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摘要

背景:肝细胞癌是一种预后不良的恶性肿瘤，尽管采用多种治疗方法，但其复发率和死亡率都很高。在本研究中，我们评估了肝细胞癌、肝硬化和正常肝组织是否表达胃泌素释放肽受体，以及其在肿瘤组织和非肿瘤组织中的分布是否有显著差异。

方法:我们研究了61例原发性肝细胞癌石蜡包埋的肝细胞癌和肝硬化周围组织的切片，以及22例非肝硬化和非肿瘤性肝组织的切片。观察胃泌素释放肽受体表达与临床病理指标及临床转归的关系。

结果:在77%的肿瘤组织样本(47/61)的实质肿瘤细胞中显示胃泌素释放肽受体的免疫表达，其中57.4%的病例中有中至强表达。在周围的肝硬化肝脏中，也观察到它的免疫染色，15/31的病例(48.4%)显示高表达。在正常肝组织中也有表达，但多为弱至中度表达(分别为36.4和59.1)。胃泌素释放肽受体的表达与肿瘤分期有显著相关性(P=0.047)，但与其他临床病理参数无相关性。

结论:考虑到在包括正常肝组织在内的不同样本中发现的胃泌素释放肽受体表达异常，它可能不是胃泌素释放肽受体拮抗剂在肝细胞癌中潜在临床应用的一个有趣的靶点，但应该进行更多更大样本的研究。

关键字

肝细胞癌，胃泌素释放肽受体，肝硬化，正常肝组织

介绍

Bombesin/胃泌素释放肽(BN/GRP)被证明可以选择性地与细胞表面受体结合，在培养中作为自分泌的有丝分裂刺激多种类型恶性肿瘤的生长[1]。BN/GRP受体在多种肿瘤中表达，包括小肺癌、胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌[2,3]。

值得注意的是，BN/GRP受体拮抗剂，如RC-3095，在各种体内小鼠和人类肿瘤模型癌中显示出持久的肿瘤消退[4-6]。RC-3095与BN/GRP受体结合后，EGF和VEGF受体下调[7]。

在我们的实验室中，我们观察了宫颈癌患者的活检标本，观察到BN/GRP受体的高表达[8]。此外，在体内大鼠胶质瘤模型中，我们能够证明替莫唑胺和RC-3095联合使用具有显著的肿瘤应答[9]。最近，我们小组在人类胶质瘤样本中也观察到高GRPR含量[10]。

考虑到其新的作用机制，以及RC- 3095在动物研究中缺乏剂量限制性毒性，我们决定在晚期和难治性恶性肿瘤患者中进行该药物的I期试验。本课题组还开发了一种测定人血浆中RC- 3095的分析方法[11]。有趣的是，我们的数据证实了RC- 3095在25例癌症患者中的安全性，并显示了抗肿瘤作用的证据[12]。

目前的研究是我们在早期II期临床试验中确定适合这种实验性治疗干预的肿瘤类型的努力的一部分。为此，我们的方法包括对在我们机构接受治疗的不同类型癌症的癌症患者获得的大量石蜡活检样本进行评估。GRPR拮抗剂RC-3095的临床试验中，肿瘤/正常组织之间GRPR表达率较高的肿瘤类型是潜在的候选肿瘤。

HCC是全球第五大常见癌症，也是最常见的肝癌形式，在成人原发性恶性肿瘤中占80%，常见于慢性肝病和肝硬化[13]。HCC对现有的化疗药物具有高度耐药性，无论是单独使用还是联合使用[14]，诊断后的中位生存期约为6至20个月[15-17]。

目前关于BN/GRP受体在HCC中的表达的文献很少。一些实验研究表明，bombesin存在于大鼠肝细胞肿瘤中[18,19]。有研究报道，裸鼠移植的人肝癌中出现了BN/GRP受体，靶向这些受体的细胞毒肽类似物抑制了肿瘤的生长[20]。在本研究中，我们描述了从我院治疗的HCC患者中获得的一系列石蜡块中BN/GRP受体的表达。我们还研究了GRPR的表达是否可以作为临床预后的预测因子。

方法

回顾性检索我院2004年至2009年的档案资料，发现有87例患者被诊断为HCC，从而从我院病理科的病理记录中鉴定出79例组织样本。经病理检查，采用免疫组织化学技术对61例有代表性的石蜡块标本进行处理，纳入本研究。

在对癌组织进行病理复查时，另外选取30个肝硬化周围组织样本和22个非癌患者的非肿瘤性和非肝硬化组织样本作为对照。考虑到很大比例的病例是通过切口活检提供的，因此很难从同一患者中获得正常组织样本，这与研究可获得的大量组织无关。

所有61例HCC患者均有临床资料，在组织学诊断后对患者进行随访，生存病例的中位随访时间为7个月(范围:1-108个月;Sd±21.9)。

免疫组织化学(包含IHC)

对病理科持有的肝癌组织用福尔马林固定石蜡包埋标本进行免疫组化。将切片切成4毫米厚的切片，装在载玻片上。所用一抗为兔抗grpr多克隆抗体(#OPA1-15619, Affinity Bioreagents, USA)。在脱蜡、灭活内源性过氧化物酶活性并阻断与正常血清的交叉反应后，4μm切片与稀释的一抗(1:50)溶液在4°C下孵育过夜。随后应用生物素化抗体、链亲和素辣根过氧化物酶偶联物(LSAB, Dako)和四盐酸二氨基联苯胺/H进行一抗定位₂O₂(Kit DAB, DakoStaining)。

染色模式评估

病理学家对每种抗体的染色强度进行评分(0 =未染色;1±弱染色;2±中度染色;(3±强染色)所有标本的肿瘤区域及邻近组织。其中一个或多个肿瘤区域具有不同染色强度的标本被评分为最普遍的强度。

阴性癌组织中有局灶性摄取的标本得分为1+。出于数据展示的目的，如果GRPR的表达强度总和评分≤+1，则为低表达;如果评分在+2 ~ +3之间(中至强染色)，则为高表达。

统计分析

使用SPSS 14.0对数据进行评价。采用KruskalWallis方差分析和Mann-Whitney检验评估GRPR在病变和周围组织中的表达差异。采用χ分析GRPR表达与临床病理变量的相关性²测试。Kaplan-Meier生存曲线以肿瘤复发率(定义为肿瘤在明确治疗后任何部位首次出现)或死亡为终点计算。总生存曲线与无病生存曲线的差异采用log-rank检验。通过功率分析确定样本量是否充足。数据以均数±SE表示，除非另有说明，以P <0.05为显著性。

结果

样本特征如表1所示。癌症诊断时的平均年龄为59.0岁(SD=13.1;年龄范围:14-83岁)。在61例可获得临床信息的患者中，55.9%为II期或IV期疾病，67.2 (n=41)为肝硬化，61% (n=36/59)为HCV阳性。

表1。研究样本的临床描述(n = 61)

特征	n	％	的意思是
性
女	19	31.1
男性	42	68.9
诊断年龄			59(范围:14-83)
丙肝病毒
缺席	23	61
现在	36	39
肝硬化
缺席	20.	32.8
现在	41	67.2
肿瘤的阶段
我	15	25.4
2	11	28.6
3	26	44
4	7	11.9
血管侵犯
缺席	34	85
现在	6	15

在77%的肿瘤组织样本(47/61)m的实质肿瘤细胞中可见GRPR免疫表达，其中57.4%的病例中有中至强表达(图1)。在邻近的非癌性肝细胞组织中，也观察到GRPR免疫染色，15/31的病例中有高表达(48.4%)。

图1所示。肝细胞癌组织的抗体染色。(A) GRPR免疫表达在HCC强染色x 200阳性和(B)弱表达。

在非肝硬化和非恶性组织中，GRPR也有表达，但以弱至中度表达居多(分别为36.4%和59.1%)。Kruskal-Wallis方差分析未发现GRPR在恶性突和癌旁组织中的表达有显著差异。Mann-Whitney检验也不能证明GRPR在肿瘤组织、肝硬化组织或邻近正常组织中的表达有统计学差异(p=0.867)。图2显示了GRPR在恶性组织和正常组织中的总体表达情况。虽然总体方差分析没有显示组织间的差异，但个体比较显示得分3的表达明显更高⁺(强表达)和不表达，p<0.05(表2)。

图2。与周围肝硬化组织(n=31)和正常肝细胞组织(n=22)相比，HCC中GRPR的总表达量(n=61)， p=0.867。尽管肿瘤组织表达弥漫性免疫阳性，与肝硬化和正常组织相比，大多数组织表现出强烈的染色模式，但正常组织和肿瘤组织的一般表达没有差异(p=0.867)。

表2。正常肝脏和HCC组织中GRPR表达的染色强度

染色强度评分	病理特征		P值
	正常组织(%)n=22	恶性组织(%)n=61
得分0(无)	0	23	0.033
得分1+(弱)	36.4	19.7	0.191
2+(中等)	59.1	27.9	0.015
得分3+(强)	4.5	29.5	0.041

为了更好地了解GRPR表达在HCC中的意义，我们将表达水平与主要临床病理特征联系起来。GRPR表达与肿瘤分期有显著相关性(P=0.047)，而与其他临床病理参数(年龄、性别、病毒、肝硬化、肿瘤大小、AFP水平)无相关性(P>0.05)(表3)。

表3。肝癌不同临床病理特征与GRPR表达的相关性研究

临床病理的特点	所有患者(n=61)		P值
	GRPR低表达(n= 35)	GRPR高表达(n=26)
年龄
< 55 y	11	9
≥55 y	24	17	0.793
性别
男性	23	19
女	12	7	0.539
HbsAG
缺席	14	9
现在	20.	16	0.687
肝硬化
缺席	12	8
现在	23	18	0.772
肿瘤的阶段
我	5	10
2	5	6
Iii & iv	23	10
组织学分级
好到适度	3.	3.
可怜的	22	13	0.551
AFP水平
< 100ng /ml	17	13
≥100ng /ml	12	9	0.973
肿瘤大小
< 5厘米	14	15
≥5cm	20.	11	0.205

在随访观察期间，20例接受治疗目的手术(肝切除术或移植)的患者中有5例(25%)发生局部复发或远处转移，65%的患者确认死亡(33/51)。

为了评估GRPR表达的预后意义，我们使用Kaplan-Meier方法分析了总生存率(OS)和无病生存率(DFS)。在5年随访中，大约40.3%的低GRPR表达患者存活，而13.8%的高GRPR表达患者存活。估计GRPR高表达组的平均生存时间为21.6个月，而GRPR低表达组的平均生存时间为42.6个月(图3)。同样，在接受肝切除术或肝移植的患者的2年随访中，约79.5%的低GRPR表达患者无病。而GRPR高表达的43.8%无复发(图4)。logrank检验显示，GRPR高表达的患者总生存时间(p=0.174)和无病生存时间(p=0.188)较短，但两者之间无显著相关性。

图3。肝癌组织中GRPR高、低表达患者OS的Kaplan-Meier曲线。GRPR高表达的患者比低表达的患者有更短的生存时间(p = 0.174)。

图4。GRPR高表达和低表达患者术后无疾病证据的DFS。GRPR高表达患者比低表达患者复发早(p=0.188)。

讨论

本研究的重点是评估GRPR作为肝癌新分子疗法的潜在靶点。这是第一个使用免疫组织化学方法观察肝细胞癌患者组织样本中GRPR表达的研究。从患者的肝硬化和正常肝组织中获得的额外样本作为对照。

我们能够证明grpr在人肝细胞癌中大量表达，而肝硬化和正常组织的受体密度不那么明显，尽管它也表达。Bombesin在原发性大鼠肝癌中的表达是通过免疫组化方法确定的，在13%的结节和29%的肝细胞癌的神经分泌颗粒中发现了Bombesin的表达。正常的、肿瘤周围的肝组织，包括后两类中常见的非典型灶，在该标志物上呈阴性[18,19]。

上述作者认为，改变的肝细胞在神经内分泌方向上的去分化可能是肝癌发生的晚期事件，从而有助于肿瘤的形成。我们的研究提供了一个不同的视角，因为GRPR也在周围的肝硬化组织和正常肝脏中表达，尽管不像在肿瘤病变中那么明显。

在先前的一项研究中，针对黄体生成素释放激素、生长抑素或BLP受体的肽类似物及其组合治疗能强烈抑制裸鼠HCC的生长[20]。

GRP受体在原发性癌中的分布往往是不均匀的。BLP具有调节平滑肌收缩、激素释放和酶分泌等多种生理作用[5]，存在于健康人外周血中[21]，也存在于乳腺小叶和导管[22]、胃窦[23]、胰腺[24]等器官中。

在我们的研究中，我们描述了在非肿瘤性肝组织中普遍存在的GRPR表达，从中等到高密度值不等。正常组织中出现这种异质性的原因尚不清楚，需要进一步研究。考虑到含有非肿瘤组织的样本量往往较小，受体异质性的百分比可能不能代表整个肝实质。观察到的异质性可能与异质性干预模式有关，假设GRP在肝脏中发挥神经递质作用，就像它在先前评估的其他胃肠道器官中一样。

结合定义GRPR在HCC中的表达，我们试图确定其表达与患者临床预后的相关性。在所检查的标本中，GRPR的表达状态主要出现在中分化至低分化的肿瘤中，而高分化的肿瘤则缺乏GRPR的表达(p=0.55)。

此外，GRPR高表达与肝切除术后复发似乎存在相关性，因为57.1%的复发患者GRPR阳性，而随访中无疾病证据的患者为42.9%。虽然没有达到统计学意义，但可以推断GRPR的表达可能与疾病的侵袭性有关。在前列腺癌中GRPR表达的研究中也发现了这一发现[25]，GRP免疫阳性表达与复发(p=0.029)和肿瘤分期晚期(p=0.049)明显相关。

多项实验证据表明，GRP和其他BLP参与肿瘤进展、促进血管生成、局部侵袭和远处转移[3]。然而，一些研究表明，至少在体外，GRP/GRPR实际上可以改善患者的预后。它可能与增强肿瘤细胞与细胞外基质的附着能力有关[26,27]，减轻转移，促进自然杀伤(NK)细胞结合和细胞溶解[28]。

考虑到GRP可能具有的不同功能，许多研究评估了GRPR作为不同类型癌症预后因素的作用。对肺癌和结直肠癌的研究表明，该肽受体的异常表达与较差的临床预后无关，因为表达GRPR的患者比不表达GRPR的患者生存率更高[29,30]。

与其他对乳腺癌和前列腺癌患者样本进行的研究一样[25,31]，我们在HCC中的研究结果表明，GRPR表达对患者的总体生存有负面影响。GRPR的表达可能与患者生存或肿瘤复发相关，即使GRP表达不相关[32]。这可能是由于bombesin家族中的其他配体可以激活GRPR，也可能是由于至少在非恶性人类细胞系中异位表达时，构成活性的易感性[33]。

观察到GRPR可以作为几种肿瘤的自分泌生长因子，这鼓励了GRPR拮抗剂的合成，用于不同恶性肿瘤的实验性治疗。合成的拮抗剂以高亲和力结合受体，阻断信号通路，并显示出抗肿瘤活性在体外和在活的有机体内[34]。

GRPR在多种人类癌症中的高表达，以及其作为肿瘤生长因子在多种肿瘤模型中的作用，为GRPR拮抗剂作为实验性抗癌药物的临床评价提供了支持[3]。在各种肿瘤类型中，如前列腺癌和宫颈癌，以及最近的胶质瘤，可以证明GRPR在肿瘤组织和非肿瘤组织中的表达存在相当大的差异[8,10,35,36]。

我们的研究首次观察了从HCC患者获得的肿瘤样本以及肝硬化和正常肝脏组织活检中的GRPR表达。GRPR在非恶性组织和恶性组织中均有表达。然而，与正常肝组织相比，它在高级别HCC中具有较高的差异表达。我们还能够证明GRPR表达与患者预后不良相关。我们的研究样本量相对较小，限制了任何明确的结论，进一步研究HCC患者的GRPR表达是有必要的。

利益冲突

作者披露潜在的利益冲突。

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