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摘要

顺铂化疗容易诱导肿瘤细胞产生耐药表型。在p53缺陷的肿瘤细胞中，顺铂导致G2阻滞，使细胞修复DNA损伤。我们试图观察Chk1抑制剂或紫杉醇(PTX)如何修饰顺铂诱导的G2阻滞，并研究其对亲代和顺铂耐药肿瘤细胞存活的影响。我们使用表达荧光泛素化细胞周期指示物(Fucci)的HeLa细胞。顺铂耐药HeLa- fucci (CR)细胞通过与顺铂剂量逐步增加的亲代HeLa细胞孵育建立。荧光显微镜获得延时图像，菌落形成法测定存活部分。顺铂治疗导致亲代细胞聚集绿色细胞，代表G2阻滞，而与Chk1抑制剂联合治疗则取消了这一效果，导致显著的敏化。CR细胞未表现出G2阻滞，Chk1抑制剂不影响细胞周期，伴随生存期轻微降低。在有丝分裂中，PTX以相似的程度抑制两种细胞，荧光异常;然而，当顺铂联合使用时，亲代细胞在进入有丝分裂前的G2期被阻滞，而CR细胞则没有。 Moreover, cell survival increased in parent cells, but not in CR cells, relative to treatment with PTX alone. In conclusion, we should carefully consider G2 arrest kinetics, depending on the presence or absence of cisplatin resistance, in efforts to sensitize cells to cisplatin-based chemotherapy.

关键字

顺铂，G2阻滞，DNA损伤，顺铂耐药，荧光泛素化细胞周期指示器(Fucci)

简介

顺铂是一种常用的化疗药物，与DNA[1]形成单加合物、链内交联和链间交联。在这些病变中，链间交联是导致细胞死亡的主要原因，尽管其产量相当低[1-3]。这些病变可以激活细胞周期检查点，介导修复DNA损伤[4]所需的细胞周期阻滞。特别是，p53功能障碍的肿瘤强烈依赖于G2/M检查点激活[5,6]。因此，取消G2/M检查点可能导致p53缺失的顺铂治疗肿瘤细胞的致敏;因此，Chk1和Wee1抑制剂被开发为dna损伤剂的增敏剂[6,7]。另一方面，顺铂在许多类型的肿瘤细胞中诱导耐药表型;其潜在机制已得到充分研究，包括药物外排增加、解毒增强、DNA修复增强和致癌基因[8]的改变。然而，G2/M检查点抑制对亲代细胞和顺铂耐药细胞药敏的差异影响尚不清楚。此外，紫杉醇(PTX)是一种抗微管药物，在临床中经常与顺铂联合使用[9]。 PTX agent arrests cells in mitosis [10]; therefore, complicated cell-cycle kinetics should be induced when PTX and cisplatin are combined.

Sakaue-Sawanoet al。开发了利用荧光蛋白可视化细胞周期进展的Fucci方法:在G1和其他阶段表达Fucci的细胞分别发出红色和绿色荧光，[11]，使我们能够检测活细胞中细胞周期阶段的变化。利用该系统，我们利用表达Fucci探针(HeLa-Fucci)的HeLa细胞和亲代HeLa-Fucci细胞(CR)衍生的顺铂耐药细胞系，探索了G2/M检查点调制对G2阻滞和细胞存活的影响。为了简单起见，我们将重点放在G2阻滞仅发生在一定剂量顺铂后亲代细胞的条件下，然后探讨上述效应。

材料与方法

细胞系和培养条件

表达Fucci探针的HeLa细胞(HeLa-Fucci细胞)通过日本MEXT国家生物资源项目从理研生物资源中心获得。细胞保持在37°C, 5% CO₂在DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)中添加10%的胎牛血清。

顺铂耐药细胞系的建立

HeLa-Fucci细胞接种于100mm培养皿中，在增加浓度的顺铂(Sigma-Aldrich)中继代培养。简单地说，细胞先在0.1μM顺铂中培养，每周更换含顺铂的培养基两次。存活的细胞每周传代一次。0.1μM顺铂处理7次后，浓度增加至0.2μM，重复处理2次。最后，浓度增加到0.4mM，存活超过16次的细胞被指定为顺铂耐药(CR)细胞。一般情况下，CR细胞经0.4μM顺铂处理约50次。

53BP1免疫染色

在Lab-Tek腔载玻片(Nunc, Rochester, NY, USA)上生长的细胞用20μM顺铂处理1h。细胞在无顺铂条件下孵育，处理后按指示时间在4%多聚甲醛中固定30min。固定细胞在抗53bp1抗体(1:50 00)(Abcam, Cambridge, MA, USA)中培养1h。在tris缓冲盐水和Triton X-100(TBS-T)中大量洗涤后，细胞在与Alexa Fluor 647(1:500)结合的抗兔IgG中孵育30分钟(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)。最后，载玻片在TBS-T中洗涤，并使用带有DAPI的延长金抗褪色试剂(Life Technologies)安装。使用BIOREVO BZ-9000荧光显微镜(KEYENCE, Osaka, Japan)观察荧光。

药物治疗和延时成像

细胞在35mm塑料培养皿中单独用5μM顺铂处理1h或在5μM顺铂存在的前1h中使用300nM Chk1抑制剂(PF-00477736) (Sigma-Aldrich)处理24h。用20nM紫杉醇(PTX) (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)处理细胞，在加入或不加入5μM顺铂的情况下处理24h。每次治疗后立即使用BIOREVO BZ-9000荧光显微镜(KEYENCE)对药物处理的细胞进行延时成像。为了进行延时成像，细胞被置于37°C含5% CO的潮湿空气中的孵育室中₂(日本Fujinomiya Tokai Hit)。每2小时采集一次图像。

克隆形成实验

药物处理后，将细胞胰蛋白酶化，取适量细胞置于60 mm的培养皿中。孵育10-14天后，菌落固定并在结晶紫溶液中染色。计数超过50个细胞的菌落，计算三次重复的存活分数。

统计分析

学生的t-test用于统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

顺铂耐药细胞的特性

首先，我们建立了耐顺铂的HeLa-Fucci (CR)细胞，该细胞能够在含有0.4μM顺铂的培养基中生长，如材料和方法所述。在指数生长期亲代细胞和CR细胞的形态如图1A所示。亲本细胞和CR细胞表现为上皮鹅卵石样(图1Aa)和间充质梭状(图1Ab)形态学。CR细胞在含有0.4μM顺铂的培养基中可以正常生长，而亲代细胞则不能(图1B)。通过菌落形成试验，观察到0.4mM顺铂处理16次细胞对顺铂的耐药;细胞在重复处理超过16次后没有表现出额外的耐药性(图1C)。我们接下来检查了顺铂治疗后DNA双链断裂(DSBs)的动力学(图1D)，它是在链间交联修复[3]的过程中形成的。53BP1作为DSBs[12]的标记。亲代细胞和CR细胞都表现出小的53BP1病灶，代表dsb，但每个细胞存在不到20个病灶。处理30分钟后，亲代细胞中检测到超过20个dsb的细胞，且至少在处理24小时后数量增加。 By contrast, in CR cells, the increment in foci number was first observed 24h after treatment. These results suggest that some mechanisms [8] might ultimately lead to lower induction of DSBs in CR cells, resulting in cisplatin resistance.

图1所示。顺铂耐药HeLa-Fucci (CR)细胞的特性
a .指数增长的亲代(a)和CR (b)细胞的形态。B.亲代细胞和CR细胞在含顺铂培养基中的生长曲线。在含0.4μM顺铂的培养基中计数亲代细胞和CR细胞。数据表示三份重复样本的平均值S.D.。C.顺铂治疗后亲本细胞和CR细胞的剂量-细胞存活曲线。CR16、CR50、CR53分别为0.4μM顺铂的治疗次数。细胞用指示剂量的顺铂处理1h，按照材料和方法中所述进行菌落形成试验。数据表示三份重复样本的平均值S.D.。D.顺铂治疗后亲代细胞和CR细胞DNA双链断裂(DSBs)动力学。用20μM顺铂处理细胞1h，在处理后指定时间免疫染色53BP1作为dsb标记。 Histograms of fluorescence foci numbers are shown.

顺铂或PTX单独治疗后的Fucci荧光动力学

如导言所述，我们选择了顺铂治疗条件(5μM, 1h;根据图1C)，亲代细胞在G2期被阻滞，而CR细胞继续生长。单用顺铂治疗后，我们监测荧光的变化(图2)。亲代细胞绿色细胞数量逐渐增加，代表G2阻滞，在治疗后16 h左右达到峰值。DNA含量的流式细胞分析证实了这一观察结果(数据未显示)。另一方面，CR细胞未表现出明显的绿色细胞积累(图2A,2B)。

图2。单用顺铂或PTX治疗亲代细胞和CR细胞的荧光动力学
A.单独顺铂治疗后亲代细胞和CR细胞的荧光成像。5μM顺铂处理细胞1h，处理后拍照。B.处理后红细胞和绿细胞比例的定量分析。绿色和红色细胞的百分比被绘制为治疗后时间的函数。左面板，亲本细胞;右边是CR细胞。C.单独PTX处理亲代细胞和CR细胞的荧光成像。用20nM的PTX处理细胞24h，并在处理过程中拍摄荧光图像。D.治疗过程中红色(间期)、绿色(间期)和有丝分裂细胞比例的定量分析。绿色细胞(间期)、红色细胞(间期)和有丝分裂细胞的百分比被绘制为治疗后时间的函数。 Left panel, parental cells; right panel, CR cells.

PTX是一种抗微管剂，阻止有丝分裂中生长的细胞，导致有丝分裂灾难[10]。PTX常与顺铂联合应用于临床[9]。我们之前报道过HeLa-Fucci细胞在抗微管药物治疗后有丝分裂时产生异常荧光:也会发出红色荧光，这在正常情况下不会发生，只会发出绿色荧光[13]。当两种细胞均用PTX处理时，我们观察到许多有丝分裂圆细胞在治疗开始24小时后表现出异常荧光(图2C,2D)。

Chk1抑制剂对顺铂诱导的细胞周期动力学和细胞存活的影响

当能够释放G2阻滞的Chk1抑制剂与顺铂联合治疗时，亲代细胞中未检测到绿色细胞的积累(图3A,3B)。同样，CR细胞中未检测到变化(图3A,3B)。在亲代细胞中观察到存活率显著降低，但在CR细胞中没有。单独使用Chk1抑制剂对细胞存活没有任何影响(图3C)。

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图3。Chk1抑制剂联合顺铂治疗的效果
A.顺铂联合Chk1抑制剂治疗亲代细胞和CR细胞的荧光动力学。用300nM的Chk1抑制剂在5μM顺铂的存在下处理细胞24h，在处理过程中按指示时间拍摄荧光图像。B.联合处理时红绿细胞比例的定量分析。绿色和红色细胞的百分比被绘制成治疗过程中时间的函数。左面板，亲本细胞;右边是CR细胞。C.存活部分，在与延时成像相同的条件下通过菌落形成试验确定。数据表示三份重复样本的平均值S.D.。* * * p < 0.01, p < 0.001。

顺铂和PTX联合治疗对细胞周期动力学和细胞存活的影响

在亲代细胞中，当顺铂和PTX联合使用时，绿色细胞数量增加，治疗后24h几乎检测不到有丝分裂细胞;相比之下，CR样品中观察到异常的有丝分裂细胞(图4A,4B)，与单独使用PTX处理后观察到的情况类似(图3A,3B)。此外，亲代细胞的存活部分较单独PTX处理的细胞明显增加。经过同样的处理后，CR细胞的存活率没有变化(图4C)。

图4。PTX联合顺铂治疗的效果
A.顺铂和PTX联合治疗亲代细胞和CR细胞的荧光动力学。在5μM顺铂存在的情况下，用20nM的PTX处理细胞24h，在处理过程中的指定时间拍摄荧光图像。B.联合治疗中绿色(间期)、红色(间期)和有丝分裂细胞比例的定量分析。绿色细胞(间期)、红色细胞(间期)和有丝分裂细胞的百分比被绘制为治疗期间的时间函数。左面板，亲本细胞;右边是CR细胞。C.存活部分，在与延时成像相同的条件下通过菌落形成试验确定。数据表示三份重复样本的平均值S.D.。* * p < 0.001;备注:不显著。

讨论

顺铂是一种应用广泛的化疗药物，在各种肿瘤中比较容易诱导顺铂耐药[8]。目前，G2/M检查点抑制剂正被开发用于增敏肿瘤细胞，特别是p53缺失的肿瘤细胞，PTX常与顺铂联合使用以增加细胞敏感性[9]。然而，尚不清楚G2/M检查点抑制剂或PTX如何影响顺铂敏感和耐药细胞。在本研究中，我们聚焦于G2阻滞仅发生在特定顺铂剂量后的敏感细胞的情况，并研究了Chk1抑制剂或PTX联合治疗如何影响顺铂敏感和耐药细胞的细胞周期动力学和存活。

此前，固定后制备单细胞悬液需要进行流式细胞分析，以检测暴露于dna损伤剂[14]后的G2阻滞。然而，Fucci系统允许我们观察绿色细胞的积累作为活细胞中G2阻滞的标记，使用该系统[11]，我们可以很容易地检测到顺铂诱导的亲代细胞中的G2阻滞(图2)。在亲代细胞中，当联合使用Chk1抑制剂时，也可以清楚地观察到G2阻滞的解除(图2);相比之下，CR细胞没有表现出任何变化。细胞存活分析显示，G2阻滞有助于亲代细胞的存活，但诸如顺铂与DNA结合减少或CR细胞中DNA修复[8]增强等因素可能最终将DNA损伤降低到激活G2阻滞所需的阈值水平以下。Fucci系统还在PTX单独治疗后的亲代细胞和CR细胞中检测到相似的细胞周期动力学，伴随着相似的细胞存活水平(图4)。我们有理由预测，与顺铂联合治疗只会在亲代细胞中阻止细胞周期在G2期:因为PTX杀死有丝分裂[10]中的细胞，在G2期停止的细胞能够在我们使用的条件下逃脱PTX诱导的细胞死亡。这也许可以解释亲代细胞存活的增加。顺铂对CR细胞的细胞周期动力学无影响;因此，存活分数与单独PTX处理相同。

总之，我们能够看到顺铂单独或与Chk1抑制剂或PTX联合治疗后，亲代细胞和CR细胞中的G2阻滞动力学。此外，我们证明了G2/M检查点抑制剂不一定影响顺铂耐药细胞的存活;相反，顺铂诱导的G2阻滞可能抑制ptx诱导的顺铂敏感细胞死亡。因此，在使细胞对以顺铂为基础的化疗增敏时，应仔细考虑顺铂诱导的G2阻滞动力学，这取决于顺铂耐药的存在或不存在。

确认

我们感谢A. Miyawaki博士和A. Sakaue-Sawano博士提供表达Fucci探针的HeLa细胞。

资金信息

本研究部分由墨西哥科技部科学研究资助基金(26861569,26293399，和25670796)提供给A.K.和M.M.

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