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摘要

背景:传统中医被认为在治疗癌症方面具有一定的优势，固本一流II (GY II)在中国已广泛应用于临床治疗癌症。

目的/目标:探讨GY II对喉鳞癌增殖、凋亡、侵袭和转移的影响。

材料和方法:通过MTT、Transwell检测和流式细胞术分别检测Hep-2和临床样本细胞的影响。进行芯片分析以确定哪些基因和途径参与喉鳞状细胞癌的发展。

结果:MTT试验结果显示，GY II通过阻滞G0/G1期细胞周期抑制细胞生长。添加GY II可显著抑制细胞迁移和侵袭。同时，GY II治疗也显著促进肿瘤细胞凋亡。基因芯片结果表明，基因与癌细胞发育有关。

结论及意义:GY II能抑制喉鳞癌细胞发育，促进细胞凋亡。我们的研究结果对于理解中药甲壳甙在肿瘤治疗中的作用机制和靶点具有重要意义

关键字

固本益流II (GY II)，喉鳞癌，中药。

简介

喉癌是头颈癌的第二大常见类型，喉癌的患病率高达72.7 / 10万人[1]。在临床治疗中，喉癌的主要治疗方法有手术、放疗和化疗。患者的营养不良，通常是由于手术创伤、化疗药物引起的免疫抑制、营养物质摄入不足、代谢紊乱以及疾病引起的高代谢状态，严重影响了癌症[2]的治疗和预后。相比之下，传统中药被认为在治疗癌症方面具有一定的优势，从中药中分离出一些活性化合物，被认为是有价值的抗癌药物[3]。例如，β-榄香烯，一种从姜黄在中国被用作抗癌药物[4,5]。根据中医理论，喉癌是由于脏腑亏虚，血瘀痰滞所致。事实上，癌症患者，特别是在晚期，一般都有气虚血滞的症状。治疗时，应加强气虚，保护身体，活血，消除致病因素，从而重新建立平衡。

近年来，对于有中国背景的患者，中草药(Chinese Herbal Medicine, CHM)越来越成为癌症患者中最受欢迎的一种，被广泛用于减少不良事件(AEs)，增强机体免疫力和生活质量，预防转移，并用于化疗和放疗的辅助治疗。此外，CHM被用作癌症的替代治疗，包括乳腺癌，肺癌和胰腺癌[8]。

古本一流二(GY二)由余仁存等中医大师创制，是促进益气活血解毒合成的重要成分，在中国被广泛应用。根据临床经验，积累的临床试验证明了GY II[9]的抗癌特性。

为了探讨GY II的抗肿瘤功能及其可能的机制，我们检测了含GY II的小鼠血清对Hep-2细胞和原发性人喉癌细胞功能的影响。

材料与方法

细胞培养

Hep-2细胞株购自武汉大学中国类型培养收藏中心(CCTCC)。从患者喉癌组织中分离出原发性喉癌细胞。知情同意书经北京同仁医院伦理委员会批准。所有细胞在添加10%胎牛血清(FBS, HyClone)的新鲜PRMI1640 (gibco)培养基中，在含5% CO的培养箱(Thermo)中培养₂在37℃。细胞融合90%后进行传代培养。

GY II水提液的制备

GY II为北京市中医院药材，从党参、茯苓、苍术、黄芪、川芎、鸡血藤等13种中草药中提取。根据本研究要求，7.88 Kg原料共生产出250 g透明药膏，含2.42 g生药(GY II)，提取产物保存于-80℃。

含GY ii血清的制备

雄性Wistar大鼠30只，体重180~190 g，购自Vital-Lee公司。在单独的笼子里给老鼠喂食标准的实验室食物和水。将30只大鼠随机分为两组，实验组20只采用GY II灌洗，对照组10只采用生理盐水灌洗。GY II给药剂量为每Kg体重20 g生药，每只大鼠每天给药2次，连续给药6天。最后一次治疗结束后处死大鼠，从腹主动脉采血。室温孵育2 h后，离心20 min, 3500 r/min, 56℃孵育30 min，取血清诱导失活。然后在使用前用细胞培养基稀释血清。所有动物实验均经学校动物使用管理委员会批准。

MTT试验

采用甲基噻唑特唑(MTT)法检测Hep-2细胞和原发性喉癌细胞的活力。将Hep-2细胞或原发性喉癌细胞以5000个/孔的密度接种到96孔板中，培养过夜至细胞贴壁，然后暴露于不同浓度含GY ii的血清(0%、25%、50%、75%和100%)24 h。使用MTT试剂盒(E606334，生工生物科技)检测各组细胞增殖情况。加入浓度为培养基10%的MTT溶液后，细胞培养4 h。除去溶液后，每孔加入200 ul DMSO振荡10 min，使甲马甲晶体完全溶解。每个孔在OD处的吸光度₅₄₀以计算细胞抑制率和IC₅₀．每组设置3个重复井，独立重复实验3次。

细胞侵袭试验

细胞侵袭实验在24孔跨孔室中进行，跨孔室含有直径10mm、孔8um的聚碳酸酯膜。简而言之，首先用不完全培养基稀释Matrigel (Corning, 354248)，然后在每个Transwell上腔中加入60µl稀释剂，5 × 10⁴将200 ul含GY ii血清中的细胞接种到上室，下室充满500 ul含10%胎牛血清的预热培养基。37℃孵育16h后，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，用棉签取出无创细胞，PBS冲洗上腔2次，用0.2%结晶紫/20%甲醇(wt/vol)溶液染色15 min，计数侵入基底膜的细胞数。显微镜下观察入侵细胞，10倍放大3个随机视野取平均。

细胞迁移试验

细胞迁移实验在24孔跨孔室(Corning, 3458)中进行，直径为10毫米，孔为8 um，按照制造商的说明进行。简单地说，将细胞重悬在200 ul含GY ii的血清中，并将其播种到上腔。同时，在下腔中加入500 ul含10%胎牛血清的培养基。37℃孵卵16 h后，用0.2%结晶紫/20%甲醇(wt/vol)溶液染色15 min，显微镜下计数，每个室随机选择3个视场。

流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期

细胞凋亡分析用5 × 10⁵细胞/孔)接种于6孔板，用含GY ii的血清处理24h，然后用不含EDTA的胰蛋白酶消化。细胞转移到微型离心管中，用PBS洗涤两次。按照厂家说明书，用500 ul结合缓冲液重新悬浮细胞，随后用5 ul Annexin V-FITC和5 ul PI溶液孵育5分钟。流式细胞术分析凋亡细胞的百分比。

细胞周期分析用PBS(按药物浓度)混合细胞悬液，在70%乙醇中4℃固定过夜。4℃孵育过夜后，离心收集固定化细胞，PBS悬浮，PI染色30min。流式细胞术定量各期细胞DNA含量。

数据统计与处理

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差(' x±s)表示t两组间比较采用-test，组间比较采用单因素或双因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

GY II抑制Hep-2和原发性喉癌细胞的生长

为了研究GY II对肿瘤细胞生长的影响，采用MTT法计算肿瘤细胞增殖率。从表1和图1中可以看出，含GY ii组对原发喉癌细胞和Hep-2细胞的增殖具有显著抑制作用，且抑制效果呈剂量依赖性(图1)。当添加含GY ii的血清浓度为75%时，对原发喉癌细胞的抑制率和IC50分别为54.4%和67.59 mg/ml(图1和表1)，同时，对原发喉癌细胞的抑制率为55.3%，IC为69.57 mg/ml₅₀当Hep-2细胞中添加含GY ii的血清浓度为75%时(图1和表1)。

图1所示。GY II对原发性喉癌细胞及Hep-2细胞增殖的影响采用MTT法测定细胞增殖情况。

表1。原发性喉癌细胞和Hep-2细胞的抑制率(%)(' x±s)。与对照组相比，^＊P< 0.05,^＃P< 0.001

药物浓度 （米米)	集成电路50(原发性喉癌细胞)	集成电路50(Hep-2细胞)
对照组(0%)	1	1
25％	15.5±5.4＊	12.3±0.9＊
50％	33.2±4.2＃	25.0±5.6＃
75％	54.4±3.8＃	55.3±1.1＃
100％	70.1±1.1＃	75.1±2.6＃
F	194.23	275.48
P	< 0.0001	< 0.001

GY II对喉癌细胞迁移和侵袭有抑制作用

侵袭和转移是肿瘤的重要特征。因此，采用Transwell迁移实验进一步分析GYII对喉癌细胞和Hep-2细胞侵袭转移的影响。血清中加入GYII后，Hep-2细胞和原发性喉癌细胞通过下腔滤膜的细胞数量均减少。进一步发现，结果以剂量依赖的方式显示(图2A和2C)。此外，还进行了侵袭试验，结果与迁移试验一致(图2B和2D)。上述结果表明，GYII的加入能够抑制细胞的迁移和侵袭。

图2。GY II可减弱细胞迁移和侵袭性。(A)在不同浓度含GY ii的血清中，用transwell法测定原发喉癌细胞和Hep-2细胞在指定时间内的迁移。(B)在不同浓度含GY ii的血清存在的情况下，用母体transwell法测定原发喉癌细胞和Hep-2细胞的侵袭情况。(C-D)显示了结果的相对细胞迁移和侵袭变化的统计图。所有数据均以3个独立实验的均值±标准差表示。单因素方差分析**p<0.01。

GY II促进Hep-2细胞凋亡和原发性喉癌细胞凋亡

为确定GYII对Hep-2细胞和原发性喉癌细胞凋亡的影响，用异硫氰酸膜联蛋白v荧光素(FITC)对凋亡细胞进行染色，在Hep-2细胞中，含GYII组的凋亡率明显高于对照组(图3和表2)。在原发性喉癌细胞中，结果一致(图4和表2)。结果表明，加入GYII可诱导人喉癌Hep-2细胞系和原发性喉癌细胞凋亡。

图3。GY II促进Hep-2细胞凋亡。流式细胞术检测Hep-2细胞凋亡情况。(A)对照组(0%);(B) 25%含gyii血清组;(C) 50%含gyii血清组;(D) 100%含gyii血清组。

图4。GY II促进原发性喉癌细胞凋亡。采用流式细胞术检测原发喉癌细胞的凋亡情况。(A)对照组(0%);(B) 25%含gyii血清组;(C) 50%含gyii血清组;(D) 100%含gyii血清组。

表2。原发性喉癌细胞和Hep-2细胞凋亡指数(' x±s)，与对照组比较^＊P< 0.05,^＃P< 0.001

药物浓度 （米米)	原发性喉癌细胞(%)	Hep-2细胞(%)
对照组(0%)	2.41±3.32	0.57±0.14
25％	6.31±0.41＃	10.43±0＊
50％	12.8±0.18＃	15.46±5.04＊
100％	9.83±7.64＃	25.98±0.92＊
F	34.05	577.21
p	0.03	< 0.001

GY II影响Hep-2细胞和原发性喉癌细胞周期

为进一步研究GY II抑制癌细胞增殖的机制，进一步采用流式细胞术检测细胞周期。有趣的是，添加含GY ii的血清对细胞周期有很大的影响。GY II治疗可显著抑制Hep-2和原发性喉癌细胞的G0/G1期(图5、6和表3)。我们的结果表明，GY II治疗可通过抑制G0/G1期肿瘤细胞来抑制细胞增殖。

图5。GY II治疗有助于Hep-2细胞的细胞阻滞。处理后24h, PI染色细胞，流式细胞仪检测细胞DNA含量。给出了G0/G1期、G2/M期和S期的百分比。(A)对照组(0%);(B) 25%含gyii血清组;(C) 50%含gyii血清组;(D) 100%含gyii血清组。

图6。GY II治疗对原发性喉癌细胞有抑制作用。处理后24h, PI染色细胞，流式细胞仪检测细胞DNA含量。给出了G0/G1期、G2/M期和S期的百分比。(A)对照组(0%);(B) 25%含gyii血清组;(C) 50%含gyii血清组;(D) 100%含gyii血清组。

表3。含GY II血清对Hep-2细胞周期及原发性喉癌细胞的影响(n = 3'x±s)。^＊:与对照组相比，p< 0.05

		G0 / G1	年代	G2 / M	π
原发性喉癌	0%(控制)	27.11±2.07	48.80±1.89	18.38±0.47	80.50%
	25％	36.10±1.70＊	46.37±3.45	14.98±1.71	84.63%
	50％	69.08±2.11＊	19.75±1.91＊	1.40±2.33＊	98.45%
	100％	71.35±2.14＊	13.33±1.02＊	1.85±1.27＊	97.86%
Hep-2细胞	0%(控制)	25.80±2.87	49.85±2.23	18.23±1.03	80.58%
	25％	36.60±2.30＊	46.10±3.23	14.99±1.34	84.66%
	50％	65.80±2.21＊	23.67±2.98＊	3.90±2.23＊	95.82%
	100％	71.66±3.72＊	12.98±2.11＊	1.40±3.12＊	98.37%

讨论

在中医理论中，恶性肿瘤被认为属于“积”的范畴，其发病为正气亏虚[10]。阴阳气失调，进一步发展为病理产物，如气滞血瘀，痰多，毒积，是潜伏的在活的有机体内．中医认为，恶性肿瘤的常用治疗方法，如化疗、放疗等，会损害健康倾向，也会提升气虚血瘀[11,12]。中医临床治疗常采用扶正培本法活血化瘀，最终减轻放化疗的副作用，延长患者的治疗周期[13]。GY II基于补气、活血、解毒的原理，是长期广泛应用于治疗癌症患者气虚、血瘀、毒积的重要方剂。

古本一柳中含有丰富的黄芪、当归、苍术、山药、茯苓和次直立。山药有通肾止泻的作用，当归、地黄、鸡血藤有养血养阴的作用。当归是最有用的补血成分，能补血不留瘀，同时活血。莪术、姜黄、紫堇可以缓解疼痛。值得注意的是，现代药理学研究证实，莪术、当归、黄芪可以提高人体免疫力，甚至可以杀死肿瘤细胞[16]。

虽然中医已经使用了数千年，但其潜在的机制还不为人所知。某些草药能够抑制癌细胞的迁移和侵袭在体外，而另一些则会引发癌细胞[17]的凋亡。在我们前期的研究中，化疗联合GYII具有良好的短期和长期疗效，包括通过降低化疗毒副作用提高化疗患者的生活质量，进而降低气虚血瘀证[18]的发生。我们目前的研究表明，GY II对原发性喉癌细胞和Hep-2细胞的迁移和侵袭有一定的抑制作用。事实上，GY II的抑制作用以剂量依赖的方式显示。当GY II浓度为75%时，高剂量GY II(75%)的抑制率为54.4% (IC₅₀=67.59 mg/ml)， 55.3% (IC₅₀=69.57 mg/ml)。

调控细胞凋亡和/或细胞周期已成为恶性肿瘤治疗的重要策略。大多数中草药已被证明具有促进细胞凋亡的作用[19,20]。结果表明，GYII具有诱导细胞凋亡的作用，且呈剂量依赖性。

总的来说，我们的研究表明GYII通过阻断细胞周期来抑制癌细胞增殖，细胞的侵袭和迁移能力也被GYII抑制。同时，GYII可显著诱导细胞凋亡。我们的研究结果对于理解中药甲壳甙在肿瘤治疗中的作用机制和靶点具有重要意义。

确认

国家自然科学基金(NO.81473499)资助。

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