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摘要

目的:低亲和力n -甲基- d -天冬氨酸受体拮抗剂美金刚胺是治疗阿尔茨海默病的主要药物之一。为了探索美金刚胺的新作用，我们分析了美金刚胺对成神经细胞瘤细胞活力、细胞生长和蛋白谱的影响。方法:采用GIMEN人成神经细胞瘤细胞系。GIMEN细胞在1-100 mM美金刚胺存在或不存在的情况下培养48小时。通过计算细胞数量来评价美金刚胺对细胞活力和生长的影响。从经10 mM美金刚胺处理或未处理的GIMEN细胞中提取蛋白质，用二维差分图像凝胶电泳(2D-DIGE)分离。用质谱法对感兴趣的蛋白质点进行蛋白质鉴定。结果:在1 ~ 10 mM美金刚胺的作用下，GIMEN细胞的活力大于等于99.0%。在100 mM美金刚胺的存在下，其活力略有下降(97.5%，p<0.01)。而美金刚胺对细胞生长的抑制作用呈剂量依赖性(2 ~ 100 mM, 85.5 ~ 63.0%; 2-10 mM, p<0.05; 20-100 mM, p<0.01). For the protein profile analysis, we used GIMEN cells treated with 10 mM memantine which showed the viability of 99.4% and the growth of 76.1%. As a result, 892 protein spots were detected in the 2D-DIGE results of 10 mM memantine-treated and non-treated GIMEN cells. 13 protein spots showed 1.2-fold or higher intensity and 19 protein spots showed -1.2 (1/1.2)-fold or lower intensity in the memantine-treated cells than in the non-treated cells (p<0.05). We identified proteins in 7 out of the 32 spots: coronin-1C (1.44-fold increased), β-actin (-1.21-fold decreased), g-enolase (-1.21-fold decreased), glutathione synthetase (-1.28-fold decreased), spermatogenesis-associated protein 24 (-1.46-fold decreased), and V-set transmembrane domain-containing protein 2B (-1.46-fold decreased). Interestingly, β-actin, g-enolase, and glutathione synthetase are known to be involved in cell proliferation. Conclusion: Memantine suppressed the growth of GIMEN cells and affected their protein profiles. Our data suggested a novel action of memantine to suppress the neuroblastoma cell growth, which may be associated with the decreased expression of β-actin, g-enolase, and glutathione synthetase.

关键字

阿尔茨海默病，细胞生长，质谱分析，美金刚体，成神经细胞瘤细胞，蛋白质图谱

简介

阿尔茨海默病(Alzheimer 's disease, AD)是一种神经退行性疾病，是导致痴呆的主要原因[1,2]。尽管AD的病因尚不明确，但据信与细胞外淀粉样β (Aβ)肽沉积和细胞内tau蛋白[2]过度磷酸化导致的老年斑和脑内神经纤维缠结的形成有关。针对这些异常肽/蛋白的疫苗或抗体以及干扰β淀粉样肽产生的β-分泌酶或g-分泌酶抑制剂正在研究用于治疗AD[3]。然而，这些药物都没有带来[4]的根本性突破。胆碱酯酶抑制剂和n -甲基d -天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂是目前AD的主要治疗药物，其中NMDA具有独特的神经保护作用[4,5]。

NMDA受体是离子通道型谷氨酸受体的一种，在神经元通信中起着至关重要的作用。到目前为止，已经确定了7种不同的NMDA受体亚基:NR1、NR2A-D、NR3A和B[6,7]。NMDA受体是异四聚体，由两个NR1亚基和两个NR2亚基或两个NR1亚基和NR2和NR3亚基的混合物[6]组成。甘氨酸和谷氨酸分别与NR1和NR2结合，为了激活受体[7]，甘氨酸位点必须在谷氨酸结合前被占据。非选择性阳离子通道的NMDA受体具有高钙的潜能^{2 +}渗透率[6]。在休息,毫克^{2 +}与NMDA受体结合以阻止激活。在突触膜去极化充分时，Mg^{2 +}以电压依赖的方式与NMDA受体分离[6,7]。同时，谷氨酸必须与受体结合才能激活它们。激活NMDA受体打开钙离子通道^{2 +}内流介导长期强化(LTP)[6,8]。LTP在学习和记忆形成过程中起着至关重要的作用[8]。

在AD患者的大脑中，Aβ肽通过增加突触前神经元的谷氨酸释放、诱导星形胶质细胞和小胶质细胞释放谷氨酸以及抑制星形胶质细胞和小胶质细胞对谷氨酸的摄取，介导细胞外谷氨酸的增加[9,10]。突触NMDA受体和另一种离子通道型谷氨酸受体α-氨基-3-羟基-5-甲基异恶唑-4-丙酸(AMPA)受体的长期激活，导致它们的脱敏和内化，导致突触抑制。最后，过量谷氨酸会激活突触外NMDA受体，导致多种下游有害事件，包括细胞死亡和LTP损伤[6,9]。过度磷酸化的tau蛋白靶向磷酸化NR2B的受体蛋白激酶Fyn，以稳定它们与突触后密度95 (PSD95)的联系，从而增强Aβ肽诱导的上述谷氨酸能兴奋毒性。

美金刚胺是一种低亲和力、电压依赖、非竞争性的NMDA受体拮抗剂，目前用于治疗中重度AD[6,11,12]。与其他NMDA受体通道阻滞剂相比，美金刚胺的亲和力高于Mg^{2 +}，但亲和力低于氯胺酮、苯环利定和MK-801[13]。当通道过度开放时美金刚胺优先进入NMDA受体通道[14]。因此，美金刚胺可以抑制钙^{2 +}阻断由相对较低的补强水平谷氨酸诱导的通道活动[11-13]。这可能有助于改善AD的症状，并保护神经元细胞免受谷氨酸能兴奋性毒性[12,13]。最重要的是，美金刚胺从NMDA受体的脱出速率相对较快，这使得受体的生理功能得以保存，包括LTP的表达[11,14]。被美金刚胺阻断的NMDA受体可被突触前神经元去极化后释放的高浓度谷氨酸激活[11,13]。

除了上述作为NMDA受体拮抗剂的作用外，美金刚胺还被发现影响神经元细胞的蛋白表达。美金刚胺降低Aβ前体蛋白(APP)、APPα亚型和Aβ的水平_1-40从成神经细胞瘤细胞分泌，降低淀粉样蛋白Aβ_1-42原代大鼠皮质神经元培养中的分泌[15,16]。美金antine还能抑制和逆转蛋白磷酸酶2A抑制诱导的大鼠海马切片[17]有机型培养中tau蛋白的异常过磷酸化和积累。此外，美金刚胺还影响大鼠和小鼠大脑中生理表达的基因/蛋白质[18,19]。然而，迄今为止，尚未对美金刚胺作用下的人神经细胞生理表达蛋白进行全面研究。重要的是收集有关美金刚胺分子药理学的信息，以了解其作用和预测潜在的不良影响。

在这项研究中，我们分析了美金刚胺对成神经细胞瘤细胞活力、生长和蛋白质谱的影响。我们发现美金刚糖几乎不影响细胞活力，但降低细胞生长呈剂量依赖性。美金刚胺改变了成神经细胞瘤细胞的蛋白谱，至少改变了6种蛋白的表达水平。我们的研究结果表明美金刚胺具有新的作用，这可能是AD治疗成功的基础。

材料和方法

细胞培养

本研究使用的是GIMEN (CLS cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Germany)的人成神经细胞瘤细胞系。GIMEN细胞在添加10%胎牛血清的DMEM中培养。为了研究美金刚胺对细胞活力和增殖的影响，GIMEN细胞在1-100 mM美金刚胺存在或不存在的情况下培养48小时。具体来说，这些细胞被镀到一个96孔板上，网址是7.0×10⁴细胞/厘米²．然后用含或不含1-100 mM美金刚胺的不含fbs的DMEM代替培养基。培养48小时后，以活细胞数与总细胞数之比计算细胞活力。细胞生长以存活细胞数(48小时)与种子细胞数(2.2 x 10)之比计算⁴细胞，在0小时)。为了进行二维差分图像凝胶电泳(2D-DIGE)、细胞因子阵列和ELISA，细胞在存在或不存在10 mM美金刚胺的情况下培养48小时。所有实验均为3个重复。

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

使用TaqMan基因表达细胞- ct试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)和ExTaq (Takara Bio Inc.，滋贺，Japan)进行RNA提取和RT-PCR。NMDA受体亚基和18S核糖体RNA引物序列先前有报道[20]。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离。

2 d-dige

从GIMEN细胞中提取的蛋白质用2D-DIGE分离，如前所述[21]。简单地说，从6个裂解物(3个经过10 μM memman处理的和3个未处理的)中提取同等重量的蛋白质，混合并用氰基染料3 (Cy3, Cy dye DIGE饱和染料，GE Healthcare，白金汉郡，英国)标记，制备内部控制“标准样品”。6个样本中的每一个都用氰基染料5 (Cy5, GE Healthcare)标记。2.5 mg cy5标记样品与2.5 mg cy3标记标准样品混合。然后将每个混合蛋白样本应用于等电聚焦(IEF)凝胶条(Immobiline干燥条pH值3-11,24 cm，非线性，GE Healthcare)。用IEF分离蛋白后，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分离。使用图像分析仪(Typhoon 9400 Imager, GE Healthcare)对合成的蛋白质斑点进行扫描。通过使用定量分析程序(Progenesis，非线性动力学，纽卡斯尔，英国)，将每个蛋白点的cy5荧光强度归一化为一个相同点的cy3荧光强度。用Progenesis比较了经memantine处理和未处理样品的归一化cy5荧光强度。

蛋白质识别

蛋白经质谱(MS)鉴定[21]。简单地说，用二维电泳分离了50毫克的蛋白质。与感兴趣的蛋白斑点相对应的凝胶标本被回收。然后用胰蛋白酶消化凝胶碎片中的蛋白质。利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/MS) (Ultraflex, Bruker Daltonics, Ettlingen, Germany)分析消化产生的多肽。在质谱分析的基础上，选取多肽进行MS/MS分析。用MS和MS/MS谱图对瑞士Prot人蛋白序列数据库进行数据库检索(Mascot, http://www.matrixscience.com)。当MASCOT搜索结果提供显著的MOWSE评分(p<0.05)时，接受蛋白质鉴定。

美金刚胺对GIMEN细胞分泌体液因子的影响

用细胞因子阵列(Human neural Discovery array C1, RayBiotech, Norcross, GA, USA)重复测量培养上清中的体液因子。分析的体液因子如下:BDNF、βNGF、GCSF、GDNF、HB-EGF、IFNg、IGF-1、IL-10、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、MMP-2、MMP-3、S100B、TGFβ、TNFα、VEGF-A。体液因子检测为特定斑点可视化使用图像分析仪(LAS-3000，富士胶片，东京，日本)。每个光点的强度由Science Lab 2003 Image Gauge软件程序(富士胶片)测量，根据阳性对照光点的强度归一化。MCP-1是一种由细胞因子阵列选择的趋化因子，使用ELISA试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)在三个重复中测定。

统计分析

用Student’s t检验计算细胞活力、细胞生长、2D-DIGE蛋白斑点强度和体液因子分泌的差异的显著性。

结果

GIMEN细胞中NMDA受体亚基的表达

我们首先检测了GIMEN细胞表达的NMDA受体亚基。结果，所有NR1、NR2A-D和NR3A、B的亚基都在GIMEN细胞上表达(图1A)。因此，我们认为美金刚胺是通过结合NMDA受体来影响GIMEN细胞的。

图1所示。美金刚胺对GIMEN细胞活力和生长的影响。A. RT-PCR检测GIMEN细胞中NMDA受体亚基的表达。以18S核糖体RNA为模板作为阳性对照。蒸馏水同样作为阴性对照(NC)。M, DNA大小标记。B.在1-100 mM美金刚胺存在或不存在的情况下培养48小时GIMEN细胞的活力。显示了在没有美金刚胺的情况下的生存能力的相对值。

C. GIMEN细胞在1-100 mM美金刚胺存在或不存在的情况下培养48小时的生长。给出了生长速率与无美金刚胺时生长速率的相对值。所有实验均为3个重复。误差条，标准差。^＊p < 0.05,^**p < 0.01。

美金刚胺对GIMEN细胞活力和生长的影响

为研究美金刚胺对GIMEN细胞活力和生长的影响，在游离fbs条件下，用1 ~ 100 mM美金刚胺处理GIMEN细胞。GIMEN细胞的活力在1-10 mM美金刚胺范围内为99.0%或更高，而在没有美金刚胺的情况下为100%(图1B)。1 mM美金刚胺(101.0%，p<0.05)和100 mM美金刚胺(97.5%，p<0.01)对小鼠活力的影响较小。在0 ~ 100 mM美金刚胺范围内，活细胞数为4.22 ~ 2.66 × 10⁴处理48小时后，细胞数量均从种子细胞数量(2.2 x 10⁴细胞)。有趣的是，GIMEN细胞的生长呈剂量依赖性(2-100 mM, 85.5-63.0%;2 - 10毫米,p < 0.05;20-100 mM, p<0.01)(图1C)。根据这些结果，我们决定在后续的蛋白谱分析中使用10 mM美金刚胺处理GIMEN细胞。这是因为该浓度下细胞活力足够高(99.4%，p³0.05)，而细胞生长则下降到80%以下(76.1%，p<0.05)(图1B, C)。

美金刚胺对GIMEN细胞蛋白谱的影响

我们通过2D-DIGE比较了10 μM memantine处理和未处理的GIMEN细胞的蛋白质图谱，以找到参与抑制细胞生长的蛋白质。结果共检测到892个蛋白点(图2A, B)。892个蛋白点中有45个蛋白点在经memantine处理的细胞和未处理的细胞中表现出不同的强度(p<0.05)(表1)。在45个蛋白点中，有13个蛋白点在经memantine处理的细胞中表现出1.2倍或以上的强度。与此相反，在memantine处理的细胞中，19个蛋白点的强度是未处理细胞的-1.2(1/1.2)倍或更低。经美金刚胺处理后，GIMEN细胞的蛋白谱发生改变。

表1。加入美金刚胺后蛋白质结构的改变

检测到的蛋白质斑点总数	不同强度蛋白点数(p<0.05)	褶皱的区别,美金刚胺/控制	蛋白质斑点的数量
		x≥1.5	5
892	45	1.5 > x≥1.3 1.3 > x≥1.2 1.2 > * > -1.2 -1.2≥x > -1.3 -1.3≥x > -1.5	6 2 13 11 8
		-1.5 x≥	0

图2。经美金刚胺处理的GIMEN细胞的蛋白质谱。A, B.从10 mM memantine处理的GIMEN细胞(A)和未处理的GIMEN细胞(B)中提取的蛋白质通过2D-DIGE分离。每次分析都有三份副本。有代表性的2D-DIGE结果显示。C.在32个蛋白点中，有7个蛋白点的强度变化在±1.2倍以上(2)。正方形和圆形分别显示1个和6个蛋白点，其强度在经美金刚胺处理后分别增加和减少。

经美金刚胺改变其表达的蛋白的鉴定

我们试图识别斑点中的蛋白质，斑点的强度被美金刚胺处理改变。对32个经美金刚胺处理后强度发生±1.2倍以上变化的蛋白点进行了鉴定。结果，从32个斑点中的7个斑点中鉴定出6个蛋白(图2C，表2)。从1个斑点中鉴定出Coronin-1C蛋白，经经memantine处理后其强度增加了1.44倍(图2C，图3A，表2)。相比之下，从6个斑点中鉴定出5个蛋白，经经memantine处理后其强度下降(图2C，图3B-G)。分别是b-actin(-1.21倍减少)、g-烯醇化酶(-1.21倍减少)、谷胱甘肽合成酶(-1.28倍减少)、精子生成相关蛋白24(-1.46倍减少)和V-set跨膜结构域蛋白2B(-1.46倍减少)。从2个位点(ID 798和ID 804)鉴定出b-actin。

表2。加入美金刚胺改变蛋白斑点强度的鉴定

选取加入美金刚胺后强度变化为±1.2倍及以上的32个蛋白点进行蛋白鉴定。32个斑点中有7个被鉴定出来。

*蛋氨酸的氧化。

MW,分子量。

图3。memantine处理和未处理条件下鉴定蛋白的斑点强度比较。本文给出了经memantine处理的GIMEN细胞与未处理的(对照组)GIMEN细胞之间的7个蛋白点的代表性结果和这些蛋白点的强度差异。

误差条，标准差。^＊p < 0.05。

美金刚胺对GIMEN细胞分泌体液因子的影响

最后，我们比较了经memantine处理和未处理的GIMEN细胞之间的体液因子分泌水平。使用培养上清进行的细胞因子阵列分析显示，两种体液因子MCP-1和BDNF均有明显斑点(图4A)。用阳性对照斑点强度归一化后，memantine处理的细胞中MCP-1斑点强度往往高于未处理的细胞(图4B)。我们用ELISA法定量了MCP-1的分泌，然而，在memantine处理的细胞和未处理的细胞之间没有发现MCP-1分泌的差异(图4C)。美金刚胺不影响GIMEN细胞中检测的20种体液因子的分泌。

图4。美金刚胺对GIMEN细胞分泌体液因子的影响。一个。用培养液单独培养(左)或10 mM美金刚胺培养(右)的GIMEN细胞分泌体液因子，使用体液因子阵列进行检测，其中20种不同的抗体液因子抗体被印迹。电脑,积极控制;数控、消极控制。B.显示了在体液因子阵列结果中检测到的BDNF和MCP-1的斑点强度。C. ELISA法测定MCP-1浓度。误差条，标准差。

讨论

在本研究中，我们通过比较经美金刚胺处理的GIMEN细胞与未处理的GIMEN细胞，探索了美金刚胺的新作用。GIMEN细胞表达所有7个NMDA受体亚基，包括与谷氨酸能兴奋性毒性相关的NR2B(图1A)[6,9]。美金刚胺被认为通过NMDA受体影响GIMEN细胞，同时也影响AD大脑中的神经元细胞。已知NMDA受体的亚基组成是塑料[6]，因此，所有7个亚基都可以用于形成受体的不同组合的异四聚体复合体。NMDA受体亚基在GIMEN细胞中的蛋白表达有待进一步证实。

除100 mM处理外，美金刚胺未降低GIMEN细胞的活力(97.3%，p<0.01)(图1B)。这一结果与之前使用另一种神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH[16]的研究不同。10 mM和100 mM美金刚胺[16]可使SK-N-SH细胞活力相对提高。由于SK-N-SH细胞不表达功能性NMDA受体[22]，美金刚胺可能通过NMDA受体降低GIMEN细胞的活力。

在2 ~ 100 mM美金刚胺范围内，GIMEN细胞生长明显下降，且呈剂量依赖性(2 ~ 10 mM, 85.5 ~ 76.1%， p<0.05;20-100 mM, 70.0-63.0%， p<0.01)(图1C)。因此，我们认为美金刚胺通过其药理作用可以抑制GIMEN成神经细胞瘤细胞的生长。在一些成神经细胞瘤细胞系中，NMDA受体NR1亚基mRNA表达，但NR2A-D的表达未见显示或在研究中存在争议[22-24]。相比之下，在胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和小细胞肺癌等其他类型的肿瘤细胞中，NMDA受体的蛋白表达和/或参与细胞增殖已被报道[25-27]。在这种肿瘤细胞中，20-900 mM美金刚胺可能通过限制来自NMDA受体的信号来抑制细胞生长。在我们的研究结果中，相对低剂量的2-50 mM美金刚胺可以抑制细胞生长而不影响细胞活力(图1B, C)。有趣的是，在AD[28]治疗血清浓度范围内的1 mM美金刚胺也有抑制细胞生长的趋势(89.1%，p³0.05)(图1C)。美金刚胺可能有抑制成神经细胞瘤细胞生长的作用。另一方面，治疗浓度为1mM的美金刚胺可能抑制成人大脑中正常神经细胞的生长，即成人神经干/祖细胞的生长。对GIMEN细胞生长的抑制作用需要使用其他表达NMDA受体的成神经细胞瘤细胞系和正常神经细胞来验证。

在治疗条件下，每日维持剂量为20 mg的人血清美金初胺浓度在0.5-1.0 mM之间，而脑脊液(人)和脑微透析(大鼠)中由于血清[28]与白蛋白结合，其浓度降低了20-50%。然而，人类和啮齿动物的大脑匀浆中含有更高浓度的美金刚胺(10-30倍)，可能是由于溶酶体积累[28]。最近，研究发现AD小鼠模型的神经元中发生了巨自噬，以增加Aβ并入次级溶酶体[29]。部分此类神经元发生非典型细胞死亡，释放未降解的Aβ到细胞外空间[29]。在这种情况下，神经元可以暴露在高浓度的美金刚胺中，类似地，从死亡细胞的溶酶体释放出来。综合上述原因和细胞活力和生长结果，我们确定美金刚胺的浓度为10 mM，用于蛋白表达分析。在2D-DIGE结果中检测到的892个蛋白点中，有32个点的强度在memmanine处理的GIMEN细胞和未处理的GIMEN细胞之间发生了±1.2倍或更多的变化(p<0.05)(表1)。改变的蛋白点的数量和强度与其他类似检查药物或细胞因子作用的蛋白质组学研究中的蛋白质点数量相当[30,31]。

我们在32个位点中识别了7个蛋白，发现经美元刚胺处理后，b-肌动蛋白、g-烯醇化酶和谷胱甘肽合成酶的表达下降(表2，图3B-E)。b-肌动蛋白是一种细胞骨架蛋白，参与细胞分裂、细胞迁移和细胞形态发生[32]。b-actin表达的降低被认为与GIMEN细胞生长的抑制有关。相比之下，含有多个肌动蛋白结合位点[33]的冠状蛋白- 1c的表达通过美金刚胺处理而增加(表2，图3A)。由于coronin-1C被认为是肌动蛋白丝[34]的整合子，因此可能通过增加coronin-1C来恢复被下调的b-actin的功能。g-烯醇化酶主要表达于神经内分泌系统的神经元和细胞中，是糖酵解途径的一种酶，催化2-磷酸d -甘油酸脱水为磷酸烯醇-丙酮酸[35]。g-烯醇化酶通过调节神经元生长因子受体依赖的信号通路促进神经元细胞存活，导致广泛的肌动蛋白细胞骨架重塑[35]。有趣的是,p19^拉提示其可通过与g-烯醇化酶[36]的相互作用抑制癌细胞增殖。g-烯醇化酶的降低可能也参与了GIMEN细胞生长的抑制，与b-actin的降低有关。

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽，在许多细胞过程中起着重要作用，包括细胞增殖和凋亡[37]。谷胱甘肽合成酶参与谷胱甘肽生物合成的亚途径，其中谷胱甘肽是由g-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸合成的。谷胱甘肽是细胞增殖所必需的，是细胞进入S期所必需的[38,39]。谷胱甘肽水平受谷胱甘肽合成酶上调，并与细胞生长速率[39]相关。美金刚胺处理后谷胱甘肽合成酶的降低会降低GIMEN细胞中谷胱甘肽的水平，进而可能导致细胞生长的抑制。

通过cDNA芯片[18]分析大鼠皮质mRNA表达，反向相蛋白阵列[19]分析小鼠海马和皮质蛋白表达和修饰，研究了美金刚胺对神经元细胞分子谱的影响。然而，在这些研究中发现的分子都没有在我们的研究中被检测到。这可能是由于材料(人成神经细胞瘤与小鼠或大鼠脑组织)和方法(2D-DIGE和质谱与cDNA或蛋白质阵列)的不同。美金刚糖对本研究中发现的蛋白谱的影响应在不久的将来用其他成神经细胞瘤细胞和正常神经细胞进行验证。

综上所述，我们发现美金刚胺可以抑制GIMEN细胞的生长并影响其蛋白谱。美金刚胺可能有抑制成神经细胞瘤细胞生长的作用，然而即使在治疗浓度下，它也可能抑制正常神经细胞的生长。细胞生长的抑制可能是由于b-肌动蛋白、g-烯醇化酶和谷胱甘肽合成酶失去了与细胞增殖相关的功能，导致其表达减少。需要进一步的研究来验证上述结果，并阐明本研究中美金刚胺新发现的作用机制。

确认

作者感谢麻生久美女士的技术援助。作者也感谢第一三共感谢您对本研究的支持。

的利益冲突

一个也没有。

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