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摘要

过多的果糖与活性氧(ROS)的产生有关，活性氧会抑制酶，如乌头酶，而乌头酶会影响线粒体代谢。然而，目前还缺乏研究过量果糖对线粒体代谢途径和底物利用的影响。我们评估了过量果糖对肝细胞线粒体酶的影响;柠檬酸合成酶(CS)，乌头酶和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(GOT)。此外，使用复杂的i -连接底物[丙酮酸+苹果酸(PM)，谷氨酸+苹果酸(GM)和PGM]的高分辨率。果糖使乌头酶和GOT活性分别降低35%和47%。在泄漏、OXPHOS和ETS状态下，GM降低呼吸，但PM和PGM不降低呼吸。因此，过量的果糖会抑制GOT活性，降低线粒体泄漏呼吸、OXPHOS和ETS能力。这些变化可以通过复合物-1连接呼吸(底物GM)观察到。因此，果糖通过GOT酶破坏线粒体呼吸和底物利用。

关键字

果糖，线粒体酶，线粒体呼吸，复杂的i连接底物

简介

越来越多的人对现代饮食中以高果糖玉米糖浆的形式过量摄入果糖的健康感到担忧。摄入果糖后，约75%的果糖通过果糖分解被肝细胞代谢，用于糖的生成、乳酸的产生和甘油三酯的合成[2]。这一途径的第一步是果糖的磷酸化，通过高亲和力的酮己糖激酶(果糖激酶)酶将果糖磷酸化为1-磷酸果糖。由于该反应具有较低的Michaelis常数，且不受变素或激素控制，血浆果糖迅速清除，肝细胞内的三磷酸腺苷(ATP)迅速消耗。ATP的消耗刺激腺苷单磷酸脱氨酶，激活嘌呤降解途径，导致尿酸的产生[4,5]。过量尿酸增加肝细胞中线粒体活性氧(ROS)的产生[6,7]，从而导致包括乌头酶[8]在内的许多ROS敏感线粒体酶的缺陷。已知过量ROS产生[9]和降低乌头酶活性[10]会影响线粒体代谢。然而，目前还缺乏对过量果糖对线粒体代谢途径和底物利用的影响进行深入调查的研究。这样的调查很重要，因为产生的数据可以建立在以前的研究基础上，有助于了解过量果糖对代谢的不利影响。我们假设果糖损害肝细胞的线粒体代谢途径和底物利用。 Therefore, the aim of this study was to investigate the effects of excess fructose on mitochondrial metabolic pathways and substrate utilization.

材料和方法

细胞培养

HepG2细胞系来自科学和工业研究理事会(CSIR) (Stellenbosch，南非)。细胞系最初在25cm内繁殖²烧瓶(Bibby Sterilin, Stone, stfordshire, UK)， 37°C, 5 mL DMEM (Gibco BRL, Inchinnan, Scotland)，含10% (v/v)胎牛血清，20 mM HEPES, 10 mM NaHCO_3.， 100 μg mL^－1青霉素G, 100 μg mL^－1硫酸链霉素(Whittaker Bioproducts, Walkersville, MD, USA) pH值7.5。细胞孵育24小时以允许附着和生长到半融合和传代1:3每4-5天。一组细胞接受正常生长培养基(对照组，DMEM，持续72小时)，而第二组细胞暴露在添加过量果糖(15 mM, 72小时)的生长培养基中，如前所述[6]。

酶活性测定

样品制备HepG2细胞均质于提取液(0.1 M Tris-HCl;15 mM三羧酸;pH 7.8)，在冰上孵育20分钟。匀浆以10000转/分离心20分钟，取上清作为样品进一步实验。随后的酶测定是根据Wang先前描述的修改方案进行的et al。[11]。

柠檬酸合成酶:在比色皿中加入:柠檬酸合酶缓冲液(0.1 M Tris-HCl, 1.25 mM 1,5 ' -二硫代-[2-硝基苯甲酸]在去离子水中，pH 8.0) 473µl，样品2µl，草酰乙酸-乙酰辅酶a溶液25µl (50 mM草酰乙酸，5 mM乙酰辅酶a钠盐在去离子水中;pH 6.5)，旋涡彻底。用纯缓冲液设置空白读数后，在分光光度计中在412 nm处读取吸光度。用吸光度来计算比酶活性(fmol.cell^－1.min^－1)[11]。

顺乌头酸酶:制备由0.5 mM NADP组成的反应混合物(490µl)⁺溶液，5 mM乌头酶缓冲液(0.005 v/v氯仿，10 mM柠檬酸钠和160 mM三乙醇胺在dH₂O;pH 7.4)， 0.5 mM MgCl₂异柠檬酸脱氢酶标准。将十微升的这种样品加入比色皿中，进行彻底的旋流。混合物在室温下孵育2-3分钟使其平衡，用缓冲液冲淡后在340 nm处在分光光度计中读出吸光度。用吸光度来计算比酶活性(fmol.cell^－1.min^－1)[11]。

Glutamate-oxaloacetate转氨酶:用商用标准ELISA试剂盒(Sigma Aldrich, Kempton Park和约翰内斯堡)测定谷氨酸-草酰乙酸转氨酶的活性。细胞在冰冷的GOT缓冲液中均质，超声并以13000 rpm离心10分钟。所用标准浓度为0- 10nmol well^－1．每孔加入反应混合物[酶、底物和显色剂](1ml)和上清液(50µL)。旋动混合物，37°C孵育3 min，每5 min测量一次(A450)，共30 min。使用公式计算最终的GOT活性，数据用nmol.min表示^－1毫升^－1，如先前报道[11]。

B=在初始读数和最终读数之间产生的谷氨酰胺量(nmol)

反应时间= T_最后- t_最初的(分钟)

V=加入到每个孔中的样品体积。

线粒体呼吸

使用Oroboros 2K oxygraph (Oroboros®仪器，因斯布鲁克，奥地利)在37°C下测量线粒体呼吸率[12,13]。对照组和果糖处理的细胞经过胰蛋白酶化，以16000转/分钟的速度离心3分钟。计数细胞(每毫升100 000个细胞)，离心并将细胞颗粒悬浮在2 mL含有洋地黄苷(10 mg/mL DMSO)的DMEM(每2毫升200 000个细胞)中15分钟以诱导透性。为了评估渗透性是否对细胞没有损伤，细胞色素-c滴定被包括在呼吸方案中。如文献[13]所述，氧通量信号的峰值表明洋地黄素破坏了线粒体完整性，在这种情况下，实验将停止。洋地黄苷处理过的细胞用呼吸介质(MIR05, 2 mL)清洗并重新悬浮，加入每个氧腔。腔室氧含量高(200 ~ 450 μmol L)^－1)，让氧通量稳定约30分钟。氧通量(pmol.s^－1.mL^－1)使用DatLab软件(Oroboros®仪器，因斯布鲁克，奥地利)进行记录。以下复合i -连接底物组合被用于评估泄漏、OXPHOS和ETS状态下的呼吸作用:a) 5mm丙酮酸盐+ 2mm苹果酸盐(PM) b) 10mm谷氨酸盐+ 2mm苹果酸盐(GM) c) 5mm丙酮酸盐+ 10mm谷氨酸盐+ 2mm苹果酸盐(PGM)[12,13]。我们选择PM底物是因为它在三羧酸循环中通过乌头酶代谢，而GM底物绕过这种酶。因此，我们想要评估哪种底物组合对三羧酸循环酶缺陷敏感，此外，我们使用PGM，因为它是络合- i连接呼吸常用的底物。

为了诱导泄漏呼吸，将三种底物组合中的一种添加到含有渗透细胞的腔室中[12,13]。随后，加入2.5 mM二磷酸腺苷(ADP)刺激氧化磷酸化(OXPHOS)能力，然后加入10 μM cytochrom - c检查线粒体外膜完整性[14]。加入寡霉素(2.5 μM)引起另一种泄漏状态。羰基氰化物间氯苯肼(CCCP)是一种化学解耦剂，以0.05 μM逐级滴定，直到达到电子传递系统(ETS)容量的最大容量。加入配合物I的抑制剂鱼藤酮(0.5 μM)测定剩余耗氧量(ROX)。实验在不同的场合重复使用三底物组合。滴定抗坏血酸和TMPD，测量复-4连接呼吸/线粒体含量。所有呼吸状态下的氧通量均归一化为TMPD通量/复合4-氧通量，以校正每个氧测仪腔中细胞/线粒体含量的变化。线粒体呼吸通量表达为pmolO₂/s*ml/CIV，而控制率和耦合效率没有si -单位[13]。

统计分析

数据以均数±均数标准误差(SEM)表示。使用GraphPad Prism Software(版本5.00,GraphPad Software, San Diego, CA, USA)进行组间差异的统计学比较，分析统计学意义，采用非配对t检验和Mann-Whitney U检验。比较数据时，差异p<0.05被认为是显著的。

结果

酶活性测定

图1显示了果糖处理和对照HepG2细胞中柠檬酸合成酶、乌头酶和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶的活性。暴露72小时后，果糖对柠檬酸合成酶的活性没有影响(图1A)。相比之下，与未处理的细胞相比，果糖显著降低乌头酶(图1B)和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(图1C)的活性(p<0.011)，分别降低35%和47%。

图1所示。对照和果糖处理的HepG2细胞中柠檬酸合成酶(A)、乌头酶(B)和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(C)活性的比较。数据以均值表示，竖线表示扫描电镜(每组n=6)。^＊与对照细胞比较P<0.011

线粒体呼吸

图2比较了果糖处理和对照HepG2细胞中使用PM底物组合时的漏气呼吸、OXPHOS和ETS能力。果糖不影响复合4-氧通量，这在所有实验中都是一致的，因此被用作呼吸数据的归一因子(数据未显示)。当使用PM时，果糖对氧通量没有显著影响，如图所示(图2A，未校正的氧通量)和图2B显示了不同呼吸状态下的平均氧通量(标准化为复合4-氧通量)。值得注意的是，当以GM为底物时，果糖显著降低了所有呼吸状态下的氧通量(p<0.028)(图3A，未校正的痕量和图3B，归一化为复4氧通量)。此外，PGM底物的组合对氧通量没有影响(图4A，未校正的示踪和图4B，归一化为复4-氧通量)。

图2。表示的啊₂使用PM的渗透性对照和果糖处理HepG2细胞(15 mM)的消耗轨迹和(A)提取数据(B)。滴定顺序为5 mM丙酮酸+2 mM苹果酸，2.5 mM ADP, 10µM细胞色素C, 2.5µM寡霉素，0.05µM CCCP, 0.05µM鱼藤酮，2 mM抗坏血酸+0.5 mM四甲基-对苯二胺(TMPD)。数据以均值表示，竖线表示扫描电镜(每组n=7)

图3。表示的啊₂使用GM的渗透对照和果糖处理HepG2细胞的消耗轨迹和(A)提取数据(B)。滴定顺序与图2相似，但漏底物为10 mM谷氨酸+2 mM苹果酸。数据以均值表示，竖线表示扫描电镜(每组n=7)。^＊与对照细胞比较P<0.028

图4。表示的啊₂使用PGM的渗透对照和果糖处理HepG2细胞的消耗轨迹和(A)提取数据(B)。除漏底物为5mm丙酮酸+ 10mm谷氨酸+ 2mm苹果酸外，滴定顺序与图2和图3相似。数据以均值表示，竖线表示扫描电镜(每组n=7)

讨论

本研究探讨了过量果糖对线粒体代谢途径和底物利用的影响。我们发现15mm果糖暴露72小时对乌头酶抑制35%，对GOT抑制47%，但对柠檬酸合酶无影响。此外，当以GM而不是PM作为底物时，果糖降低了所有线粒体呼吸状态的氧通量(泄漏、OXPHOS和ETS容量)。

先前的研究表明，果糖增加肝细胞中ROS的产生，降低线粒体乌头酶活性[5,7]。这些影响伴随着柠檬酸含量的积累和甘油三酯浓度的增加[5,7]。我们的研究进一步揭示了果糖对线粒体酶的影响，因为我们发现果糖抑制了乌头酶和GOT的活性。在我们的研究中观察到这种对GOT活性的影响，要么是因为我们延长了果糖暴露时间(72小时vs 48小时)，要么是因为细胞类型的不同(肝细胞vs L6)。与之前的工作[6]相反，我们的研究没有显示CS活动的变化。这可能是由于我们的肝细胞和它们的L6细胞[6]之间的ROS水平不同。这可能会对线粒体酶产生不同的影响，从而解释了在我们的研究中，乌头酶和GOT活性降低而不影响CS的原因。

然而，在我们的研究中，我们没有测量活性氧，因此，未来的实验需要调查果糖对肝细胞中各种类型的活性氧的影响，并将其与相关酶的不同作用联系起来。没有观察到果糖暴露对CS活性的任何影响的另一个可能的原因可能是由于研究中使用的体外模型的类型(L6 vs HepG2细胞)。L6肌管是小鼠细胞，而HepG2细胞是人肝癌细胞，具有抵抗多种刺激的倾向[15,16]，且碳水化合物代谢上调[17,18]。为此，另一项研究表明，在HepG2线粒体功能障碍的模型中，尽管存在病理生理刺激[19]，CS活性仍未改变。HepG2细胞的耐药性质可能意味着它们的CS酶对果糖的影响更有抵抗力，碳水化合物代谢的增加可以通过不受果糖抑制的CS活性的增加来强调。这些原因也许可以解释为什么我们的研究中果糖降低了乌头酶和GOT的活性，而没有降低CS的活性，尽管存在争议。

我们的研究进一步证明了果糖不仅抑制了乌头酶和GOT，还抑制了代谢途径和底物利用。由于果糖对乌头酶的抑制作用，我们分别用PM和GM作为底物组合进行实验。这是因为PM涉及乌头酶，而GM在其在TCA循环的代谢过程中绕过了这种酶。我们想要梳理出能够反映呼吸损伤的底物组合，最终我们使用了PGM的组合，因为这是访问complex-I功能的常用底物。果糖暴露对O₂当使用PM作为基质时，所有呼吸状态的通量(图2)。我们根据图5A解释了这些结果;果糖对乌头酶的抑制阻止了柠檬酸盐转化为2-氧戊二酸盐，从而导致线粒体基质中柠檬酸盐的积累。由于这种积累，柠檬酸盐就会从线粒体中逃逸到呼吸介质中，呼吸就会照常进行。排出的柠檬酸被用来制造脂肪酸，它的逸出降低了PM分解的效率。PGM底物组合也没有得到类似的结果(图4)₂通量，这意味着这些底物组合不适合评估线粒体酶的缺陷。

有趣的是，当使用GM底物组合时，果糖处理的细胞中复杂的1-连接呼吸状态减少。这些结果可以根据(图5B);果糖对GOT的抑制会阻止草酰乙酸转化为2-氧酰戊二酸，从而导致草酰乙酸的积累。增加草酰乙酸会抑制苹果酸脱氢酶，从而减少该反应产生的NADP。其他研究报道，果糖降低谷氨酸脱氢酶活性[20,21]，这可能导致谷氨酸较少转化为-酮戊二酸，并通过GM途径减少线粒体呼吸。因此，在我们的研究中，果糖很可能降低了谷氨酸脱氢酶和GOT活性，从而降低了GM的线粒体呼吸，但没有降低PM和PGM的线粒体呼吸。然而，由于我们在研究中没有测量谷氨酸脱氢酶活性，我们无法提供具体的分析，但认为我们观察到的GOT损伤是NADH/NAD整体降低的部分原因⁺从而降低与GM底物的复合- i连接呼吸。虽然我们没有测量NADH/NAD⁺之前的研究已经报道了果糖和降低NADH/NAD之间的联系⁺水平[20]。

图5。TCA循环显示使用PM (A)底物时乌头酶和使用GM (B)底物时谷氨酸草酰乙酸转氨酶的参与(由Gneiger[13]修饰)

结论

总之，本研究的新发现是，除了乌头酶外，过量的果糖还会抑制肝细胞内的GOT活性。此外，当我们使用底物组合GM时，果糖降低了线粒体泄漏呼吸、OXPHOS和ETS能力，而PM或PGM没有发现这些变化。因此，过量果糖的不良代谢影响不仅像之前报道的那样抑制乌头酶，而且还通过GOT酶损害线粒体呼吸和底物利用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

EO构思并设计了实验，为购买所有研究/实验费用(试剂/材料/分析工具)筹集了资金，并为数据分析/解释和手稿的撰写做出了贡献。HPM进行实验和数据分析，撰写草稿并协调完成稿件，并负责论文的提交。GM与其他作者一起参与了初稿和定稿的撰写，参与了数据解读和文稿中数据的整体呈现，并制定了布局策略。

致谢

作者感谢来自南非Stellenbosch CSIR的Maronel Steyn博士提供了研究中使用的HepG2细胞系。我们还感谢美国犹他州杨百翰大学的Peter A. Hecker博士提供了柠檬酸合酶和乌头酶活性测定的实验方案。南非国家研究基金会，资助机构在研究的设计，收集，分析和数据解释或撰写手稿中没有任何作用。

资金信息

这项研究由南非国家研究基金会资助。资助者对手稿的构思、数据收集和写作没有任何作用。

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