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摘要

在这项工作中，我们报道了一种用于直接、快速和容易诊断慢性Q热的阻抗生物传感器的开发。这种生物传感器是基于高灵敏度的抗原，可以选择性地识别抗伯纳特氏立克次氏体．该生物传感器采用EDC/NHS固定方法将抗原固定在金电极上。检测是通过阻抗光谱法来进行的，它监测特定的频率，为生物传感器提供最大的灵敏度。患者血清中存在的Q热抗体可选择性地与生物传感器抗原相互作用，改变生物传感器表面的阻抗，从而在数秒内产生较大的阻抗变化。该生物传感器允许对慢性Q热进行特定的血清学检测，而开发的系统也可以修改以检测其他生物标志物，如针对急性Q热的标志物。

关键字

伯纳特氏立克次氏体;Q热病;慢性Q热病;electrocemical生物传感器;诊断工具;免疫传感器;阻抗光谱学

简介

伯纳特氏立克次氏体是一种在世界范围内分布的专性细胞内细菌病原体，可引起Q热感染[1]。临床表现为急性和慢性Q热病。一般来说，急性Q热是温和的、自限性的，有多种症状，常见的有发热和疲劳。该病的这种流感样表现往往导致对病原体检测的临床怀疑程度较低，因为样本是在与病原体接触数天后和症状出现后[2]进行分析的。另一方面，慢性Q热是一种危及生命的疾病，其症状包括心内膜炎、慢性肝炎或慢性血管感染[3]。对于慢性类型的疾病，早期和准确的诊断对于保护患者的健康至关重要，因为如果不及时治疗，它可能是致命的。然而，考虑到目前诊断方法的局限性，Q热的早期诊断是一项具有挑战性的任务[1,3 - 5]。

现有方法对慢性Q热的诊断准确率很低，在33%到64%之间，这使得这些方法对慢性疾病的诊断不具有特异性。通过培养细菌也可以检测血液或组织中的慢性Q热，但这种方法的效率只有50-60%。由于这些原因，对该病最广泛使用的诊断方法是基于血清学的方法，因为在感染之后，IgG抗体在血液中可持续存在数月甚至数年[3,4]。

Q热诊断的实验室血清学方法包括间接免疫荧光法(IFA)、酶联免疫吸附法(ELISA)和补体固定[3,4]。虽然IFA是目前Q热血清学检测的金标准，但上述技术都有一定的局限性。限制包括大的样品/试剂体积要求，复杂的协议，以及实验室之间分析规范的大可变性[5]。此外，所有的方法都是基于获得的抗原贝纳特氏立克次c .,这是危险和难以处理的，因为需要专门的设备和BSL3安全级别的设施。全细胞抗原生产的内在复杂性，以及IFA的主观性质导致了检测结果的不一致。

基于重组蛋白的诊断试验将克服上述困难，同时提高检测效率。免疫蛋白组学研究贝纳特氏立克次c .已有关于几种血清反应蛋白的报道，但其中只有少数通过ELISA验证[6-10]。我们实验室最近的工作成功地扩展了一个子集贝纳特氏立克次c .免疫反应蛋白，已通过ELISA验证[11-14]。在一系列这样的蛋白中，CBU_1910 (Com1)和CBU_1718 (GroEL)对慢性Q热诊断具有较高的敏感性和特异性，因此被用于开发基于电化学阻抗谱的新型Q热生物传感器[13,14]。

电化学阻抗谱(EIS)是一种非常敏感和精确的表面监测技术，用于检测抗原-抗体相互作用，因此它可以用于开发特异性的，高精度的免疫传感器。基于EIS的生物传感器作为诊断工具已经有了一些应用[15-21]，确保了简单、敏感和特异性。在这项工作中，我们描述了用于快速诊断慢性Q热的高精度和选择性电化学免疫传感器的发展。它是基于CBU_1718 (GroEL)蛋白固定在修饰的金电极上。用EIS监测固定化抗原与慢性Q热抗体的直接相互作用。产生的生物传感器比慢性Q热抗体的高选择性使其成为诊断感染的理想系统。

材料和方法

抗原的生产

Psaroulaki等人最近描述了GroEL蛋白(CBU_1718)的生产。[13]。简单地说，CBU_1718基因从C．burnetii九里第一阶段基因组DNA PCR。PCR产物连接到pET-22b(+)表达载体上，转化成pET-22b(+)表达载体E。杆菌BL21 (DE3)细胞。对于抗原表达，转化的E。杆菌细胞在37岁时培养^οC，在一个OD₆₀₀1 mM异丙基β- d -1-巯基半乳糖吡喃苷(IPTG)诱导蛋白表达0.5。细胞在诱导后4(4)小时收集。由于该蛋白的c端[13]带有6xHis标记，因此采用Ni-NTA亲和层析法对其进行分离纯化。用12%丙烯酰胺凝胶检测分离蛋白的纯度，然后用考马斯蓝染色和单克隆抗多组氨酸碱性磷酸酶偶联抗体(Sigma)进行Western blot检测。用BCA法测定蛋白质浓度，并将分离的蛋白质保存在-40℃^οC。

抗原的质量测试

用Western blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测分离的GroEL蛋白的诊断能力。来自急性或慢性Q热阳性患者的血清以及健康个体的血清被用于评估GroEL在慢性Q热诊断中的有效性。血清使用市售IFA载玻片(Focus Diagnostics)进行IFA检测，该载玻片可以检测I期和II期IgM和IgG贝纳特氏立克次c .抗体。IFA检测在国家临床微生物学与微生物发病机制实验室进行贝纳特氏立克次c .感染。患者血清可疑贝纳特氏立克次c .由于实验室的性质，每天都会收到感染。实验室过去的研究中收集了健康献血者的血清[12-14]。该研究中使用的所有血清都是在2018年之后获得的。IgG滴度≥1/1.920或IgG滴度1/480和IgM滴度1/200被认为是急性期感染的临界值;≥1/ 1024被认为是慢性Q热阳性。急性感染的切断是基于过去实验室[13]的研究，而慢性Q热的切断是基于这种感染的诊断指南。在Western blot中，ap标记的抗人IgG被用作二抗，而使用5-溴-4-氯-3-吲哚酰磷酸(BCIP)和亚硝基蓝四唑(NBT)与彩色产物发生反应。

ELISA在微量滴度平板(96孔，康宁联合星)上进行。纯化抗原以1µg/ml的浓度包被，4℃包被缓冲液(50 mM Na)中孵育过夜₂有限公司_3.， 50毫米NaHCO_3., pH值9.6)。用PBST洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水+ 0.05% v/v吐温20)清洗钢板，用封闭缓冲液(PBST + 1% w/v牛血清白蛋白)在37℃下堵塞孔1小时。阻塞后一步,盘子被孵化与患者和健康人血清(PBST 1:50 0)在37°C 1 h。后来,他们洗了三次洗涤缓冲和孵化与兔子反人类免疫球蛋白(博士德生物技术)与过氧化物酶共轭(1:3000阻断缓冲区)37°C 1 h。接下来,井被洗了三次,孵化与基质溶液/色原10分钟(美国加州三甲核心,BioRad)。加入0.5 M H时，比色反应停止₂所以₄光密度在490 nm处用microplate阅读器(Multiskan FC, Thermo Scientific, Ratastie Finland)读取。

金电极修饰和抗原固定化

所有金电极(Methrom，一次性SPEs DRP-250AT)在PBS缓冲液(2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, 10 mM Na)中采用线性扫描伏安法进行电化学清洗₂HPO₄， 1.7 mM KH₂阿宝₄、pH = 7.0)。在0.1 V/s的扫描速率下，用Ag/AgCl参比电极和Pt电极作为计数电极，电压在-2 ~ 2v之间变化。然后将预处理过的金电极在1mm 11-巯基十一酸乙醇中浸泡一夜，在金表面形成自组装单层(SAM)。在这一步之后，用乙醇冲洗电极以去除无界硫醇。在这一步之后，端羧基被激活。为此，将改性电极与0.4 M EDC-0.1M NHS (MES缓冲液，pH=5.0) 1:1 v/v的混合物处理2.5h。

用PBS冲洗金电极，晾干后偶联重组蛋白，滴取4μ l (10 μg/mL)的纯化GroEL溶液涂于金电极表面100 min，静置4^οC.用PBS (pH= 7.0)和水冲洗去除非结合抗原，电极在空气中干燥。图1描述了整个生物传感器的构建过程。

图1．通过EDC/ NHS介导的偶联固定化GroEL蛋白。

EIS测量

电化学阻抗谱(EIS)测量用于表征金电极的修饰步骤和GroEL蛋白的固定化，以及由此产生的生物传感器对Q热抗体的响应。采用三电极体系，修饰金电极作为工作电极，铂对电极和银/AgCl参比电极。所有的EIS测量都是使用配备频率响应分析仪的PalmSens4电位器进行的，频率范围在0.2 Hz到100 kHz之间，使用正弦激励信号，电位幅值为10 mV。在电位值为0.0 mV时记录阻抗数据。所有测量均在室温(251)PBS缓冲液(pH=7.0)中进行^οC).阻抗谱采用PSTrace 5.8软件进行拟合。

用于抗原-抗体相互作用的测量，使用了来自健康献血者、慢性Q热阳性患者和急性Q热阳性患者的血清。分别用三种不同的血清(来自健康献血者、慢性Q热阳性患者和急性Q热阳性患者)测试这三种改良电极中的每一种。将患者血清在PBS缓冲液(pH=7.0)中(1:500)稀释，搅拌2min后测量EIS，依次为:静置6min、静置1min、静置1min。图2显示了用于慢性Q热诊断的生物传感器结果。

图2．用于慢性Q热检测的EIS生物传感器示意图。

结果与讨论

抗原制备

由于与Com1相比，GroEL (CBU_1718)的表达率更高(0.65 mg/mL)，因此选择它进行进一步的研究。

Western blot结果显示，分离的GroEL只与慢性Q热阳性患者的血清发生反应，而与健康人群或急性型疾病患者的血清未观察到反应(图3)。ELISA检测和统计分析证实，GroEL具有较高的敏感性(96.4%)和特异性(84.8%)，其截断值为1.59[13]。在开发免疫传感器之前，对抗原蛋白的质量、数量和诊断能力进行了测试。图3验证了这一点，即使是在-40存储之后^οC 2个月后，GroEL仍能对人血清Q热疾病进行鉴别诊断。

图3．B. GroEL经亲和层析和-40οC保存后的SDS-PAGE。C.抗聚组氨酸碱性磷酸酶偶联抗体Western Blot。D. Western Blot检测-40οC保存后抗多组氨酸碱性磷酸酶偶联抗体。E. Western blot使用慢性Q热患者血清。F.免疫印迹法使用急性Q热患者血清。G.使用献血者血清的Western blot。

生物传感器的发展

阻抗谱是用于监测与表面和自组装单分子层相互作用的最广泛的方法之一[15-25]。由于阻抗是电路抵抗电流的总能力的度量，它考虑了电阻内抑制流动的所有参数，如电感、电阻和电容。在EIS测量过程中，当以不同的频率对样品施加交流电压时，测量电流。然后，阻抗(Z)可以计算为与频率相关的电位(E)与与频率相关的电流(I)之比。

由于阻抗表示为复数(Z_(ω)= Z '_(ω)——生理改变”_(ω))，数据通常以Nyquist图表示，其中实部(Z’)在x轴上，虚部(Z”)在y轴上。通常这个图用半圆表示，这表示一个电荷转移过程，而半圆的大小表示我们有多少电荷转移阻力。然而，在扩散过程(华宝阻抗)[19]的情况下，奈奎斯特图也可以看起来像一条斜率为正的直线。

图4是用GroEL蛋白修饰金电极前后的阻抗奈奎斯特光谱。裸金的图勾勒出一个半循环，独特的电阻与电容并联和线性部分，这是在低频出现，这是由于扩散过程(华宝阻抗)[24]。抗原固定在电极表面后，出现明显的高频电荷转移半圆，而线性部分则消失。这表明，由于蛋白质GroEL与修饰的金电极表面电绝缘，因此不存在Warburg阻抗[19,24]。

图4．裸金电极(图中)和PBS缓冲液中GroEL蛋白修饰金电极的阻抗奈奎斯特谱。电位幅值为10 mV，频率范围为100 kHz-0.2 Hz。在电位为0.0 mV时记录阻抗数据。

生物传感器评估

蛋白GroEL被固定在修饰的金电极上，并通过EIS测量评估得到的生物传感器对几个血清样本的响应。图5显示了一个健康人的血清Nyquist图(A)和相应的Bode图(B)，其中一个是急性Q热阳性患者，一个是慢性Q热患者。当测试溶液中未添加血清时，生物传感器在PBS中的EIS谱显示在同一图上，以供比较。可以看出，当使用一个健康人的血清和一个急性Q热患者的血清时，由于两个图谱重叠，EIS谱没有显著差异。另一方面，当使用慢性Q型热患者的血清时，阻抗谱急剧增加。将数据拟合到简化的Randles电路中(图6)，其中Rct为通过半圆直径[25]，R计算的电荷转移电阻₁为电解液电阻，C_{戴斯。莱纳姆:}为双层电容。上述测量的计算值如表1所示。

图6。用EIS测量的数据拟合了Randlers电路。

图5。一个。阻抗PBS和不同患者血清中GroEL修饰电极的Nyquist图。电位幅值为100 mV，频率范围为100 kHz-0.2 Hz。在电位为0.0 mV时记录阻抗数据。B。EIS生物传感器对PBS和不同患者血清的等效波德图。

表1。阻抗谱的溶液电阻R1、极化电阻Rct和双层电容Cdl的计算值如图5所示

	PBS中的GroEL修饰电极	GroEL修饰电极在慢性Q热患者血清中的应用
R1 (kΩ)	0.27	0.26
个随机对照试验(kΩ)	3．7	10.3
Cdl(μF)	11.4	40.0

通常情况下，当电极与生物分子功能化时，阻抗增加(MILNER)，这是由于电极表面覆盖非导电有机材料增加的结果。与裸金属电极[26]相比，非导电材料诱导的电子转移速率较慢，电荷转移电阻较高。

表1的数据表明，R_ct和C_{戴斯。莱纳姆:}与PBS缓冲液或急性Q热患者相比，当生物传感器暴露于慢性Q热抗体时，其含量分别增加至少2倍和4倍。较大的阻抗增加可归因于非导电电极表面涂层的膨胀，这是慢性Q热抗体与固定化选择性蛋白的生物识别的结果。另一方面，计算出的R_ct和C_{戴斯。莱纳姆:}当加入献血者和急性Q热患者的血清时，值保持不变(数据未显示)。

对传感器之间的重复性进行了评估，如图5B所示。该数据显示了Z值与所用频率范围之间的关系。很明显，在低于1.0 Hz的频率下，抗原-抗体相互作用时阻抗增加较大。图7显示了在PBS和不同血清样品中，不同传感器在0.51 Hz下的平均总阻抗。当暴露于慢性Q热抗体时，所有生物传感器都表现出非常相似的(RSD 2-3%)总阻抗增加，而对健康献血者和急性Q热血清没有观察到显著的响应。这一结果表明，所开发的GroEL生物传感器是一种对慢性Q热抗体具有高特异性的诊断工具，可以方便、直接、准确地诊断慢性Q热患者。

图7。对慢性Q热感测性能的评价。在PBS缓冲液中使用不同患者的血清，用EIS测量总阻抗(Z)。电位幅值为100 mV，频率范围为100 kHz-0.2 Hz。评价共进行3次(N=3)。

结论

在这项工作中，我们展示了基于高选择性的阻抗生物传感器的发展贝纳特氏立克次c .抗体用于慢性Q热的直接诊断。该生物传感器是通过EDC/NHS固定方法将抗原固定在金电极上开发的。最佳的检测是通过阻抗测量频率低于1hz，此时生物传感器显示其最大灵敏度。该生物传感器显示出所需的选择性和灵敏度，可以精确和可靠地检测慢性Q热的血清学，同时开发的系统也可以用于检测其他生物标志物，如急性Q热的生物标志物。

致谢

作者要感谢Cornelia Muenke提供的出色技术支持。该研究项目得到了克里特岛大学和希腊教育部的支持。感谢马克斯-普朗克生物物理研究所H. Michel教授的支持。

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