看看最近的文章

摘要

在2015年14月20日西非埃博拉疫情爆发期间，约有24个组织在几内亚、塞拉利昂和利比里亚的40个地点运营实验室。在西非三个国家的16个地点部署了实验室的10个组织的代表在达喀尔(2016年2月4日至5月5日)召开了为期两天的研讨会，交流他们的经验。本文总结了在讨论疫情期间实验室部署经验时所提出的组织和程序问题。

关键字

埃博拉病毒;西非流行病，流动实验室部署

OAT版权所有。版权所有

简介

西非前所未有的埃博拉病毒爆发引发了国际反应，所有现有或正在萌芽的移动实验室概念都被部署到实地。除了前几篇文章中描述的一些个人经验外，还有一些经验是全面的，在这里我们试图总结所遇到的问题和从中吸取的教训。我们希望这可以帮助其他移动实验室的概念修改和优化他们的设置和程序。同样很明显的是，诸如世卫组织全球移动实验室反应网络这样的伞形组织应该注意到这些经验，以考虑解决方案，为未来可能大规模部署移动实验室做准备。联合王国政府已经出版了一份关于[1]疫情教训的出版物。这里的重点是在流动实验室工作的工作人员取得的经验。

讨论以下主题:基础设施问题，分析前供应链，使用分子分析的分析和临床方面，实验室程序。最后，我们总结了疫情平息后需要关注的领域，用一段话描述了疫情后的需求。

基础设施

电

大多数实验室面临着不稳定的电力供应，有不稳定的电涌和停电。一些小组为提供独立能源供应而带来的发电机面临正确类型的燃料供应短缺，不得不组织自己的供应链。有一次，南非队带来的发电机坏了，幸运的是当地政府更换了发电机。

电力供应可能是基础设施落后国家的一个主要问题。由于缺乏电力供应，实验室无法正常工作，实验室空间也无法进行必要的冷却。

使用的替代电力来源是通过电源转换器接通的汽车。皮卡通常是在他们的极限，如果他们被敲打和他们自己的系统(如空调)不能同时使用。不间断电源(UPS)很难充电，因为当地的电力供应不够稳定/强大，无法给UPS充电。太阳能电池板被用于几内亚达喀尔巴斯德研究所团队使用的手提箱实验室。

对于未来的重大行动，一些人应该考虑如何确保发电机使用相同的燃料，以及国际社会如何监督供应安全。一种可能是与国际石油行业合作，帮助建立供应链。由于电力工程师短缺，无法维持电力连接和修复损坏，这被视为未来疫情部署需要国际保护伞支持解决的另一个问题。

互联网

如今，互联网是传播结果和维护现代实验室设备(如机器人平台系统)的基本实验室基础设施，其中一些设备是通过互联网更新甚至启动的。在使用Minion定序器的情况下，事实证明，即使是数据分析(共识调用)也依赖于互联网连接。大多数移动实验室团队都经历过互联网连接不稳定或Wi-Fi连接不稳定的问题，讨论了是否可以通过现场卫星连接解决这一问题，例如质量高但价格昂贵的VSAT系统。缺乏能够处理不稳定和临时操纵系统的IT专家也很突出，应该在未来得到照顾。

预分析供应链

分析前供应链是大多数实验室非常关注的问题。相关的个人群体(采样、包装、运输和交付)大多不知道接收样品的实验室团队或供应链的各个部分实际需要什么，以及他们将如何处理收到的样品。样本是由穿着全套个人防护装备(包括部分个人防护装备和不带个人防护装备)的人员通过各种交通工具带来的。一些实验室团队决定完全信任运送样本的人，尽管他们的装备各不相同，出于自身利益，他们必须知道自己在做什么。

供应链中最困难的方面是没有统一的案件ID表格。几乎每个实验室团队都试图通过使用来自国内工作系统的病例ID表格、这些表格的翻译版本或国际公认组织的可用表格(CDC病例ID表格)来解决这种情况。简单地分发复制的表格会导致分配给几个严重病例的原始模板的多个相同条形码的混淆，因为ETC的工作人员只是重复地复制它们。表格必须贴着条形码分发。例如，荷兰团队使用了疾病预防控制中心的病例ID表格，并在上面粘贴了他们自己的条形码。

病例ID表格往往是在“热”样本袋中交付的。有些字迹难以辨认;由于浸泡在袋子里，许多都被浸湿了，流血了，或者被撕碎了。出于这个原因，大多数实验室都创建了一个入口入口或屏障，样品及其病例ID表格必须被交付，然后在将它们传递到实验室区域之前进行安全处理。

意大利团队将收据上的箱包ID表格手工复制到新表格上，德国团队将其复制到可净化的纸质表格(pretex®50.150)上，另一个团队使用智能手机箱包ID表格，通过Wi-Fi连接发送到实验室。

所有这些经验的一个教训是，一个普遍接受的国际病例ID表是必要的。此外，还有一项基本要求，即必须有一个单一的患者标识符，以便能够跟踪患者在保健中心和治疗中心之间的移动。世卫组织全球应急反应网络应对下一次疫情情景时应考虑到这一切。

此外，世卫组织未来在分析前供应链中提供当地支持的应急培训包必须向所涉及的每个链环节传达对供应链的理解，以及每个链环节的样品的情况。

在相当数量的情况下，长距离运输需要很长时间，并可能对样品处理和分析结果产生影响。因此，移动实验室的位置旁边的ETC被证明是最好的解决方案。它在某些情况下促进了沟通和信息交流，特别是通过ETC和实验室工作人员之间的联席会议。它减少了样品的传递时间，但使用了样品从热区到绿区转移的几个概念。例如，意大利实验室通过窗户与热区相连。通过喷洒氯进行外部净化后，这些样本被留在了窗户外面。

数据管理

现场没有实验室信息管理系统(LIMS)。临时系统包括通过手机或短信以csv文件的形式交换结果。这些系统本身就违反了保密性。然而，由于需要传达结果，它们仍然被使用。特别是短信很容易出错，电话号码混淆是一个经常发生的问题。简单的csv格式与各种计算机操作系统兼容。然而，普遍的意见是，应该开发一种基于移动电话的应用程序，以便能够安全地将采样小组的结果传输到实验室，并从实验室传输到ETC的HCW。然而，已开发的概念还应允许与地方政府当局轻松共享数据，同时为个别患者保密。

分子分析的分析和临床方面分析敏感性

一个主要的讨论点是所使用的分子检测分析的灵敏度。大多数实验室将CT> 35的实时PCR (rtPCR)结果视为模棱两可，并重复测试，或提取和测试，或尝试替代测试。一般认为，在这些情况下，有必要在2天后进行后续测试。如果病毒滴度的上升(CT<35)与不断变化的临床图像相匹配，则该测量方法通常有助于识别急性EVD病例。对于相反的结果(CT> 35，或无CT)，临床图像也必须匹配并表明EVD结束。然而，没有标准的方法来释放先前rtPCR阳性，然后是阴性的患者。检测到IgM升高被视为开始康复的确认。

在几内亚，研讨会期间正在讨论以下方法:如果埃博拉病毒病患者在几天内不再表现出症状，则应使用rtPCR检测血液样本。如果是阴性，48小时后应重新检测患者的血液。如果仍为阴性，则认为可以安全出院。

南非研究小组调查了CT值与复制EBOV存在之间的相关性。他们发现可以从CT≤30的样本中分离出EBOV，但不能从CT > 33的样本中分离出EBOV。似乎存在一个灰色地带，从CT 30-32的样本中零星分离。比较三种实时PCR系统，每毫升RNA拷贝的范围一致对应成功的病毒分离为9.12 x10⁹到1.33 x10⁵拷贝/毫升血清。在1.31 × 10的范围内⁵到2.42 × 10⁴拷贝数/ml，未分离出EBOV [2]。

内部阳性控制

分子分析中使用了多种内阳性对照(IPC)。分子IPC(来自质粒的RNA转录本)被用作抑制和效率控制，一般来说，人工提取的IPC检测比机器人提取的变化更大。在提取和测试运行中使用负拾取控制也是常用的特性。一般来说，人类管家基因不被认为是可靠的，因为它们的表达水平可能相差很大。然而，在疫情期间，对拭子样本中的人体物质进行基因检测，例如通过检测RNASE P基因，被发现是有帮助的。在CDC发布的原始协议的合同中，允许检测RNASE P DNA，许多操作人员更喜欢mRNA检测，因为这也可以作为RNA提取控制。很明显，需要明确的外部质量评估(EQA)小组来持续开发分析方法，测试的质量控制应包括随着时间的推移IPC的CT漂移，以避免IPC效率的损失。

一些较大的团队面临的一个主要特征是人员的周转，以及可以从一个团队移交给下一个团队的sop的需求。即使SOP发生了变化，也有必要对这种变化进行文档记录，以使团队能够从已达到的检测质量水平出发，而无需重复以前在疫情期间使用检测所取得的经验。

程序方面

在讨论实时PCR检测从收到样品到结果的周转时间时指出，在各个移动实验室中使用的手动、半手动提取和分子扩增管道与GeneExpert系统一样快，平均大约需要3hrs[2]。当涉及到移液步骤的数量时，GeneExpert系统更简单，但总体而言，与现有的管道相比并没有多大优势。

尽管GeneExpert系统现在被认为是一种易于适应的系统，因为它已经通过现有的艾滋病毒和结核病项目得到了广泛应用，但人们怀疑该系统是否足够灵活，例如目前无法用于本迪布吉约病毒，尽管已宣布，但尚不清楚该设备的开放平台是否以及何时将允许自由开发分析。

同样绝对明显的是，“床边测试”这个术语完全是一种误导，因为ETC的工作人员被他们照顾病人的任务所淹没，根本没有时间和范围来处理样本的床边测试。床边取样是常规的一部分，因此在ETCs旁边的移动实验室的组合被证明是最有效的。

临床敏感性

在EDV暴发中取得的经验导致了以下分子测定临床参数的明确评估:由于测试的样本人群(大约10%的测试人群(病例定义分诊)为EBOV阳性)，EDV暴发中使用的测试具有较高的阳性预测值(PPV)，并且在大多数情况下敏感性< 1。这意味着在暴发情况下，所有阳性检测都是真正的阳性，但可能遗漏了一些阳性检测。医生们意识到了这种情况，但对只有真正呈阳性的患者才能入住隔离病房这一事实感到欣慰。如果出现症状，在第一次检测中遗漏的阳性病例很可能在后续检测中发现。

目前，有人建议将护理点机器人平台的要求提高到高PPV和灵敏度为1。这一要求的后果显然没有得到充分考虑。敏感度为1的患者可能会被送往埃博拉隔离病房，在那里他们最有可能感染埃博拉病毒，并承担所有可能导致的后果。如果严格遵守这一新要求，就会将漏掉某些阳性反应的社区风险转化为允许将未受感染的个人送入隔离病房的个人风险。从本质上讲，目前的ETC结构必须彻底改革，以保护那些假阳性的非感染患者，这意味着个人护理的基础设施。这被认为是etf基础设施的复杂因素。这将使它们的建设、组织和人员配备更加困难。

另一方面，有人建议包括一些设施，供等待出院的患者使用，如上文讨论的渐进式阴性测试(例如足球场)。

一般来说，强烈建议将单个分子分析的特征与临床数据联系起来。一些流动实验室每周与临床工作人员开会讨论病例。这被认为是提高对现有专门知识的相互赞赏的一个非常好的措施。即将开展的流动实验室和医疗队培训方案应包括针对这些非常不同的小组及其不同技能的相互培训单元。

实验室程序

失活

RNA提取过程中采用以下灭活方法:AVL-Buffer(含有胍硫氰酸盐的裂解缓冲液，Qiagen, Hilden，德国)+乙醇[3,4]，AVL-Buffer + 60°C/15min [5,6]， AVL-Buffer + 1% Triton-X-100 [7]， speedextract Suspension A (Qiagen, Hilden，德国)+ 95°C/10min[8]。所有这些都显示能灭活患者样本中的EBOV。

在会议期间提出了一种制备含有商业上可用的失活缓冲液的失活管的可能性，该缓冲液可以很容易地制备和在采样期间使用，并已同时发表。

大多数团队对血清学样本采用以下灭活方案:60°C/15分钟/30分钟[5]热灭活或0.1% Triton-X-100化学灭活15-20分钟[7,10]或4%多聚甲醛[4]化学灭活。

一个主要的担忧是用于临床化学的样品。首先，许多不同类型的管用于不同的分析系统。对许多人来说，不清楚这些样本是如何灭活的。出于谨慎，临床化学设备因此被用于手套箱系统。然而,Piccolo Xpress化学分析仪和i-Stat在热区使用的去污剂(漂白剂)具有腐蚀性，并且需要环境温度(必须有空调)。有些装置不适合在负压下使用。一种新的用于临床化学测试的样品失活方案描述了使用0.1% Triton-X-100/60min[11]。

手套箱

不同的团队使用了不同的手套箱。对于较大的固定手套箱(固定在实验室帐篷中)或较小的移动手套箱(灵活的弹出式塑料或硬塑料)，目前还没有国际公认的标准。其中大部分采用负压，一个移动硬塑料盒没有使用任何负压。应制定规范，并就获得的负压值、使用的过滤器类型和过滤器更换间隔达成一致。建议使用鼓风机测试来评估手套的负压和完整性。然而，这需要一些考虑，因为BSL 3/4实验室维护要求的复杂性不应逐个转移到现场实验室，而英国健康与安全执行局发布的手套箱维护指南只能作为本次讨论的起点[12]。我们需要一种安全而务实的方法。许多操作人员发现，在固定手套的基础上使用实验室手套可以提高灵巧度。

去污

在比较去污方案时发现，大多数0.5%的漂白剂用于日常清洁(实验室内部使用0.1%)和外部样品容器去污，0.05-0.1%的漂白剂用于手套或洗手，1%的漂白剂用于手套盒内部，5%用于手套盒去污。

马森塔的法国团队每天使用过氧乙酸对III类安全柜进行一次消毒(在事先用0.5%漂白剂灭活废物后)。Piccolo和i-STAT仪器及离心机经0.5%漂白剂体外净化后装入密封袋中，避免在灭菌过程中与过氧乙酸接触。

达喀尔巴斯德研究所使用的是1%的Incidin。这种消毒剂被认可用于西非法语国家，没有腐蚀性。它应被视为使用漂白剂的一种替代办法，因为在流动实验室工作的相当多的国际工作人员报告说呼吸道受到刺激[13]。它还可以改善一些实验室齿轮所遭受的腐蚀问题。

Post-epidemic需求

在暴发期间，在几个地点广泛收集了EVD患者样本。英国和意大利已与塞拉利昂政府公司签订合同，允许在欧洲实验室规范地转移和使用样本。应评估这些示范性合同，以便为未来的疫情起草模板合同。并非所有案件都使用了合同，有些样品收集是在没有正式协议的情况下转移的。然而，在场的每个人都同意，正式协议应该是规则，以避免个别研究团队或财团决定样本，并向科学界提供这些样本。

讨论了需要解决的研究问题，资助机构应将该候选主题列入研究议程

1. 分子检测结果与临床症状及疾病进展的相关性
2. 测定各种样品类型(血液、尿液、棉签)检测测定的适用性
3. 疾病解决后低滴度样品中残留传染性的测定
4. 母婴传播及急诊剖宫产中HCW传播的研究。
5. 目前迫切需要为病毒性出血热鉴别诊断的研究提供资金
6. 改进协助采样和运输样本的当地工作人员的培训的概念
7. 为未来突发疫情做好准备，特别关注通关、冷链供应、燃料供应、移动互联网供应等供应物流。
8. 开发一款安全易用的手机LIMS应用程序，用于基础设施薄弱的紧急情况。

确认

本项目已根据N°115843赠款协议获得创新药物倡议2联合承诺的资助。这项联合承诺得到了欧盟地平线2020研究和创新计划以及EFPIA的支持。

参考文献

1. HoCSaT委员会(2016)紧急情况下的科学:英国从埃博拉吸取的教训。编辑。伦敦:英国下议院科学技术委员会。
2. 张晓东，张晓东，张晓东，等。(2015)基于GeneXpert埃博拉病毒检测技术在塞拉利昂埃博拉病毒病诊断中的应用。开放论坛感染疾病2.(Crossref)
3. 张晓明，张晓明，张晓明，等。(2015)埃博拉病毒在临床样本中的抗埃博拉病毒活性研究。临床微生物学53: 3148 - 3154。(Crossref)
4. Haddock E, Feldmann F, Feldmann H(2016)埃博拉病毒的有效化学灭活。新兴感染疾病22日:1292 - 1294。(Crossref)
5. Saluzzo JF, Leguenno B, Van der Groen G(1988)热灭活病毒性出血热抗原在血清学检测中的应用。J病毒方法22日:165 - 172。［Crossref］
6. Mitchell SW, McCormick JB(1984)拉沙、埃博拉和马尔堡病毒的物理化学失活及其对临床实验室分析的影响。临床微生物学20: 486 - 489。［Crossref］
7. Colavita F, Quartu S, Lalle E, Bordi L, Lapa D，等。(2017)Triton X-100对埃博拉病毒传染性的灭活效果评价。临床病毒86:观众。(Crossref)
8. Faye O, Faye O, Soropogui B, Patel P, El Wahed AA，等(2015)2015年几内亚开发和部署了一种快速重组酶聚合酶扩增埃博拉病毒检测方法。欧元Surveill20.(Crossref)
9. Rosenstierne MW, Karlberg H, Bragstad K, Lindegren G, Stoltz ML，等。(2016)用于安全核酸检测的埃博拉病毒床边快速灭活。临床微生物学54: 2521 - 2529。［Crossref］
10. 刘锐，王安，王宗杰，冯志强，陈晓明，陈志强(2015)埃博拉病毒灭活技术在恶性疟原虫疟疾诊断中的应用。临床微生物学53: 1387 - 1390。［Crossref］
11. 滕佩丽，李志强，李志强，李志强，等。(2015)利用Triton X-100降低埃博拉病毒感染患者常规检测生物危害的临床实验室诊断性能。临床化学实验室医学53: 1967 - 1973。［Crossref］
12. 联合王国健康和安全执行局(2011年)《用于遏制生物制剂的实验室和动物隔离器的使用、测试和维护指南》。
13. Mehtar S, Bulabula ANH, Nyandemoh H, Jambawai S(2016)人类故意暴露于氯-西非埃博拉疫情的后果。抗微生物药物耐药性和感染控制5: 45。