分析rCpn10处理后的下调基因。 A small but significant IL-10 and TGFβ1 signature was identified (numbers of “Target molecules in dataset” from IPA output are indicated).

图2．小鼠妊娠血清中的Cpn10水平。在指定时间从妊娠Balb/c小鼠和非妊娠小鼠(续)获得的血清使用捕获ELISA分析Cpn10浓度。

总之，Cpn10是EPF, Cpn10具有抗炎活性的证据并不令人信服。EPF/Cpn10的故事继续激励着人们[32,33]，但显然需要仔细地重新审视。

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