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摘要

尿路感染（UTI）是一个全球性问题。大多数UTI研究集中于革兰氏阴性病原学。肠杆菌科是最常见的UTI感染，占所有报告病例的80%以上。UTI病例中的主要革兰氏阳性菌为葡萄球菌皂霉菌，粪肠球菌，链球菌agalactiae. 在多个国家报告了革兰氏阳性病原体，包括简单和复杂的UTI。革兰氏阳性细菌的抗生素治疗与革兰氏阴性UTI病原体的抗生素治疗完全不同。然而，革兰氏阳性和革兰氏阴性引起的UTI相关症状非常相似。如果没有正确的诊断，很有可能得到错误的诊断和随后的抗生素治疗。从孟加拉国的角度来看，针对病原学及其抗生素敏感性的研究非常有限。我们的目标是在这一填补空白的研究领域中寻找。本研究在UTI患者中检测到8.2%的革兰氏阳性菌。流行率显示与先前发表的报告相一致。发现男性和女性同样受到革兰氏阳性UTI病原体的感染。早期的大多数出版物显示，女性更容易感染革兰氏阴性UTI细菌。不太可能，我们的研究结果显示，与女性相比，男性同样容易感染革兰氏阳性菌。更多样本量的进一步研究可以保证初步结果。抗菌谱分析表明，阿米卡星和庆大霉素是对我们受试菌株最有效的抗生素。相比之下，在这项研究中发现呋喃妥因是最无效的药物。这项研究的发现可能有助于从这项循证研究中处方抗生素。

关键字

尿路病原体，UTI，耐药性，经验性治疗，孟加拉国

缩写

API:分析剖面指数;CLSI:临床和实验室标准协会;半胱氨酸乳糖电解质缺乏琼脂;MDR:多药耐药;MHA: Muller Hinton琼脂;PBS:磷酸盐缓冲盐水;UTI:尿路感染

介绍

尿路感染是最常见的感染性疾病之一。泌尿道感染的主要病原体是大肠杆菌和其他肠杆菌科。其余的比例与各种微生物有关，包括革兰氏阳性细菌葡萄球菌皂霉菌，粪肠球菌，链球菌无乳杆菌(B组链球菌，GBS)，以及其他不常分离的生物体[1-3]。最流行的革兰氏阳性尿路致病菌包括葡萄球菌皂霉菌和面状肠球菌[4 - 6]。在多个国家的非复杂和复杂UTI中都有革兰氏阳性尿路病原体的报道[7-9]。目前还没有在孟加拉国人群中进行这种专门的研究，以寻找革兰氏阳性UTI病因。如果没有正确的诊断，很有可能出现错误的和不适当的药物治疗和随后的副作用。革兰氏阳性菌多见于孕妇和老年[10]患者。此外，复杂的UTI经常发生在医院和/或机构环境中，这些人具有更大的革兰氏阳性和多微生物UTI风险[4,5]。它占抗生素消费的很大比例，具有很大的社会经济影响，可能有助于细菌耐药性[11,12]。临床医生经常面临选择适当的抗生素治疗UTIs[13]经验疗法的问题。在孟加拉国，滥用抗生素给临床UTI患者带来了许多不良后果，造成了长期的经济负担。本研究旨在评估革兰氏阳性尿路病原体对不同处方抗生素的敏感性。 Our study had rationalized the necessity of continued monitoring of urinary tract infected patients for a better understanding of their current epidemiology by gram-positive bacterial strains in the Bangladeshi population.

方法和材料

数据收集

通过结构化问卷记录患者的社会人口学信息、治疗史(患者是否接受过抗菌治疗)和任何相关临床信息(肾结石、妊娠、近期导管使用情况)。

研究设计和标本采集

2018年7月至2018年12月进行了一项横断面研究，从尿路感染患者中寻找革兰氏阳性细菌分离物。本研究的设计基于对萨瓦尔地区不同社区医院的UTI患者尿液样本的实验室调查。为了实施这项计划，在达卡萨瓦尔的Gonosastha医院和Enam医学院寻求医疗建议的可能的UTI患者被要求参与这项研究。该研究包括有临床证据的UTI患者，症状在医院门诊部出现的时间少于7天，以及住院时间少于48小时。

细菌分离鉴定

为了分离UTI病原体，在无菌玻璃管中收集清洁的中游尿液样本，并将其接种在半胱氨酸、乳糖和电解质缺乏(cle)琼脂(Lyophilchem，意大利)的差异培养基上。为避免感染共生细菌，患者事先了解了标准的中段采样清洁采集程序。为避免假阳性结果，采集后2 h内对尿液标本进行镀膜。使用cle琼脂可以支持大多数潜在的尿路病原体的生长，包括革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌，腐生葡萄球菌,肠球菌spp. 同时，接种甘露醇盐琼脂（MSA）以靶向革兰氏阳性UTI生长。尿液培养物在35ºC–37ºC的环境空气中培养过夜。进行定量尿液培养，菌落计数为10²或10^3.CFU/mL被认为是确定各患者可能的UTI感染[14]。菌落计数小于10²假定CFU/mL为潜在污染。通过革兰氏染色、常规生化程序和快速生化检测试剂盒（API 20E，BioMe'rieux，Durham，NC）鉴定纯化的菌落，该试剂盒由一组显色板、碳水化合物电池和酶底物组成。部分分离株的16S rRNA基因分型进一步验证了细菌鉴定。

抗菌药物敏感性评价

被隔离的人在体外采用标准Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验，并采用CLSI (Clinical amp;实验室标准协会-2010)建议。6个β -内酰胺、呋喃妥因和氟喹诺酮类抗生素盘置于细菌草坪上，37ºC孵育以确定敏感性模式。敏感细菌在抗生素盘周围划出清晰的区域，测量区域直径与标准进行比较。

β-内酰胺酶和喹诺酮耐药基因的检测

对表现出耐药表型的菌株进行PCR检测布拉_TEM和qnrS基因。共制备了6个细菌裂解物。PCR在以细菌裂解液为DNA模板(1µl)的PCR管中进行，最终体积为12µl，包含DNA 2x预混料(6µl)、每个引物5µl(1µl)和去离子水(4µl)。PCR是在热循环器中进行的，循环条件为布拉_TEM和qnrS分别为:94°C初始变性5 min, 94°C变性30 s, 50°C退火30 s (布拉_TEM)温度为55℃，持续30秒(qnrS)， 72°C延伸1min, 72°C延伸7min。用生成PCR产物的相同引物对预期大小的PCR产物进行纯化和测序。

统计分析

如上所述，已验证的孟加拉语版问卷用于数据收集。完成的数据收集表格由数据收集主管重新检查。随机选择10%的实验室分析由不同的研究人员进行两次，以确保实验室数据的真实性，并评估研究人员之间的偏见。输入验证数据，然后使用IBMSPSS统计数据编辑器（版本21）进行分析。双变量分析中排除了缺失数据。描述性统计报告为频率、百分比和平均值（如适用）以及标准偏差。受试细菌的抗菌药物敏感性采用3型分类评定量表进行评估，分为敏感（抗生素表示完全有效）、中间（表示部分有效）和耐药（表示无效）。对于分类数据之间的测试关联，使用Pearson的卡方检验，并在适当情况下应用Yate的连续性校正。因此，计算了获得抗生素耐药基因时抗生素的暴露量。计算相关系数以检验关联强度。在比较连续变量的平均值时，进行独立样本t检验。双尾p值小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

研究人群的人口统计资料

我们接触了在Gonosatha医学院就诊的患有泌尿道感染相关并发症的患者。我们纳入147例有严重临床症状的患者。其中男性36例(24.5%)，女性111例(75.5%)。因此，几乎三倍的UTI患者是女性，而不是他们的异性(图1)。芝加哥-平方检验显示女性性别与UTI事件数量显著相关(p = 0.04)。我们的研究案例的年龄分布从1岁以下到70岁以上。然而，最常见的UTI感染是在21-30岁年龄组。表1描述了按年龄划分的总体病例分布。12个中有5个葡萄球菌spp（42%）在21-30岁年龄组中确定。革兰氏阳性UTI感染的年龄分布无其他趋势。

图1。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在男性和女性中的分布。女性尿路感染显著高于男性，为革兰氏阴性菌所致。在革兰氏阳性尿路感染的情况下，男性和女性表现出同样的脆弱性

表1。UTI研究患者的年龄分布

在岁	UTI患者人数	频率%
0 - 0.5	1	0.7
1-10	5	3.4
11日至20日	23	15.6
21-30	49	33.3
31-40	21	14.3
每周	27	１８．４
51-60	10	6.8
61 - 70	9	6.1
71 - 80	2	1．4
全部的	147	100.

革兰氏阳性UTI病原体的分离鉴定

我们检查了147份临床症状患者的尿液样本。cle培养基对不同的UTI病原体产生不同颜色的菌落。革兰氏阳性金黄色葡萄球菌产生黄色菌落和葡萄球菌皂霉菌产生白色到黄色的菌落肠球菌spp在那里产生无色到黄色的菌落。革兰氏阴性细菌产生不同的颜色。因此，通过观察在cle上的菌落颜色来鉴定UTI细菌可能是假定的，但很难下结论。我们将这些可能的革兰氏阳性菌落从cle培养基传代到甘露醇盐琼脂(MSA)上，在37℃下培养过夜。MSA上的生长菌落呈白色至黄色和粉红色。MSA细菌经革兰氏染色，革兰氏阳性。初步鉴定出革兰氏阳性UTI菌葡萄球菌种可以进行分析剖面指数（API）分析和/或16sRNA DNA测序，以确定物种水平的病原学。我们检测到12种革兰氏阳性UTI病原体，占病原体总数的8.2%。

UTI革兰阳性菌的耐药性分析

盘扩散实验产生了Muller-Hinton（MH）琼脂上的细菌草坪的清晰区域，表明各种抗生素浸渍在那里的敏感性。相比之下，即使在存在抗生素盘存在下，耐药分离物也不允许透明区域。在我们的评估中观察到对测试抗生素敏感性的混合趋势。对硝基呋喃素（91.7％）发现最高抗性，其次是阿莫西林（83％），氧氟沙林（50％）。庆大霉素和阿米卡西蛋白都被发现非常有效的药物，其中仅发现8.3％的抗性（图2）。

图2。革兰氏阳性UTI细菌耐药性的流行情况。
AMC:阿莫西林;LOM: Lomefloxacin;OFX:氧氟沙星;CN:庆大霉素;正义与发展党:阿米卡星;F:呋喃妥英。阿米卡星和庆大霉素是对革兰氏阳性UTI细菌最有效的抗生素。硝基呋喃妥因在被检测的抗生素中效果最差。

革兰氏阳性尿路病原体中的抗生素耐药基因

我们用热煮沸法从所有12株革兰氏阳性菌株中制备了DNA样本。革兰氏阳性细菌的细胞壁通常比革兰氏阴性细菌坚硬得多，这可能会影响热煮沸法中DNA的释放。在目前的分析中，我们检测了含有抗生素耐药基因的β-内酰胺环bla -_TEM发现2株(2/6,33%)阳性。同样，我们检查了氟喹诺酮类耐药基因qnr-S检出3株阳性（3/6，50%）。

讨论

尿路感染是医疗实践中遇到的最常见的疾病之一，可导致显著的相关发病率，并从新生儿到老年人[5,15,16]。感染率可能因年龄、性别和某些易感因素而异。大多数报告的UTI感染是由革兰氏阴性菌引起的，主要是肠杆菌科细菌。还有强有力的证据表明革兰氏阳性UTI感染[8,17]。我们试图调查孟加拉国人群中革兰氏阳性UTI病原体的流行情况。基于严重程度标准和临床症状的尿路感染经验性治疗面临巨大挑战[18]。由于革兰氏阳性细菌的抗生素治疗与革兰氏阴性UTI病原体的抗生素治疗完全不同，因此通过经验方法获得错误治疗的可能性很高。因此，正确的诊断和特定的抗生素敏感性试验是制定任何治疗管理的必要条件。因为UTI是一个共同的社区-在孟加拉国获得性疾病因此，每年都有相当大比例的人口感染这种疾病。这项研究的目的是检查革兰氏阳性UTI病原体的抗菌素敏感性。我们检测到约8.2%的革位性UTI病因，金黄色葡萄球菌，腐生葡萄球菌,肠球菌spp. 其中附上了早期发布的报告[19]。

一般情况下，女性的UTI感染远高于男性[20]。不太可能，我们发现一半的革兰氏阳性感染报告是男性。初步结果显示，与整体情况相比，男性更容易感染革兰氏阳性病毒。我们的研究案例的年龄分布从1岁以下到70岁以上。然而，最常见的革兰氏阳性UTI感染是在21-30岁年龄组，其他[21]支持。

在孟加拉国，泌尿系统病原体的抗生素耐药性已成为一个公共卫生问题。在本研究中，用6种不同的抗生素盘a通过盘扩散试验测定革兰氏阳性UTI病原体的药敏谱。对硝基呋喃妥因的耐药率最高，对阿米卡星和庆大霉素的耐药率最低。不到10%的革兰氏阳性尿致病菌对这两种氨基糖苷类抗生素具有耐药性。这些结果支持氨基糖苷是治疗革兰氏阳性UTI病原体的首选药物。喹诺酮类抗生素中，第二代洛美沙星耐药率最高(75%)。我们的抗生素图显示呋喃妥因对革兰氏阳性UTI细菌不是一种非常有效的药物。旧的β -内酰胺类抗生素阿莫西林对革兰氏阳性UTI病原体的作用较弱。氟喹诺酮类抗生素、氧氟沙星、洛美沙星疗效中等。

采用聚合酶链反应(PCR)对分离株进行AMR基因检测bla -_TEM和qnrS. 约33%的分离物对病毒呈阳性反应bla -_TEM50%为阳性qnrS．检测到抗生素耐药基因，并与表型易感性模式一致。尽管我们怀着极大的诚意和献身精神开展了这项研究，但由于样本量不够大，无法超越限制。尽管有这样的局限性，这项研究的发现将有助于临床医生根据循证研究开出抗生素处方。临床医生在开经验性抗生素治疗前应注意具体的诊断，尤其是对于男性UTI。

道德声明

该研究得到了Jahangirnagar大学生物科学学院伦理和研究审查委员会的批准，并获得了UTI患者和医生的口头同意。

致谢

作者要感谢各自的患者和医生的合作。作者感谢贾汉吉尔纳加尔大学微生物学系综合实验室工作人员的贡献。

信息披露

这项工作得到了先进研究基金(GARE)、教育部和孟加拉国科学技术研究基金(the Ministry of Science and Technology Research fund, Bangladesh)的部分资助，资助对象是Dr. Md. Salequl Islam。

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