本研究探讨了中医所说的EESL对血管平滑肌调节对控制高血压的意义。实验中使用了血压正常的10wistar白化病大鼠的主动脉环。EESL对5-HT诱导的血管收缩具有双重作用;低剂量(3.5mg/20ml Kreb分离液)增强血管扩张,高剂量(5mg-20mg/20ml)增强血管收缩,这两种作用在去除内皮后消失。然而,当游离克雷布溶液中含有正常钙时,EESL对5-HT诱导血管收缩的增强作用明显大于低钙溶液(p < 0.05)。EESL的活性被发现是钙依赖性NO合酶,因为在Kreb 's溶液中NO合酶抑制剂的存在导致了自发的血管舒张。这些结果表明,EESL作用于5-HT受体亚型,因此EESL的活性是通过内皮细胞进行的。此外,钙依赖性和NO合酶可能是EESL引起血管收缩和舒张作用的机制。
黄豆,内皮细胞,钙通道阻滞剂,持续性动脉血压,一氧化氮合酶
当调节血压的生理系统如血管内皮、l -精氨酸NO通路等发生改变时,持续性高血压(高血压)就会发生。事实上,人类研究表明,高血压与No generation depletion[2]有关。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和促氧化酶调节失调导致的动脉反应性增加,由于跨膜钙通透性过度活跃,增加了基础钙和活化钙水平,因此这种积累释放了自发性高血压大鼠[3]中可见的内皮收缩因子(EDCF)。此外,EDCF级联的重要成分的丰度或敏感性的变化被认为是内皮依赖性收缩水平的贡献,因为前列腺素合成酶[4]、cox-1[5]的表达和位于平滑肌细胞上的内皮细胞对TP接收的敏感性都在自发性高血压大鼠的主动脉中发生改变。因此[5],评估治疗或拮抗持续性高血压的药物使用对获得良好预后有很大帮助。在传统实践中,联合用药,如利尿剂,血管紧张素酶转化酶抑制剂,钙通道阻滞剂和b受体阻滞剂被用作治疗高血压[6]的初始行动线。这些药物在达到黄金目标时发挥的作用是不同的。然而,传统草药制剂的使用,虽然这些植物中的一些机制已经被证实,但其他草药仍在等待其作用机制的证据。
在我们之前关于植物的报道中Securidaca longipendunculata离体心脏[8]和已该植物对心血管系统[9]的调节作用,我们证明了该植物提取物通过钙通道调节血压,但这种调节在多大程度上涉及血管内皮还没有适当的文献记载。已知内皮细胞中钙离子依赖性NO合酶通过释放NO调节正常血压,而NO又调节血管平滑肌张力。因此,本实验旨在评价SL提取物对内皮细胞释放一氧化氮的钙信号的影响。
10只正常血压Wistar大鼠(200-250gm)用氯仿(100%)短暂麻醉后放血。取下胸主动脉,剥离周围结缔组织,切成长约2-3mm的环状段。用管道清洁器轻轻擦拭环的内表面,去除部分环上的内皮细胞,而其他环则完好无损。将每个环安装在不锈钢钩上进行等距张力记录,并置于充满20ml Kreb’s Henseilet溶液(mM) (NaCl, 119.0, KCL, 4.5;CaCl22.5;MgSO41.2;KHPO41.2;NaHCO3.24.8;葡萄糖10.3),用95% O2, 5% CO连续充气2pH值为7.4,温度为37℃。有内皮细胞和无内皮细胞的环分别被施加2000 mg的张力。使用等距张力转换器(Grass Ft 03)监测等距张力变化,该转换器与Grass模型7D测谎仪连接,以记录等距收缩。让环平衡30min,在此期间用5HT (105mol),间隔15min,同时改变克雷伯缓冲液。在5ht诱导的收缩达到最大收缩后,将提取液逐级添加到器官浴中,得到提取液的效果。
提取液对内皮完好和内皮剥离主动脉环的影响
环与5HT (105摩尔),当收缩达到稳定状态时,增加提取物的浓度累积添加。另一方面,切除部分主动脉环的内皮细胞,观察提取物对内皮细胞的影响。
不同钙的作用2 +浓度对萃取诱导反应的影响
使用两种浓度的钙离子(1.0mM和0.4mM)在Kreb的溶液中。环与5HT (105摩尔),直到收缩达到稳态,然后累积增加提取物的浓度,记录反应。
NO阻断对提取物反应的影响
在器官浴Kreb溶液中加入一氧化氮合酶抑制剂NO硝基精氨酸(L-NAME)。环孵育30分钟后,加入累积剂量的提取物,然后记录得到的肌肉收缩反应。
提取物的作用Securidaca longipedunculata对5HT诱导的完整主动脉环血管收缩的影响
使用含正常钙(1.6mMol)的克雷布氏溶液。主动脉环在5HT (105mol)从零水平到1436±13.8 mg力,依次添加EESL提取物。提取物在低剂量(0.1mg, 0.2mg和1mg)时张力没有变化。进一步在溶液中加入2mg EESL,抑制作用显著(P<0.001)5摩尔)诱导收缩力从1436±13.8到660±10.7 mg(累计剂量为3.3mg/20ml溶液)。进一步添加EESL (5mg, 10mg, 20mg 40mg)累积增强5HT (105鼹鼠)引起的主动脉环收缩。最大张力分别为1745±8.00,1930±3.00和1890±6.78mg力,1890±6.78mg力(图1a)。EESL对5HT (105摩尔)全身收缩;低剂量时它抑制5HT,而高剂量时它增强5HT (105(图1a)诱导收缩。
低Ca2+浓度在克雷布氏溶液和收缩反应提取Securidaca longipendunculata
含0.4mM钙的克雷布氏溶液2 +采用1.6mM的离子位来研究钙离子是否在eesl诱导的收缩中起作用。在低Ca2 +(0.4mM),主动脉环在5HT (105mol)诱导的力为471±77.4mg,而在正常浓度的Kreb溶液中得到的力为1436±13.8 mg。收缩达到稳态后,累积添加提取物,在0.1mg、0.2mg、1mg、2mg、5mg 10mg、20mg和40mg的剂量下,收缩值分别为471±77.4mg、471±77.4mg、471±77.4mg、75±00.00 mg、910±47.4、990 43.0和1000±00.00 mg 1000±00.0张力。这些值显著(P < 0.001)小于正常钙离子(1.6mM)的克雷伯氏张力值(分别为1226±13.46mg、1426±13.46mg、1426±13.4mg、660±10.77mg、1745±80.00mg、1930±30.00mg和1890±30.00mg),(图1b)。EESL在高剂量时表现出剂量依赖性的收缩作用,而在低浓度时(3.5mg)提取物抑制5HT (105摩尔)全身收缩。在溶液中加入3.5mg EESL时,低Ca时提取物对5HT (10-5 mol)诱导收缩的抑制作用更明显(P < 0.05)2 +(75±0.00mg张力)2 +(1.6mM)在克雷布溶液(666±10.77mg张力),图1a和1b。然而,浓度低于3.5mg的5HT也没有显示出任何变化(105在两种溶液中均可引起主动脉环收缩。
图1A和B。比较5HT的累积反应(105)预收缩的主动脉环提取Securidaca longipendulata与正常钙离子(A=1.6mMol)和低钙离子(B=0.4mMol)在克雷布氏溶液中。
内皮细胞缺失时对EESL提取物的收缩反应
研究了EESL对无内皮的主动脉环的收缩作用。乙酰胆碱松弛KCl预收缩环失效证实了内皮去除程序的有效性,而对乙酰胆碱的正常反应已被用作内皮功能正常[10]的指标。一些摩擦主动脉环与EESL没有自发活动,而少数环显示轻微收缩。这提示正常内皮衬对EESL正常作用的重要性。
提取物对L-NAME的影响
环在5HT (105摩尔),在含有正常钙的克雷布溶液中。L-NAME在Kreb溶液中孵育的环部分没有收缩反应,而反应小的环则不稳定,组织自发松弛。
本研究结果表明,esl放松了5HT (105在低剂量(0.1mg, 0.2mg, 1mg,和2mg)下,而在高剂量(5mg,10mg, 20mg, 40mg)下,EESL增强5HT (105鼹鼠)引起主动脉环的收缩反应。EESL在5HT (105提示EESL可能作用于血清素能受体。Nilsson等和Chester等证实了人血管中存在多种5HT受体亚型表达,已知其中两种参与了人血管平滑肌的收缩;即5 ht1和5 ht2受体(11、12)。他们还表明5HT1 b或5 ht1亚型介导5HT在人血管平滑肌中的收缩作用。一份来自实验动物研究的类似报告显示了5HT的存在2并介导外源性血清素[13]。尽管这项研究并没有试图完全描述提取物作用的受体类型,但早期的报告表明,外源性血清素通过5HT介导其作用2受体;这说明EESL的增强作用可能是通过同一个5HT来实现的2外源性血清素受体。
这是一个重要的发现,因为血清素能受体的增强或激活是治疗抑郁和幻觉[14]的机制。事实上,它的根提取物大多用于传统医学中治疗精神疾病,因此被称为“Maganin Mayu”(即女巫的药)。在南非,Chopi和Kung部落用树根作为被恶魔附身的人的药,并在治疗部分,[15]。这个地区需要进一步调查。
鉴于低剂量EESL引起的短暂弛豫,因此这种弛豫可能是由5HT以外的另一种5HT受体亚型引起的2受体或其他机制,可能是内皮衍生的放松因子。然而,其他证据表明,在桡动脉观察到的5HT和舒马曲坦之间的相互作用会产生共同刺激,释放内皮源性血管舒张因子,抑制这两种药物[16]引起的收缩。
很可能在低剂量的EESL, 5HT (105因为Adrian等人的令人信服的报告表明5HT2 b和5 ht1 c亚型受体通过一氧化氮释放[16]介导大鼠和猫颈静脉,也可能是猪肺动脉的内皮依赖性弛缓。EESL是否也具有这种行为需要进一步的研究。
在高剂量提取物中观察到的EESL对5HT诱导的收缩的增强作用也可能与钙通道机制有关。既往对兔离体心脏的研究表明,EESL对冠状动脉的收缩作用可被硝苯地平(钙离子通道阻滞剂[8])拮抗。这一事实表明,浓度依赖性因素促成了钙通道的打开或关闭。Stanislav等人的发现支持了高钙浓度导致快速开放,而低钙浓度导致钙通道[17]激活缓慢的观点。
通过使用两种生理盐溶液(1.6 ~ 0.4mM)中不同浓度的外源钙离子,进一步研究钙是否在EESL诱导的弛豫和收缩反应中发挥作用。结果表明,在低外源Ca条件下2 +EESL对5HT (105鼹鼠)诱导收缩减少。在0.4 ~ 1.6mM的克雷布溶液中,环的收缩相对较小。这一发现支持了先前的报告,即当外部Ca2 +浓度降低,可被钙离子载体A23187诱发[18,19]。
这是一个可以想象的事实,收缩激动剂利用钙从两个主要来源平滑肌:细胞外和细胞内[20]。提示EESL利用了细胞外钙。本研究发现,在含钙较少的介质中,环的低收缩反应得到了支持。因此,这项研究表明,提取物引起的收缩依赖于钙离子。钙通道的作用也通过在含有0.2mg硝苯地平的Kreb溶液中孵育来研究,在那里记录绝对弛缓。这些发现进一步支持了我们早期的观点,即在EESL和硝苯地平联合给药后,冠状动脉血流明显增加是由于钙通道的阻塞,而提取物调节了这些通道[8]。
许多研究观察到内皮通过内皮源性收缩因子和内皮源性放松因子调节血管平滑肌的重要性[21,22]。内皮细胞可通过产生NO、前环素和非特征性内皮衍生超极化因子[23]诱导血管平滑肌松弛。另一方面,内皮也可以通过产生血管收缩素类内皮依赖性收缩因子[22]来收缩底层的血管平滑肌。
NO在内皮细胞中由l -精氨酸的胍基-氮端通过组成性NO合成酶III (eNOS)形成。NO合酶III的激活取决于内皮细胞中钙离子的细胞间浓度,因为它是钙2 +-calmodulin-dependent。NO扩散到血管平滑肌细胞,主要通过刺激循环3的产生使其放松151-单磷酸鸟苷(cGMP),导致抑制收缩过程[24]。这些可能被看作是对5HT的弛豫反应机制(105低剂量EESL引起的收缩。在本研究中,NO参与扩张机制的作用是因为多项研究表明,一氧化氮对内皮依赖性收缩[10]的产生具有急性和慢性抑制作用,因此,用NO合酶阻滞剂L-NAME预处理主动脉环以优化内皮-环氧合酶依赖性收缩的产生是合理的[3,25]。在高剂量L-NAME存在时,没有得到收缩。这可能是由于EESL无法在内皮细胞中积累和释放足够的钙,从而触发内皮源性收缩因子级联的初始步骤。EESL在L-NAME存在时不能产生内皮依赖性收缩的事实与之前关于乙酰胆碱对主动脉环[26]影响的数据一致。研究表明,当L-NAME缺失时,乙酰胆碱积累的钙离子在WKY和SHR中引发氧化应激的释放,后者更明显,但当L-NAME或抗氧化剂都存在时,这一过程被阻止。EESL的作用类似于乙酰胆碱对经L-NAME[3]预处理的主动脉环的作用,因为L-NAME的存在影响了乙酰胆碱对钙离子的积累,从而触发氧化应激的诱导,所以也没有收缩。内皮依赖性收缩被认为是高剂量提取物观察到的收缩的原因。这一观点得到了以下观察结果的支持:(1)克雷布氏溶液中钙浓度过高会引起更多的收缩反应。(2)去除内皮后无收缩。
这一数据支持了细胞内钙离子增加对内皮依赖性收缩的产生是必要的这一概念[18,25]。其他研究也表明,高钙水平是启动内皮来源的收缩因子释放所必需的,像A23187这样的物质,增加钙离子进入,导致自发性高血压和正常高血压大鼠[3]的收缩。
去内皮化进一步研究内皮细胞在EESL效应中的调节作用。一些环表现出很少的收缩,而另一些环对eesl诱导的收缩没有任何反应。一种解释是内皮细胞构成了扩散屏障,它的去除可能会破坏内皮细胞钙离子的运输机制。这说明EESL可能是通过钙离子通道积累内皮细胞钙离子而诱导收缩的。因此,我们认为EESL对血管具有双重作用;低剂量放松主动脉环,而高剂量增强5-羟色胺诱导的主动脉收缩,因此证明了草药使用该植物控制高血压和精神疾病。结果表明,EESL通过内皮细胞、钙离子通道和5-羟色胺受体作用,钙离子对血管平滑肌EESL的调节具有双重作用;要么是通过受体介导的细胞内钙离子增加,导致NO的形成,要么是通过钙离子的过量积累而收缩。
- Rees DD, Palmer RM, Moncada S(1989)内皮源性一氧化氮在血压调节中的作用。美国国家科学研究院86: 3375 - 3378。(CrossRef)
- 王晓燕,王晓燕,王晓燕(1990)原发性高血压患者内皮依赖性血管舒张异常。N英语J医学232: 27。(CrossRef)
- 唐依合和,梁福平,黄燕,Feletou M, So KF,等(2007)内皮细胞释放内皮源性收缩因子时内皮细胞中钙和活性氧的增加。溴J药典151: 15 - 23。(CrossRef)
- Numaguchi Y, Harada M, Osanal H, Hayashi K, Toki Y等(1999)自发性高血压大鼠胸主动脉前列环素合成和前列环素受体基因表达的改变。Cardiovasc Res41: 682 - 688。
- Ge T, Hughes H, Junquero DC, Vanhoutte PM, Boulanger CM(1995)自发性高血压大鼠主动脉内皮依赖性收缩与前列腺素H合成酶表达增加和H2过敏相关。Circ Res 76: 1003-1010。(CrossRef)
- 王晓燕,王晓燕,王晓燕(1999)。初始药物选择对降压治疗持久性的影响:实际实践数据的重要性。中华医学会杂志160:41-46。
- Al Disi SS, Anwar MA, Eid HA(2015)抗高血压药物及其作用机制。第1部分。前药物杂志6:323(CrossRef)
- Salami HA, Ayo JO, Adelaiye AB, Olorunshola KV (2016)Securidaca longipedunculata离体兔心。欧洲J生物制药公司Sci 3:103 - 108。
- Salami HA, Adelaiye AB, Tukur MA, Olorunsola KV, Ayo JO(2018)心血管系统对乙醇提取物的体内调节反应Securidaca Longipendunculata在白化大鼠中。外科病例代表2: 1 - 4。
- 杨东,Glaulis P,张金金,Vanhoutt PM, peltov M(2004)自发性高血压和正常高血压大鼠主动脉内皮依赖性收缩对乙酰胆碱、ATP和A23187钙的影响。Fundam Clin Pharmacol18: 321 - 326。(CrossRef)
- Nilsson T, Longmere I, Pantery E, Bard J, Branchel T,等。(1991)用分子和药理技术表征人冠状动脉中的5-羟色胺受体。欧洲药典372: 49-56。(CrossRef)
- Chester AH, Martin GB, Bodelssan M, Arneklo NB, Tadjkarimi S,等(1990)健康和疾病的人心外膜冠状动脉羟色胺受体谱。Cardiovasc Res25日:932 - 937。
- 王志强(2001)慢性心力衰竭的病理生理学研究。Am J medical110: 37 s-46s。(CrossRef)
- Marek GJ, Carpenter LL, Mcdougle CJ, Price LH (2003) 5HT2A拮抗剂和选择性血清素再摄取抑制剂在神经精神障碍中的协同作用。神经精神药理学28日:402 - 412。(CrossRef)
- Winkleman M, Dobkin de Rios M (1989) Kung bushman药用植物的精神活性特性。J精神活性药物21:51-59。(CrossRef)
- Adrian HC, Mohamed A, Camilla AS, Magdi HY(2000)桡动脉中血栓素A2与5-羟色胺之间的相互作用。创药物杂志35: 89 - 93。
- 史丹尼斯拉夫,史丹尼斯拉夫,史丹尼斯拉夫,史丹尼斯拉夫,史丹尼斯拉夫(2000)伊斯拉平阻断钙通道的分子机制。药物诱导的失活通道构象的作用。J生物化学275: 22114 - 22120。(CrossRef)
- Gluais P, Paysant J, Badier-Commander C, Verbeuren T, Vanhoutte PM等(2006)SHR主动脉中钙离子载体A-23187释放前列环素和血栓素A2作为内皮源性收缩因子。心脏循环物理291: H2255-H2564。(CrossRef)
- Shi Y, Feletou M, Ku DD, Man RY, Vanhoutte PM(2008)钙离子载体A23187诱导链脲佐菌素糖尿病大鼠股动脉内皮依赖性收缩。溴J药典150: 624 - 632。(CrossRef)
- Bolton TB(1979)传递素和其他物质在平滑肌上的作用机制。杂志牧师59: 606 - 718。(CrossRef)
- Vanhoutte PM, Feleton M, Taddei S(2005)高血压的内皮依赖性收缩。溴J药典144: 449 - 458。(CrossRef)
- Vanhoutte PM, Tang EH(2008)内皮依赖性收缩。当好人变坏的时候?杂志586: 5295 - 5304。(CrossRef)
- Büssemaker E, Popp R, Fisslthaler B, Larson CM, Fleming I,(2003)老年自发性高血压大鼠肾动脉出现内皮源性超极化因子介导的弛豫选择性丧失。高血压42: 562 - 568。(CrossRef)
- 内皮控制血管舒缩功能从健康到冠状动脉疾病。中国保监会J67: 572 - 575。(CrossRef)
- 杨东,格洛阿利斯·P,张金金,Vanhoutte PM, peltov M(2004)自发性高血压大鼠一氧化氮与乙酰胆碱释放的内皮依赖性收缩叛徒的失活。心血管药理学J43: 820 - 825。
- 朱杰,于敏,Friesema J,黄婷,Roman RJ(2004)盐诱导的ANG II抑制损害大脑动脉平滑肌细胞对前列环素的反应。心脏循环物理288: H908-H913。(CrossRef)