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摘要

背景与目的:肝细胞癌(HCC)是一个全球性的挑战，由于发病率上升和受影响个体的高死亡率。因此，建立成功的HCC动物模型对于HCC的基础研究和转化研究至关重要。本研究旨在建立原位同基因肝癌大鼠模型，为人类肝癌研究提供新的诊断和治疗策略。

方法:在55只大鼠肝左叶囊下注射大鼠诺维科夫肝癌细胞。研究分为三个阶段，第一阶段15只动物注射4x10⁶细胞置于100 μ l DMEM中，15只动物置于ii期2x10中⁶50 μ l细胞和30只动物在iii期3 x10⁶100 μ l DMEM中的细胞。使用连续µPET-CT成像评估肿瘤诱导率、肿瘤大小、进展和死亡率，直到四周。以F-18氟脱氧葡萄糖为代谢显像示踪剂，影像学表现与组织学表现大体相关。

结果: i期动物肿瘤诱导率为100%，但肝内和腹膜内多发肿块，死亡率为100%。ii期动物未见任何肿瘤。iii期动物诱导率100%，肝肿瘤进展受控、扩散。CT影像及肝脏氟脱氧葡萄糖摄取持续增高证实肿瘤进展。大体检查和组织学证实存在HCC。结论:N1S1细胞诱导原位同基因肝癌大鼠模型，肿瘤生长进行性控制，死亡率最低，可用于研究肝癌的新诊断技术和制定新的治疗策略。

关键字

肝细胞癌，原位，正电子发射断层扫描(PET)，计算机断层扫描(CT)， N1S1

简介

肝细胞癌(HCC)是全球第五大最严重的癌症类型和第二大最常见的癌症死亡原因，预计在未来几年发病率将会增加[1,2]。肝癌预后很差，总病死率为0.95，病死率的地理分布相似[3-5]。HCC发病率最高的地区是亚洲和撒哈拉以南非洲地区。病因包括乙型和丙型肝炎病毒感染(80%)、酒精中毒、肥胖(非酒精性脂肪性肝病)和黄曲霉中毒。［6,7] In Indian population chronic Hepatitis B virus infection, with tumors developing more often in a cirrhotic (76%) than in a non-cirrhotic liver has been reported [8]. It usually gets initiated following a chronic liver injury where surgical resection or transplantation is the primary line of treatment although systemic and local deliveries of chemotherapeutics have been reported for later stage of the disease [9,10]. Even though the study of HCC invasiveness has advanced at the molecular level with overall sophisticated breakthroughs in knowledge of HCC, it has not translated to improved HCC patient care.

因此，建立成功的HCC动物模型对HCC的基础研究和转化研究都至关重要。化学诱导的小鼠肝细胞癌模型已经建立很长时间了，但它不能对肝脏进行局部肿瘤诱导，对动物的毒性相对较高。皮下异种移植作为一种诱导肿瘤的技术已被广泛应用了二十年。该技术具有速度快、成本低、易于复制、肿瘤肉眼可见、不导致动物死亡等优点。皮下异种移植缺乏肿瘤正常生长的微环境，而且由于缺乏药物反应，在临床前试验中无法描述治疗药物的疗效[11,12]。皮下HCC模型的主要缺点是当药物需要通过肝动脉给药时，它不能探索新的治疗放射性同位素策略。原位肿瘤模型由于能模拟原发肿瘤的微环境，也能准确反映治疗方式的有效性，因此比皮下异种移植模型[13]更能预测肿瘤反应，因此在癌症研究中越来越多地出现。近十年来，研究人员已经开始开发原位人HCC模型，但这些模型开发难度大，需要技术人员，且死亡率较高。除了评估肿瘤负荷之外，缺乏完善的评估治疗反应的工具，阻碍了新肿瘤疗法的测试和验证[14,15]。这一不足可以通过建立肿瘤细胞植入靶器官时不出现免疫排斥反应的同基因原位动物模型来解决。该模型具有成本效益、可重复性、肿瘤在具有免疫能力的宿主中生长、使用历史长等优点，因此具有较强的药物反应数据基线，并且在每组[16]动物数量具有统计学意义的实验中具有可行性。 This model even does not require more sterile environment as compared to the immunocompetent animals, due to which frequent non-invasive imaging is feasible. There are reported models in earlier studies such as Morris hepatoma model using McA-RH7777 cells in Buffalo rat and N1S1 cells for Novikoff hepatoma model in Sprague-Dawley (SD) rats [17,18]. The suitability of N1S1, which is chemically induced cell line using SD rats has been explored commonly due to ready availability of cell line as well as animal strain [19].

人们正致力于开发更有效的放射治疗未知剂和化疗剂，这推动了对合适和相关动物模型系统以及敏感的非侵入性成像方式的研究，如计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和生物发光成像(BLI)[20-25]。BLI是一种敏感的生物成像方法，已被研究人员用于监测肝脏肿瘤的进展，但在提供肿瘤的功能细节和估计实际肿瘤负荷方面存在局限性，因此在临床前试验中应用有限。

虽然大多数研究涉及具有免疫能力的原位异种移植动物，但我们的目标是建立大鼠同基因肝细胞癌模型，用于研究新的诊断和治疗策略，以进一步研究人类肝细胞癌。因此，我们开发了以下方案，使用N1S1小鼠HCC细胞在SD大鼠中有效地建立小鼠HCC模型，并使用µPET-CT作为一种先进的功能成像技术进行验证。

材料与方法

细胞系

从American Type Culture Collection (ATCC-CRL1604™)获得的大鼠Novikoff肝癌(N1-S1)细胞在Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM)中培养，加入10%热灭活胎牛血清(FBS)和1%青霉素，100 μg/mL链霉素，37°Cin，含95%空气和5% CO的潮湿环境中培养₂．在T-75培养瓶中进行多达20次传代，直到达到70-80%的融合度，细胞被压碎并在少量培养基中重悬。使用血细胞计室计数细胞，并评估细胞活力。按照方案调整细胞的最终浓度，将细胞放入1.5ml容量的epppendorf小瓶中，暂时保存在冰中，直到移植。

动物研究

动物:实验方案在研究开始前由我们的机构动物伦理委员会(IAEC)批准，我们确保所有动物都得到了人道的照顾，并且研究方案符合机构的指导方针(IAEC/22/2012)。本研究采用雄性SD大鼠，体重150±50 g，由ACTREC实验室动物设施(Navi Mumbai, India)提供。所有的动物都被安置在中央动物护理设施中，有12小时的光照和12小时的黑暗周期。用颗粒饲料、自由饮水和无病原体环境饲养。

实验设计:在这项初步研究中，共使用55只SD大鼠，分为三个阶段，以标准化均匀肿瘤诱导所需的细胞浓度。所有大鼠均在左肝叶囊下注射N1S1细胞株。第一阶段的大鼠(n=15)注射4 × 10⁶N1S1细胞悬浮在100 μ l DMEM中。在第II期(n=10)大鼠注射2 × 10⁶N1S1细胞悬浮在50 μ l DMEM和III期大鼠(n=30)注射3 x10⁶N1S1细胞悬浮在100 μ l DMEM中。在III期，15只动物从后部注射，其他15只动物从前部注射，没有将肝脏外化。该过程的示意图表示如图1所示。

图1．图示小鼠原位肝细胞癌肿瘤诱导过程中所遵循的步骤。

原位移植:用4%异氟醚和1l/min O麻醉大鼠₂并在整个手术过程中使用3%异氟醚麻醉。所有动物腹部剃毛，用70%酒精无菌处理。动物以仰卧位放置在实验台上。进行小型剖腹手术，在剑状下纵向切开约1-1.5 cm，露出肝叶(图2a)。从含有细胞悬液的eppendorf管中适当混合细胞后，用30号针将细胞抽入胰岛素注射器。在直视下，细胞注入左外侧肝叶囊下(图2b)。注射部位出现白色凸起表示注射成功(图2c)。注射部位用无菌棉签按压，避免细胞漏出或肝脏出血。肌肉缝合用无菌可吸收铬线肠号。3-0，皮肤用组织胶(Vetbond^TM)．手术后，动物被放在加热垫上恢复。术后所有动物均口服抗生素，伤口包扎5天。

图2．剖腹手术图像(A) 30G针插入肝包膜下(B)注射细胞悬液(C)白色凸起确认细胞注射成功。

成像研究:采用PET/SPECT/CT临床前系统FLEX进行MicroCT扫描和microPET扫描^TM胜利^TM(TriFoil Imaging Inc, CA, USA)。在肝内注射后一周进行扫描，然后每周进行一次，直到四周。大鼠禁食3h，用4%异氟醚麻醉^®Abbot India LTD.， India)在1升/分钟氧气的空气中进行成像程序。µCT扫描动物俯卧位，参数为电压50kV，电流500 μA，放大倍率1.3，曝光时间400 ms。在VIVID软件中重建图像，在MicroView软件中分析肿瘤特征和体积。用于PET成像300 ~ 450 μ Ci的[¹⁸F]-氟脱氧葡萄糖(FDG)经尾静脉注射，注射后60分钟扫描。PET图像采用2d-mlem算法重建，未进行衰减校正，并在PMOD软件(PMOD Technologies LLC, Zurich, Switzerland)中进行分析，以标准化吸收值(SUV)为SUVmax和SUVmean。

利用软件中的融合工具将PET和CT图像进行叠加，并在肿瘤周围绘制感兴趣区域(Region of Interest, ROI)，得到ROI内的平均计数率(计数/秒/像素)，计算SUV为:

研究终点

最初在I期和II期，每周使用标准的安乐死程序处死动物，并探查腹腔是否有肝脏肿瘤、异位和远处转移。在III期，动物在4时被处死^th移植周及大体形态与PET-CT图像比较。用游标卡尺测量肿瘤大小并记录肿瘤重量。采集血液进行血液生化检查，包括血清谷草转氨酶(SGOT)和血清谷丙转氨酶(SGPT)。在10%的福尔马林中收集肿瘤并进行组织学研究。

组织病理学研究

用福尔马林固定瘤包埋石蜡块，切小块，按前文描述用苏木精和伊红(H&E)染色。

统计分析

所有数据均以均数±均数标准误差(SEM)表示。的水平上接受有统计学意义P< 0.05。

结果

由于肝包膜很薄，一开始很难注射细胞。由于动物的呼吸运动，细胞的溢出发生，但在获得在胶囊下注射细胞的技能后，溢出逐渐减少。在注射过程中或注射后，没有任何动物出现出血，并且在植入手术后2-3天没有观察到感染或死亡。气体麻醉可诱导2-3分钟手术所需的麻醉量和深度，无并发症。

在不同时间点连续PET-CT成像至4点^th的一周。I期动物在1时肿瘤发生率为100% (15/15)^圣在肿瘤部位大量摄取FDG(图3A)，但肿瘤大小不变地增加，直到3^{理查德·道金斯}死亡率为60%(9/15)，70%的动物发现FDG摄取遍布腹部(图3B)。3只动物肺部也有摄取，提示肿瘤发生局部和远处转移。II期至4期肿瘤发生率为0% (0/10)^th移植后一周无死亡。最初在肿瘤部位以及缝合附近的皮肤上发现了一些FDG摄取(图4A)，但从2^nd一周以后几乎可以忽略不计/没有看到摄取(图4B)。这种最初在肝脏和手术部位的摄取可能是由于注射部位和手术部位的炎症变化。示踪剂摄取异常在三维成像中可以很好地鉴别。III期所有动物均在1时出现肝脏摄取^圣这意味着100%的成功率(图5A)。在III期的26只动物(26/30)中，肿瘤中FDG的摄取连续每周增加，直到4^th一周(图5B)。在1^圣周PET图像显示注射部位和手术缝合部位均有吸收，但从2^nd一周后仅在肿瘤中观察到摄取。所有动物在第14天均出现弥漫性肿瘤，平均组织特异性摄取为220 KBq/ml。在第28天发现最大平均组织摄取量为152 KBq/ml。3只动物在2^nd周扫描。而有一只动物在第21天腹腔内出现大量摄取，可能是注射过程中腹腔内细胞外溢或肿瘤浸润所致。4岁后死亡率仅为20%^th移植周。

图3．俯卧位I期PET-CT图像显示(A)第1周肿瘤摄取(B)第4周高摄取^th腹膜转移灶(C) 4时CT图像^th4时确认肿瘤生长(D)大体图像^th周显示肿瘤过度生长，覆盖整个肝叶(白色箭头所示肿瘤区域)

影像学结果在动物祭祀时经大体检查确认。第一阶段动物在1牺牲^圣周见大分叶状不规则肿瘤覆盖整个肝左叶(图3C,3D)。而动物在2^nd周见肿瘤近缝合线浸润，腹腔浸润，肺远处转移灶。第二期动物在1^圣周未见肝脏局部肿瘤及腹膜异位肿瘤。观察到4点的动物^th周，但只观察到疤痕组织(图4C,4D)。在III期研究中，动物在1时肝脏左叶出现局部实体瘤^圣肿瘤逐渐增大至4周^th移植后一周(图5C,5D)。基本上所有肿瘤都在4^th均分布于左肝叶(图6)。

图4．II期研究动物俯卧位PET-CT图像显示(A)第1周肿瘤摄取轻微(B)第4周FDG摄取减少^th周(C) CT图像显示肝叶肿瘤可忽略(D)大体图像4^th周见肝叶瘢痕样病变。

图5．III期研究动物俯卧位PET-CT图像显示(A)第1周肿瘤摄取良好(B)第4周FDG摄取增加^th(C) CT图像显示肝叶弥漫性肿瘤(D) 4时大体图像^th肿瘤确诊周。

图6．第4周，肝脏代表性大体图像显示局部原位肝癌肿瘤均匀诱导。

肝组织组织学检查进一步证实了肿瘤大体病理。肿瘤H & E染色显示肝细胞与正常肝实质相比生长扭曲。(图7A)典型的小梁生长模式，细胞质不典型，有丝分裂指数高，核仁多形性突出，证实肿瘤在组织学上与原大鼠肝癌细胞相似(图7B,7C)。

图7．显微照片显示(A)肝细胞癌细胞与相邻的正常肝细胞。(B)细胞呈片状排列，NC比高，核仁多形突出。(以9.97倍拍摄，缩放@ 63.44%;比例尺20µm) (C)肿瘤与正常相邻肝脏(以9.97x拍摄，放大@ 4.84%;比例尺2µm)

测定生化参数以评价肿瘤生长与血清AST/ALT水平之间的关系，并在荷瘤动物和非荷瘤动物中进行比较。与非荷瘤动物相比，荷瘤动物的水平显著升高，支持肝脏肿瘤的发展(图8)。

图8。柱状图描述了荷瘤动物和非荷瘤动物的肝酶水平。肝酶在荷瘤动物中显著升高。均数±平均标准误差(SEM);P < 0.05，与荷瘤组比较。

讨论

考虑到人类肝细胞癌的发病率和死亡率的增加，有必要研究HCC的疾病进展。皮下HCC肿瘤模型不能模拟原发HCC肿瘤的特性，因此需要开发具有类似疾病进展的原位HCC动物模型。

在我们的研究中，大鼠肝癌细胞系(N1S1)成功地在肝脏上诱导了所需体积的肿瘤，这足以研究抗癌药物的长期反应。在1^圣在囊下肝注射中观察到实体瘤，Chan et.al, 2010在注射5X10后的正交各向异性模型建立过程中也得到了类似的结果⁶但是，他们没有研究N1S1细胞系的进展很长一段时间。Guo等人2011年报道了注射N1S1细胞株后类似的进行性实体瘤形成。注射过程中细胞悬浮和溢出的数量增加了原位肝癌模型的建立难度。在I期研究中，肿瘤大小增加、FDG摄取增加和死亡率增加使我们推断N1S1是一种侵略性生长的细胞系，能够在较高浓度下形成肝内肿块和其他器官的转移性病变。II期细胞悬液量由100µl减少至50µl，但由于针内细胞堵塞，注射困难，故进一步以100µl作为标准细胞悬液量。在整个研究中没有手术相关的感染或因出血导致的死亡，表明同基因SD大鼠适合原位模型的建立。

在不牺牲动物的情况下了解肿瘤的生长过程是具有挑战性的，但目前临床前成像技术有助于监测疾病。不同的研究人员在开发HCC模型时使用了生物发光成像，它可以检测细胞发出的信号，但无法确定肿瘤的体积和特征。µCT和PET成像成功用于原位肝癌的临床前诊断[28,29]。F-18-FDG-PET与µCT成像一起，在不牺牲动物的情况下，提供了肿瘤进展的功能和解剖监测。同样，Lee等人，2014年回顾了在原位模型开发过程中使用PET成像的不同文章，发现PET成像是非侵入性研究HCC肿瘤进展[30]的非常好的工具。肿瘤部位和手术部位最初摄取较高可能是由于炎症，随着炎症的减轻而减少。FDG作为葡萄糖类似物，在炎症区和肿瘤均有摄取，因此在早期可能导致错误的结果。我们观察到清晰的CT图像决定了体内肿瘤的准确大小和形状。您正在出版社。他们在原位胶质母细胞瘤建立研究中发现，µCT扫描是了解小鼠原位肿瘤进展的合适工具。 PET images helped us to know the progression of tumor, tumor activity and also small metastatic lesion in other parts of body.U在I期动物中，随着FDG摄取的连续增加，实体瘤的niform诱导得出3x10⁶100 μ l的N1S1细胞悬浮液足以在肝脏上形成所需大小的局部肿瘤，以供进一步研究。

结论

我们成功建立了3 x10原位肝癌大鼠模型⁶N1S1细胞悬浮在100 μ l DMEM中。肿瘤生长控制在4-6周时间内，死亡率最低，这将有助于评估针对肝细胞癌的新治疗策略。大鼠是HCC的良好模型，PET-CT成像被发现适用于监测体内肿瘤进展。该模型可被研究人员和外科医生用于进一步的放射药物或经动脉化疗栓塞(TACE)研究，因为它不需要免疫功能受损的动物和相关的无菌环境。

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