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摘要

聚(adp -核糖)聚合酶(Parp)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)预处理抑制γ辐照后小鼠胚胎成纤维细胞C3D2F1 3T3-a细胞G1阻滞，增强G2阻滞。3-AB部分抑制Waf1 p21 / Cip1 /和Mdm2mRNA的诱导，被p53转录激活，这表明poly(adp -核糖基化)参与了γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞中p53依赖的信号转导的下游。在这项研究中，我们进一步研究了poly(adp -核糖基化)在细胞周期阻滞中的作用。照射后6小时加入3-AB后，G1抑制作用消失。血清饥饿同步C3D2F1 3T3-a细胞与γ辐照时，γ辐照细胞的DNA合成高峰时间没有改变，但DNA合成比例下降，其中3-AB预处理略微增强了这一比例的下降。3-AB在小鼠胚胎成纤维细胞Swiss3T3细胞中以剂量无关的方式降低G1阻滞，而在FM3A和NRF49F细胞中低剂量不影响G1阻滞。为了证实3-AB对Parp活性的抑制作用，我们测量了γ辐照后NAD水平的变化。我们观察到，4mm 3-AB可以阻止γ辐照引起的NAD下降，这表明4mm浓度的3-AB对细胞Parp活性有足够的抑制作用。这些结果表明，Parp抑制剂对γ辐照后G1阻滞的影响取决于细胞表型。

介绍

在哺乳动物等高等真核生物的细胞核中，聚(adp -核糖)聚合酶(Parp) 1识别DNA链断裂，并立即以β-NAD为底物合成聚(adp -核糖)链。Parp1组成性地存在于细胞核中，比例约为每几十个DNA千碱基中有一个[1]。观察到Parp1组成性地存在于细胞核中，以特定的方式识别DNA链断裂，并通过NAD催化聚(adp -核糖)链合成反应，这表明它可能是监测DNA损伤的候选传感器。事实上，先前的研究表明，在存在Parp抑制剂的情况下进行γ辐照时，治疗的细胞毒性会增强[2]。此外，考虑到Parp1特异性识别断裂DNA分子的自由端，Parp1可能在切割和修复DNA受损区域方面具有功能作用。此外，Parp1介导的DNA修复对烷基化剂的响应在Parp1低表达的突变细胞中被抑制，以及在Parp1 DNA结合位点过表达的显性阴性突变体中[3]。在针对Parp1的反义RNA抑制其细胞内功能的实验中，DNA修复过程被延迟[4]。在无细胞DNA修复系统中发现，在NAD的存在下，DNA修复过程以parp依赖的方式短暂中断[5]。因此，Parp1似乎参与DNA损伤修复，特别是DNA链断裂发生的地方[1]。

Parp的一种抑制剂，3-氨基苯甲酰胺(3-AB)曾被报道有部分抑制作用Waf1 p21 / Cip1 /和Mdm2mRNA诱导，它们被p53转录激活[6,7]，表明poly(adp -核糖基化)参与了γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞中p53依赖信号转导的下游过程[7]。在这项研究中，我们进一步研究了聚(adp -核糖基化)在细胞周期阻滞中的作用，使用3-AB和单宁酸，已知单宁酸可以抑制聚(adp -核糖)糖水解酶(Parg)[8,9]。

目前有两种方法用于检测poly(adp -核糖)的合成是否参与DNA辐照损伤后的DNA修复。第一种方法是制备具有组成性破坏的基因敲除小鼠Parp1基因功能或将DNA转染到培养细胞中以进行有条件的破坏Parp1．第二种方法是使用特定的抑制剂来抑制Parp。然而，前一种方法，当用于培养细胞时，涉及到DNA转染，这本身就会对细胞中的其他基因造成损害。对于后一种方法，Parp1抑制剂对poly(adp -核糖)合成的影响有待证实。poly(adp -核糖)合成反应消耗细胞内NAD作为底物，因此，胞内NAD的定量可以作为poly(adp -核糖)合成反应的指标。伯杰等．先前有报道称，当L1210细胞被烷基化剂MNNG(2µg/mL)处理后，30分钟后细胞内NAD的量下降到正常水平的50%左右[10]。此外，应et al。当L1210细胞接受100 Gy的辐照时⁶⁰Co作为辐射源，30分钟后细胞内NAD量下降到正常水平的50%左右[11]。这里按照桑蒂描述的方法等.，采用高效液相色谱(HPLC)分离细胞内核苷酸，并定量测定NAD水平[12]。

材料与方法

细胞培养，伽马射线照射，流式细胞术

本研究使用C3D2F1 3T3-a细胞系，该细胞系是由C3H/HeJ和DBA/2J小鼠14日龄胚胎建立的成纤维细胞系[13]。这些细胞是由旭川医科大学的Katsuhiro Ogawa教授及其合作者建立并提供的。细胞用ICN Biochemical Inc.的DMEM[13]培养。Costa Mesa, CA, USA)，含有10%胎牛血清(FBS)，并添加1%青霉素/链霉素。细胞每3天传代一次。翻倍时间约为17小时。据报道，该细胞系的外显子5至外显子9没有突变p53基因(5,13)。Swiss 3T3[14]、FM3A克隆28[15]和NRK49F[16]细胞也用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基培养。将细胞在含0.25% FBS的培养基中孵育44小时，更换含10% FBS的培养基释放细胞，4小时后进行化学处理。用脉冲标记法测定DNA合成^3.H]-胸苷(New England Nuclear)和三氯乙酸沉淀法。细胞用a照射⁶⁰Co辐射器，1gy /min。在γ辐照后的选定时间，用10µM溴脱氧尿苷(BrdU, Sigma)脉冲细胞30分钟，分析细胞周期状态。照射后，收获细胞，70%乙醇固定，4n盐酸变性，RNase A处理，fitc共轭抗brdu抗体(Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)和碘化丙啶(Sigma)染色，然后使用FACScan (Beckton Dickinson)进行二维流式细胞术分析。

化学物质

3-氨基苯甲酰胺(3- ab)购自东京化学工业株式会社(东京，日本)。单宁酸购自Wako Chemicals (Tokyo, Japan)。

高效液相色谱法测定细胞内NAD

C3D2F1 3T3-a细胞在播种两天后用伽马射线照射。用PBS(-)收集细胞微球[10]，悬浮在100 mL 0.3 M三氯乙酸中，放置在冰上30分钟，每隔1分钟大力搅拌[11]。离心后，将上清液与含有0.5 M三氟的1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)按等量剧烈搅拌n-辛胺(日本东京化学工业株式会社)然后将酸中和[12]，将酸溶部分提取物调整至细胞浓度为3 × 10⁶每100毫升细胞数。

样品采用Partisil 10- sax色谱柱分离，4.6 mm × 250 mm，粒径10µm (Sumitomo Analysis Center, Osaka, Japan)。低浓度缓冲液(7 mM NH)₄H₂阿宝₄(pH 3.8)和高浓度缓冲液(250 mM NH)₄H₂阿宝₄以500 mM KCl, pH 4.5)作为洗脱液。将样品注射后，在低浓度缓冲液中洗脱6分钟。随后，样品在从低浓度到高浓度的缓冲液中梯度洗脱30分钟。在此梯度下，用高浓度缓冲液洗涤24min。流速为3ml /min，使用TOYO SODA UV-8000，波长为254 nm进行检测。洗脱NAD，保留时间为6 min。利用光电二极管阵列分析其紫外吸收峰，发现其与NAD相匹配。因此，确认单峰为NAD。NADH和NADP的洗脱时间分别为13.3 min和17.9 min，与NAD不同。

结果

延迟治疗3-AB对G1停搏抑制作用的影响

我们之前的研究表明，在γ辐照前2小时将3-AB添加到C3D2F1 3T3-a细胞中，在γ辐照后12小时观察到G1停止和G2停止增强。如图1A所示，我们分析了4 mM 3-AB添加时间对C3D2F1 3T3-a细胞2 Gy γ辐照后G1阻滞抑制的影响。随着添加时间的延迟，抑制G1骤停的效果降低，在照射后6小时添加3-AB时，抑制G1骤停的效果几乎完全丧失。

图1所示。3-AB对γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞周期阻滞和s期进入及进展抑制的影响。A. 4 mM 3-AB添加时间对C3D2F1 3T3-a细胞2 Gy辐照后12小时G1阻滞抑制的影响。B.血清饥饿同步的C3D2F1 3T3-a细胞8 Gy γ辐照后，4 mM 3-AB预处理2小时对DNA合成的影响

我们进一步通过同步血清饥饿测试了γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞的DNA合成时间(图1B)。同步细胞经4 mM 3-AB预处理2小时，8 Gy辐照后，模拟辐照细胞和辐照细胞在无3-AB或有3-AB的情况下，在血清饥饿释放后16小时均出现DNA合成高峰，而γ辐照细胞的DNA合成比例下降，3-AB预处理略微增强了DNA合成的减少。

3-AB对不同细胞系细胞周期阻滞的影响

已知C3D2F1 3T3-a细胞具有功能性的p53依赖性信号转导通路。我们检测了细胞类型对γ辐照诱导的细胞周期阻滞的影响(图2和表1)。当使用小鼠胚胎成纤维细胞Swiss 3T3细胞时，我们观察到，与C3D2F1 3T3-a细胞一样，在γ辐照后12小时，用4 mM 3-AB预处理G1阻滞抑制。然而，当使用小鼠乳腺肿瘤源性FM3A和大鼠肾源性NRK49F细胞时，在1-2 Gy的低剂量下，4 mM 3-AB预处理的γ照射后12小时未观察到G1阻滞抑制，但在4 Gy或更高剂量下可以观察到。与C3D2F1 3T3-a细胞和NRK49F细胞的情况一样，4mm 3-AB预处理在2 Gy及更高剂量下对瑞士3T3和FM3A细胞的G2阻滞增强作用仅在4 Gy下观察到。

图2。3-AB对γ辐照后12h细胞周期阻滞的影响。A, Swiss3T3细胞。B, FM3A细胞。C, NRK49F细胞

表1。3-AB对γ辐照后12小时细胞周期阻滞的影响

	细胞周期期变化%*
	G1		G2
细胞系	-	3-AB (4mm)	-	3-AB (4mm)
C3D2F1 3 t3-a	11.3	-6.2	10.0	13.0
瑞士3 t3	5.1	-0.4	-2.5	5.0
FM3A	8.2	12.8	3.1	6.6
NRK49F	12.1	13.9	1.1	-0.5

*(γ辐照细胞的细胞周期期%)-(模拟辐照细胞的细胞周期期%)

通过测定NAD水平评估Parp活性抑制

为了证实3-AB对Parp活性的抑制作用，我们测量了γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞NAD水平的变化。初步研究在C3D2F1 3T3-a细胞中测量伽玛射线照射后细胞内NAD量的变化[17]。播种2天后，分别用10 Gy、100 Gy和200 Gy的伽马射线照射细胞。30分钟后，高效液相色谱法测定NAD。结果显示，在10 Gy作用下，细胞内NAD水平未见明显变化。然而，NAD水平呈剂量依赖性下降，100 Gy和200 Gy分别导致NAD下降40%和60%(数据未显示)。本研究表明，为了检测由于Parp-1活性引起的NAD的减少，200gy辐照是必要的。图3A为C3D2F1 3T3-a细胞胞内核苷酸池的HPLC分离图。

图3。γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞内NAD降低的测量。A. C3D2F1 3T3-a细胞胞内核苷酸的HPLC洗脱图谱。纵轴为254 nm处吸光度，横轴为保留时间(min)。Bar表示吸光度为0.001。B. NAD的校准曲线。纵轴表示峰值面积(任意单位)，横轴表示纯化-NAD的量(nmol)。C. 3-AB对γ辐照后30min细胞内NAD水平下降的抑制作用。C3D2F1 3T3-a细胞接受200 Gy γ辐照，定量测定NAD水平。在1-10 mM处加入3-AB

因此，为了确认3-AB是否对细胞内poly(adp -核糖)合成有抑制作用，在200 Gy照射前1 h分别加入1 mM、4 mM和10 mM的3-AB。照射30 min后收集细胞，定量测定细胞内NAD水平。在未处理的情况下，细胞内NAD水平约为0.7 nmol/2.3 × 10⁶细胞。添加1 mM 3-AB后，γ辐照引起的NAD水平下降被抑制约40%，添加4 mM 3-AB后，NAD水平下降被抑制近100%(图2)。

单宁酸对γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞周期阻滞的影响

为了评估poly(adp -核糖)的分解代谢过程，我们分析了[8,9]对γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞的细胞周期阻滞的影响。2 Gy γ辐照前2小时，在C3D2F1 3T3-a细胞培养基中加入50µg/ml单宁酸，孵育12小时。在照射12小时后收获前，用BrdU对细胞进行30分钟的脉冲标记，并用二维流式细胞术进行分析。进一步分析不同浓度单宁酸对2 Gy辐照后细胞周期阻滞的影响。如图4A和B所示，单宁酸对C3D2F1 3T3-a细胞的G1阻滞没有抑制作用，对G2阻滞也没有增强作用。

图4。单宁酸对γ辐照后C3D2F1 3T3-a细胞周期阻滞的影响。2 Gy γ辐照前2小时，在C3D2F1 3T3-a细胞培养基中加入50µg/mL单宁酸，孵育12小时。A.照射后12小时收获前，用BrdU脉冲标记细胞30分钟，用二维流式细胞术分析。B.分析不同浓度单宁酸对2 Gy辐照后细胞周期阻滞的影响

讨论

聚(adp -核糖)聚合酶(Parp)抑制剂3-AB预处理抑制γ辐照后小鼠胚胎成纤维细胞C3D2F1 3T3-a细胞G1阻滞，增强G2阻滞。3-AB先前显示有部分抑制作用Waf1 p21 / Cip1 /和Mdm2几种细胞系的mRNA诱导。Waf1 p21 / Cip1 /和Mdm2mRNA被p53蛋白转录激活。据报道，C3D2F1 3T3-a细胞的外显子5至外显子9没有突变p53基因和p53依赖通路似乎正常[13]。在该细胞系中，有研究表明poly(adp -核糖基化)参与γ辐照后p53依赖性信号转导的下游过程[7]。为了阐明poly(adp -核糖基化)在γ辐照后细胞周期阻滞中的作用，我们进一步分析了3-AB在C3D2F1 3T3-a细胞以及其他细胞系中的作用。根据预测p53在诱导的作用Waf1 p21 / Cip1 mRNA在照射后1-3小时加入3-AB后，抑制G1的作用减弱，照射后6小时加入3-AB后，抑制G1的作用完全消失。值得注意的是，当血清饥饿同步C3D2F1 3T3-a细胞，在8 Gy的γ辐照下，DNA合成的峰值时间没有改变，但DNA合成的比例下降，其中3-AB预处理略微增强了这一比例的下降。在这个有限的实验条件下，DNA损伤发生在G0期，这可能会影响DNA损伤类型，包括单链和双链DNA断裂，并影响细胞周期阻滞谱。

我们还分析了3-AB在不同类型细胞系中的作用。在γ辐照后，3-AB以剂量无关的方式降低小鼠胚胎成纤维细胞Swiss3T3细胞的G1阻滞，而在低剂量下，FM3A和NRF49F细胞的G1阻滞不受影响。在瑞士3T3和FM3A细胞中，3-AB预处理对G2阻滞的增强作用与剂量无关，在4 mM G2阻滞增强的情况下，3-AB预处理仅在4 Gy而不是1-2 Gy下观察到。

为了证实3-AB对Parp活性的抑制作用，我们还尝试用HPLC定量细胞内NAD。在此之前，我们使用商业纯化的β-NAD，通过HPLC建立了NAD的定量范围;这个范围在0到2.5纳摩尔之间。伽玛射线照射导致细胞内大量DNA链断裂。DNA链断裂导致多聚核糖(adp -核糖)合成立即在细胞核内开始。我们验证了γ射线照射后被激活的poly(adp -核糖)合成是否被Parp抑制剂3-AB抑制。在我们的实验中，poly(adp -核糖)的合成伴随着NAD的消耗;因此，我们使用高效液相色谱法定量细胞内NAD水平，作为poly(adp -核糖)合成活性的指标。我们的研究结果表明，200 Gy辐照后NAD水平的下降与3-AB的浓度有关，并且在4 mM 3-AB浓度下几乎完全被抑制。我们的研究表明，细胞内聚(adp -核糖)合成反应被浓度为4 mM的3-AB完全抑制，相反，抑制剂对聚(adp -核糖)合成的抑制作用被浓度为10 mM的3-AB轻微抑制。 The problem with using inhibitors is that it is difficult to determine if the inhibitor really inhibits the activity of the target enzyme inside the cell and whether the inhibitor inhibits the target enzyme exclusively. Therefore, it is desirable that the inhibitor fully suppresses the activity of the target molecule and can be used at concentrations as low as possible. HPLC allows for separating intracellular nucleotides; it also allows for determining the overall variations of intracellular nucleotides. Importantly, 4 mM 3-AB showed no marked influence on intracellular metabolism that was likely to affect intracellular nucleotides other than NAD. In our study, 4 mM was thus considered the optimal concentration for 3-AB.

为了了解poly(adp -核糖)分解代谢过程对C3D2F1 3T3-a细胞的影响，我们分析了γ辐照对细胞周期阻滞的影响。在γ辐照后的细胞周期阻滞中，聚(adp -核糖)可能不是关键的，尽管需要对特异性Parg抑制剂进行进一步的研究。

在这项研究中，我们使用永生化细胞研究了γ辐照后多聚(adp -核糖基化)在癌细胞中的作用，该细胞保留了基本的p53依赖的信号转导途径。综上所述，目前的结果表明，Parp抑制剂的作用和poly(adp -核糖基化)在γ辐照后G1阻滞中的作用取决于细胞表型。

致谢

这项工作得到了next KAKENHI (15K14416)和太极生命社会福利基金会的部分资助．

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