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摘要

DNA损伤后细胞周期阻滞取决于p53的存在，而p53在DNA损伤后稳定下来，导致其在细胞中积累。我们使用3-氨基苯甲酰胺(3-AB)，一种聚(adp -核糖)聚合酶1 (Parp1)抑制剂，研究了具有功能p53的C3D2F1 3T3-a细胞γ辐射后Parp1对p53水平的影响。0 - 8gy照射后，p53的数量呈剂量依赖性增加。在γ射线照射后的积累期，3-AB处理新表达的p53的表达期有轻微延长的趋势。然而，3-AB治疗后p53的半衰期没有变化。这些结果提示Parp1可能参与了DNA损伤后新表达的p53的表达调控。

介绍

肿瘤抑制基因突变p53参与了大约50%的人类癌症[1,2]。根据Tsuchida等，约90%培养的人口腔鳞状细胞癌细胞含有p53突变[3]。已有研究表明，p53是一种转录因子，在DNA损伤后具有重要作用，可诱导周期蛋白依赖性激酶抑制剂WAF1/CIP1/p21的表达，延迟或停止S期和DNA复制[4-6]。DNA损伤后阻滞G1是预防肿瘤形成的重要检查点机制。p53功能的丧失导致这一检查点的丧失，导致没有停止和修复的进展到S期[4,7]。结果，DNA损伤累积，由此产生的突变可导致肿瘤发生。G1期细胞周期阻滞的关键是p53蛋白[8]。凯斯坦等．评估了细胞对γ射线照射的反应，并显示野生型细胞p53（p53^{wt / wt})在辐射诱导的DNA损伤后，阻滞在G1或G2期，但在具有显性阴性突变或无效突变的细胞中(p53^{wt /狗}，p53^{傻瓜、傻瓜},p53^-/-)，停止仅发生在G2期[8]。此外，当细胞被紫外线辐射、4-硝基喹啉1-氧化物或伽马辐射和放线菌素D等DNA损伤因子处理时，p53蛋白水平会升高。然而，有人认为这是由于p53半衰期的翻译后延长[9,10]，并参与了DNA链断裂重新连接的调控[11,12]。延长的半衰期允许p53在细胞内积累，激活和抑制含有p53结合序列的基因簇的转录，并促进G1阻滞。p53的转录靶点包括GADD45，MDM-2，WAF1 p21 / CIP1 /，表皮生长因子受体,肌肉肌酸激酶[13 - 16]。

聚(adp -核糖)聚合酶1 (Parp1)是一种催化翻译后聚(adp -核糖基化)的酶。Parp1抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的存在抑制γ辐照后G1阻滞[17,18]，Parp抑制剂苯甲酰胺和鲁米诺也是如此。相反，用3-氨基苯甲酸(NAD类似物，不抑制Parps)治疗，也不能抑制G1抑制。因此，G1阻滞的抑制可能与Parps[19]的特异性抑制有关。在本研究中，我们通过研究3-AB对γ辐射诱导的DNA损伤后p53蛋白稳定的影响，研究了Parp1在p53水平调节中的作用。

材料和方法

细胞培养

C3D2F1 3T3-a细胞是由14日龄C3H/HeJ和DBA/2J小鼠胚胎建立的成纤维细胞系。这些细胞是由旭川医科大学的K. Ogawa博士和他的合作者建立和提供的。细胞在3×10上播种⁵细胞在含有10%胎牛血清的DMEM (ICN生化公司，Costa Mesa, CA, USA)中培养，每3天传代一次。翻倍的时间大约是17小时。据报道该细胞系的第5外显子和第9外显子之间没有突变Trp53[20]。3-AB购自东京化学工业株式会社(日本东京)本研究在伽玛照射前1小时加入4 mM的3-AB。

p53半衰期的测量

C3D2F1 3T3-a细胞在融合后2天进行γ射线照射。检测蛋白质合成，[³⁵γ射线照射1小时后加入50 mCi/mL的l -蛋氨酸。用PBS洗涤并收集细胞，用高盐RIPA缓冲液[10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.6 M NaCl, 0.1% SDS, 1% Nonidet P-40, 0.1%脱氧胆酸钠，1 mM EDTA, 10 mg/mL抑肽酶(Wako Pure Chemical Industries Inc.)和1 mM苯甲基磺酰氟]提取蛋白。首先，用小鼠IgG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)和山羊抗小鼠IgG - sepharose 4B (Zymed, San Francisco, CA, U.S.A.)对裂解产物进行预清除，使用的是具有等量放射性的液体提取物。接下来，使用小鼠抗p53单克隆抗体Ab246 (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)进行免疫沉淀，使用小鼠IgG和4-吗啡啉丙磺酸(MOPS, Sigma-Aldrich)作为对照。用含0.15 M NaCl的1 mL RIPA缓冲液洗涤5次去除未结合抗体。沉淀蛋白经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，凝胶干燥。使用bas2000生物图像分析仪(FUJIFILM Corp，东京)测量放射性。

结果

γ射线照射1小时后新表达的p53蛋白水平

为了测量新生p53的合成，[³⁵以l -蛋氨酸作为γ射线照射后合成C3D2F1 3T3-a蛋白的标记物，利用抗p53抗体进行免疫沉淀。p53的新表达量呈γ射线剂量依赖性增加(图1)。

图1所示。C3D2F1 3T3-a γ辐射后1小时p53蛋白初生水平。［³⁵在培养物中加入l -蛋氨酸，用不同剂量的γ射线照射，并使用抗p53抗体进行免疫沉淀。初始p53蛋白水平通过合并[³⁵l -蛋氨酸水平在p53蛋白条带上的凝胶

3-AB对2 Gy和8 Gy γ辐射后新表达p53蛋白积累的影响

研究了3-AB对p53蛋白新表达量的影响。在2 Gy(图2A)和8 Gy(图2B)照射后1小时，在没有3-AB的情况下，2 Gy和8 Gy照射后p53蛋白的新表达量分别约为对照细胞的3倍和4倍。我们注意到，在3-AB存在的情况下，在2 Gy和8 Gy照射1小时后，新表达的p53蛋白有轻微的增加，尽管这种增加没有统计学意义。

图2。3-AB对γ辐射后新表达p53蛋白积累的影响。3-AB在γ射线照射前1小时加入细胞。分别在2 Gy (A)和8 Gy (B)照射后1小时，在有无3AB的情况下测量p53蛋白的积累水平[³⁵如材料和方法所述，凝胶上p53蛋白条带上的l -蛋氨酸水平(n=4)

3-AB对γ辐射后新表达p53蛋白半衰期的影响

为了研究其对p53半衰期的影响，在γ射线照射前1小时将3-AB加入细胞。在没有3-AB的情况下，新p53的表达在8 Gy照射后10分钟达到峰值，然后随着时间的推移而下降，60分钟后无法检测到。在3-AB存在时，新p53的表达相对延迟，在10-20分钟达到峰值，并持续60分钟以上(图3A)。然而，通过线性回归计算p53的半衰期约为30分钟，在3-AB存在时p53的半衰期没有变化(图3B)。

图3。3-AB对γ辐射后新表达p53蛋白半衰期的影响。在γ射线照射前1小时向细胞中加入3-AB。在对新生p53蛋白进行脉冲标记后，用[³⁵l -蛋氨酸水平在p53蛋白条带上的凝胶。上面的图显示了p53蛋白条带³⁵下图显示了初期p53蛋白水平的衰减曲线和3-AB (B)的影响。

讨论

DNA损伤后G1阻滞的信号转导机制依赖于p53。我们之前报道过，在C3D2F1 3T3-a细胞中，γ射线照射后G1阻滞被Parp抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)抑制，据报道该细胞的第5外显子到第9外显子没有突变p53基因(17、18)。我们还发现3-AB能抑制Waf1 p21 / Cip1 /和Mdm2γ -辐照诱导C3D2F1 3T3-a细胞[21]。在目前的研究中，为了阐明Parp1的翻译后聚(adp -核糖基化)参与调控p53水平，我们分析了3-AB存在下DNA损伤后细胞中的p53稳定。γ射线照射后，研究3-AB对p53稳定的影响。γ辐射后p53的积累已经在许多不同的细胞类型中得到证实[8,22]。γ射线照射后，p53蛋白稳定下来，延长其半衰期。至少有两种方法可以检测这种稳定性，即通过western blotting确定p53的总量，或使用[³⁵l -蛋氨酸作为代谢标志物。p53的半衰期通常很短(小于20分钟)[23]，通过γ射线照射后免疫沉淀法检测新表达的p53蛋白的数量，可以随着时间的推移检测DNA损伤后p53的反应。在本研究中，我们使用[³⁵在C3D2F21 3T3-a细胞中以S] l -蛋氨酸作为代谢标记物，用抗p53抗体免疫沉淀研究p53蛋白新表达量的变化。

由于C3D2F21 3T3-a细胞在外显子5-9之间没有突变，因此可以使用该细胞系[20]研究DNA损伤后p53依赖的反应。此外，C3D2F21 3T3-a细胞是一个不同步的细胞群，约45%的细胞处于S期，在γ射线照射[24]处理的C3D2F21 3T3-a细胞中观察到细胞周期停滞。照射1小时后，该细胞系中新表达的p53蛋白呈剂量依赖性增加。

C3D2F1 3T3-a细胞脉冲标记[³⁵在照射后0-1小时、1-2小时、2-3小时和3-4小时检测l -蛋氨酸，并观察p53蛋白的新表达量。无论3-AB是否存在，新表达的p53蛋白在0-1小时(数据未显示)出现峰值积累。因此，在2 Gy和8 Gy照射1小时后，研究了γ照射后p53蛋白新表达量的变化。通过添加3-AB，在γ射线照射1小时后，观察到新表达的p53蛋白有轻微的增加。虽然结果没有统计学意义，但数据中的趋势表明3-AB的存在可能影响了γ辐照后G1的抑制过程。结果也与观察结果一致，即γ辐射[21]后，在3-AB存在的情况下，p53对其共识结合序列的结合活性水平略有增加。

车道等．报道3-AB延长p53蛋白稳定时间[25]。我们进一步研究了γ辐射损伤后新表达p53的半衰期是否受到3-AB的影响。p53在任何时间点的水平都会受到p53合成和降解速率的影响。γ射线照射后新表达的p53在3-AB存在时增加;然而，在3-AB的存在下半衰期没有改变。总之，p53的降解率在3-AB存在时没有改变。这些结果可能表明，Parp1的聚(adp -核糖基化)影响DNA损伤后新生p53蛋白的表达。未来，为了阐明Parp1在DNA损伤后p53调控中的作用，还需要进一步研究p53下游的机制。确定Parp抑制剂对p53依赖通路下游基因的影响尤其有用。

确认

这项工作得到了MEXT KAKENHI (15K14416)的部分支持。

的利益冲突

作者宣称不存在利益冲突。

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