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简介

骨折愈合描述了一个显著的过程，受伤的组织愈合而没有疤痕形成，因此通常导致骨的解剖和功能的完全再生[1]。据报道，在西方世界，长骨骨折的发生率为每年每10万人中300-400例[2,3]，在大多数情况下，无需手术干预，20周内即可愈合[4]。骨折渐进愈合的需求已经被确定并定义为所谓的菱形概念，包括以下参数:充足的细胞环境、充足的生长因子、骨基质和机械稳定性。缺乏这些参数之一的患者可能会在愈合过程中出现并发症，随后可能导致骨折[5]延迟愈合甚至不愈合。据报道，骨不连骨折的发生率为4-10%[4,6]。不愈合骨折与患者一般生活质量的降低有关，但也与长期住院和二次干预所带来的不便和费用有关。因此，开发积极影响骨愈合的新治疗概念非常有意义。

过去，不愈合骨折的再生刺激主要集中在使用自体移植物、异体移植物和异种骨。其中，自体移植被认为是黄金标准，因为它们具有成骨、导骨和成骨诱导作用[7-9]。然而，由于给定的体积数量和供体部位发病率，自体移植物的使用受到限制，供体部位发病率经常被观察到，通常伴有慢性疼痛[10]。自体移植物骨取出后发生的其他主要并发症包括供体部位[11]的血管损伤、深部感染或神经损伤。

在临床应用中，另一种替代自体移植物骨的再生方法是使用富血小板血浆(PRP)。该方法原则上利用血小板浓缩物的内在生长因子，以刺激和加速愈合反应[12]。然而，尽管PRP在在体外而且在活的有机体内在不同的情况下，它在骨再生方面的使用和传递尚未得到优化。这种制剂的一个显著缺点是，给药的最佳剂量以及浓缩液中活性物质的性质基本上是未知的。

针对骨折修复潜在分子机制的大量研究发现了一些特定的因素参与了愈合过程，如甲状旁腺激素(PTH)、缺氧诱导因子1a (HIF-1a)、调节Wnt信号通路的因素和骨形态发生蛋白(BMPs)[14]。使用像生长因子这样确定的化合物可以更精确地治疗骨折，而且在经济上具有优势，因为可以在适当的重组表达系统[15]中制备大量的这些因子。在这里，最有希望的生长因子候选是骨形态发生蛋白(bmp)，它最初是通过在异位位点植入时诱导骨形成的能力被识别的[16,17]。

bmp属于分泌生长因子TGF β超家族，在早期胚胎发育中发挥重要作用，但对成体组织和器官的维持和再生也至关重要[18-20]。bmp在所有脊椎动物和非脊椎动物中的存在，突出了这些因素对许多生物过程的重要性，最近有人建议将术语“骨形态发生蛋白”重命名为“身体形态发生蛋白”[21]。这一更名也将消除所有bmp都是真正成骨的误解。根据序列的同源性和受体的使用，确实能诱导骨形成的bmp可以分为三个亚组:BMP-2， -4;BMP-5， -6， -7;和BMP-9， -10亚群[22,23]。其他基于历史背景，也被称为bmp的蛋白质要么不是成骨的，要么它们的确切功能尚未完全阐明。例如，BMP-1(也称为哺乳动物tolloid蛋白(mTLD)或前胶原c蛋白酶(PCP))是一种金属蛋白酶，与其他TGF-超家族成员[24]没有结构上的相似性。BMP-3、BMP-13(也称为GDF-6)和BMP-14(也称为GDF-5)提供了进一步的例子，它们至少部分发挥BMP拮抗剂/抑制剂的作用，而不是单独发挥激动作用[25-27]。

TGF-b超家族成员的信号转导通常是通过与两种类型的丝氨酸/苏氨酸激酶受体链(I型和II型)结合启动的[28-30]。复合物形成后，构成活性的II型受体激活I型受体，随后导致所谓的典型SMAD信号通路的激活[31,32]。不考虑与其他连接信号级联的交叉作用(如MAP-Kinase信号通路)，只有两个不同的SMAD通路，即所谓的SMAD-2/-3或SMAD-1/-5/-8通路被建立。两种典型途径中哪一种最终被激活完全取决于信号活性配体-受体复合体中存在的单个I型受体(特定的信号受体)。因此，在这个超家族中，从多种配体开始，主要以激活两个不同的SMAD信号通路结束的强信号收敛性被建立起来，就成骨bmp而言，这似乎更加有限[33]。尽管观察到的特定成骨配体的优先受体使用存在差异，但在所有情况下，信号都通过SMAD-1/-5/-8通路发生。对于BMP-2和-4 -10，信号传递是由I型受体(BMPR-IA或IB)介导的，而BMP-5/-6/-7亚群利用ActR-I (Alk2)进行信号传递(参见Katagiri)et al。[34])。BMP-9与ALK1的高亲和力结合已有报道，但信号也可以通过ActR-I[35]发生。配体数量(迄今在哺乳动物中已发现超过20个BMP成员)和受体数量之间的明显差异提出了重要的问题，特别是这些蛋白质如何共享如此多不同的细胞功能，以及这些蛋白质如何在胚胎发生过程中充当形态形成因子。不同的时间和/或空间表达模式可能最好地解释了这一问题，但由于配体基因的双敲除通常比单个敲除所观察到的表型更严重，必须考虑至少部分补偿的存在。因此，细胞信号在多个细胞水平上被大量调节似乎是合理的(评论见Nickel)et al。[33])。细胞外所谓的调节蛋白(如Noggin、Chordin等)可以与配体结合，从而阻止其与受体的相互作用，如Noggin[36]或Follistatin[37]所示。因此，消融与Noggin相互作用的成骨因子也间接增加了特定配体[38]的成骨潜力。

除了这些调节剂外，BMP-2或-7的生物活性也受其与细胞外基质(ECM)成分(如肝素或硫酸肝素)结合能力的调节[39,40]。在活的有机体内， ECM似乎起着蓄水池的作用，它从三维的间质液中吸附配体，从而增加细胞表面的配体浓度。这个基质就像一个储藏室，允许配体在很长一段时间内缓慢释放。因此，调控生长因子与ECM的结合强度可能导致生物活性的改变，这确实已经被观察到在体外而且在活的有机体内[41]。

总之，上述不同的参数一致地定义了特定配体的成骨潜力，已经在几个临床前和临床试验中得到了解决。他们的目标通常是生产成骨配方，允许生长因子应用于缺陷部位。为此，他们使用同时控制因子释放的系统，以在修复缺陷所需的时间内达到足够高的局部浓度。

这篇综述阐明了交付BMP-2的不同系统的设计在活的有机体内应用程序。如上所述，对生长因子的生物活性和时空存在的控制显然对骨愈合至关重要，但似乎很难实现。

像BMP-2这样的生长因子主要通过两种不同的方式被带到受伤的部位。首先，为特定生长因子编码的DNA可以以合适的表达质粒的形式传递，也可以整合到病毒粒子中，或者遗传信息已经被引入受体细胞的基因组中，以便在作用部位表达特定生长因子。第二种方法是将基因产物，即重组表达的生长因子本身或模仿其特定生物活性的肽，异位地应用于损伤部位。有关概述，请参见图1。

图1。生长因子交付的主要原则

(一)编码所需生长因子的cDNA通过质粒或病毒载体引入细胞，在损伤部位翻译和分泌。(B)蛋白质以仓库的形式沉积在损伤部位，例如功能化支架的形式。

基因治疗提供了多种不同的应用，从癌症到各种传染病、心血管疾病或其他单基因疾病。由于基因疗法的通用潜力，截至2012年，共进行了超过1800项涉及基因疗法的临床试验。在骨再生方面，基因传递的潜力仍在研究中。首先，正如前面提到的，遗传信息可以通过载体传递到损伤部位，在那里细胞将接受它并开始蛋白质表达，或者通过传递已经转染了适当载体的细胞体外植入后，会在损伤部位表达蛋白质。

接下来，我们将对两种技术进行详细的讨论，比较两种技术在应用目前研究最好的成骨因子BMP-2进行骨再生的范围内的可行性和缺点，以及进一步改进两种技术的潜在途径。

使用BMP-2编码的cdna传递BMP-2

各种DNA传递方法的一般方面

选择要表达的生长因子是非常重要的，因为要传递的单基因，在这里是BMP-2，必须启动一个明显高度复杂的过程，最终导致骨缺损的完全恢复。对于更复杂的情况(如需要修复大面积缺损)，BMP-2结合其他生长因子家族的因子(如VEGF)[43]或BMP-2结合转录因子(如BMP-2和Runx2)的基因传递似乎是有利的[44]。BMP-2和骨组织特异性转录因子(如Runx2)的共表达可能提供更有效的骨再生，因为它调节其他驱动成骨因子的表达，如间充质干细胞[45]的成骨分化。然而，要传递的成骨基因并不是唯一要考虑的参数。此外，决定基因转染效率和停留时间的载体或基质的选择也同样重要。基因治疗的一个主要关注点是传递基因的稳定和可控的过表达。为了防止BMP-2的极端表达水平可能导致不必要的脱靶效应，具有诱导启动子的结构——如四环素敏感启动子(TetON)——可能是有利的[46]。

一般来说，用于基因治疗的载体可细分为两类:病毒载体和非病毒载体。在组织工程中使用病毒和非病毒载体已经在其他地方进行了综述[47-49]，但需要注意的是特定表达系统的优缺点。病毒载体——顾名思义——来源于病毒(如腺病毒;并且比非病毒载体具有更高的转染效率。然而，出于安全考虑，在诊所使用病毒载体仍在争论中。安全问题涉及特定病毒的免疫原性，这在不同病毒类型之间确实不同。腺病毒是最早用于基因传递的载体系统之一，由于表达了病毒壳蛋白[50]，它可能引起炎症或抗原反应，而腺相关病毒(AAV)被认为更安全，因为病毒蛋白在受体细胞中不表达(综述见Buning)等．[51])。另一方面，逆转录病毒或慢病毒可能诱导插入突变，这限制了它们在基因治疗方面的一般潜力。在这一阶段使用腺病毒或AAV进行骨再生似乎更可行，因为它带来的风险较小，并提供几周的短暂表达，与骨缺损愈合[47]的时间框架相匹配。

由于上述安全问题，一种有前途的替代方法依赖于脂质体的使用，它作为非病毒载体(质粒)的载体，与病毒载体相比，它可能达到足够的疗效，同时风险更低。除了安全性外，脂质体易于制备，其使用不受所使用DNA[52]大小的限制。病毒或非病毒载体均可直接应用于损伤部位或嵌入基质/支架内。

通过直接注入病毒或非病毒载体或应用dna功能化基质传递BMP-2编码基因

研究了不同的DNA传递方法在活的有机体内使用不同的动物模型。在啮齿类动物中，注射携带BMP-2基因的腺病毒导致成功的传递，由于BMP-2过表达，可以观察到缺损区域的成骨改善[53]。然而，在其他动物研究中，相同的腺病毒系统使[54]失败。在这些病例中，在植入后的第一周内观察到BMP-2的高水平表达，在随后的几周内明显下降。在缺损区域发现炎症细胞，显示对BMP-2和/或腺病毒载体的免疫反应，这可能解释了观察到的成骨阻滞[54]。该研究揭示了在进行临床试验之前进行大型动物研究的重要性，这也是FDA指南[55]所建议的。

为了提高应用载具的效能，它们可能会使用所谓的隐身(聚乙二醇化)脂质体来屏蔽受体的免疫系统。另一种提高载体转染效率的方法是使用细胞穿透肽(CPPs)[56]。此外，将载具定向运送到骨组织将导致转基因归巢到缺陷部位。高效基因传递的一个非常有趣的新想法是基于“设计”组蛋白作为靶向分子，从而旨在提高生长因子[57]的成骨能力。综上所述，更复杂的载体设计(例如隐形脂质体、CPPs、诱导系统或靶向分子)如果用于直接基因传递方法，则具有更大的潜力。但是，开发合适的给药系统并不容易，因为个体设计强烈依赖于应用程序本身，而且这种复杂设计的临床结果很难预测。改进基因传递系统的不同方法在其他地方有详细介绍，但需要注意的一个重要改进依赖于载体在生物材料内的封装，或用编码所需蛋白质[58]的DNA使材料表面功能化。这些基质被称为“基因激活”基质(GAMs)，它们的应用已经在水凝胶[59]或植入涂层[60]的形式中得到了广泛的测试。在一个例子中，BMP-2编码cDNA被嵌入海藻酸盐水凝胶中，海藻酸盐水凝胶是一种有效的转染剂，同时也是一种良好的支架材料[61]。这种基质的优点是材料的保质期长(冷冻干燥的可能性)，并能够作为缺陷填充[49]。

为了再生更复杂的组织结构，如骨-软骨界面，设计了两层支架，其中一层由“成软骨质粒”(TGF-β1)-功能化壳聚糖-明胶组成，另一层由“成骨质粒”(BMP-2)-功能化羟基磷灰石/壳聚糖-明胶组成[62]。间充质干细胞也被植入到每一层基因激活的基质中。对该系统的详细分析显示，使用的干细胞分化为软骨细胞或成骨细胞系取决于它们所处的层位。此外，在兔膝关节模型中使用该结构可以实现骨软骨缺损的成功再生。

用于骨再生的不同的天然或合成支架材料不在这篇综述文章的范围内。然而，由于支架也积极参与再生过程，每种生物材料的特性应该被考虑，比较和选择特定的应用。在不同的天然聚合物中，不溶性胶原基骨基质(ICBM)得到了广泛的应用，这是因为该骨有机基质主要由胶原蛋白(90%)组成[63]。这种基质的缺点是依赖于可能挑战宿主免疫系统的免疫原性分子残余。其他天然基质，如海藻酸盐或肽纳米纤维等原位胶凝系统是可注射的，因此可以很容易地填充缺陷区域。尽管基质对填补缺损区域和定位细胞和生长因子很重要，但它并不总是能产生更好的愈合过程，这很大程度上取决于所选择的支架。例如，在一项研究中，将未经处理或表达BMP-2的腺病毒转导细胞直接注射或嵌入褐藻酸盐中到裸鼠的骨缺损中，褐藻酸盐支架明显阻碍了BMP-2诱导的骨形成[64]。这项研究很好地证明，像细胞的选择或支架材料的选择这样的参数似乎只微调个体实验的结果，但这一复杂过程的初始触发是由应用的成骨生长因子提供的。

细胞传递基因体外转染BMP-2编码cdna

细胞介导基因治疗是细胞转染的另一种方法体外与所需生长因子的cDNA编码，随后被注射到损伤部位进行组织再生。细胞基因治疗与非细胞方法相比的缺点是成本和获得足够数量的合适的自体细胞材料的必要性。此外，这一过程比之前提到的脱细胞方法更难执行，由于需要扩展自体细胞，它更耗时。此外，这些工作必须按照良好生产规范(GMP)的指导方针进行。然而，也有值得注意的优点，因为交付的细胞本身可能积极参与再生过程。由于异体细胞来源相关的并发症，到目前为止，使用自体细胞是临床的金标准[65]。但是，这种技术也有一个缺点。为了获得这些细胞，需要进行额外的治疗或手术，通常伴随着移植部位的严重组织病变[66]。目前骨和软骨再生的实践和研究一般涉及骨髓或其他来源的间充质干细胞(MSCs)。Owen及其同事在20世纪80年代末已经证明，骨髓来源干细胞(BMDSCs)可以分化为包括骨在内的不同细胞类型[67]。 More recently, an alternative, powerful method was established to re-program non-stem cells to so-called "induced pluripotent stem cells" (IPSCs). Here, somatic cells (e.g. adipocytes which can be obtained easily by liposuction) are dedifferentiated to so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs) which subsequently are again differentiated to MSCs [68]. This new method is not yet in clinical use, but first clinical trials using IPSCs for macular degeneration have been initiated in Japan [69]. In one of the early clinical studies addressing the treatment of bone disorders, the transplantation of allogenic MSCs has been investigated in children with osteogenesis imperfecta. In this study, the allogenic BDMSCs were shown to improve the velocity of bone growth in five of the six patients [70] which led to several follow-ups in the field of bone regeneration. Recently, a clinical trial has investigated the effect of BMDSCs for craniofacial bone regeneration. Here, accelerated alveolar bone regeneration could be observed in a jawbone defect thereby eliminating the need for secondary bone grafting [71]. While usage of BDMSCs progresses in clinical trials aiming for bone regeneration, pre-clinical studies already involve MSC-based gene delivery. In one of these pre-clinical studies, bone marrow derived cells were co-transfected with cDNAs encoding for BMP-2 and vascular endothelial growth factor-165 (VEGF-165) in order to induce bone regeneration by means of BMP-2 mediated osteogenesis and VEGF mediated angiogenesis [72]. The cohort expressing both growth factors simultaneously was found to be better in terms of the formation and deposition of newly formed bone compared to the cohorts expressing only one of the two growth factors in rabbit orbital defect model [72]. The delivery of VEGF in combination with the osteogenic BMP-2 induces neo- vascularization of the newly formed bone tissue thus enabling superior supply of nutrients [73].

收集骨髓并不是一个简单的过程，因为它经常会引起术后疼痛。因此，其他干细胞来源，如脂肪组织，已被深入研究。在一项使用BMP-2转染的脂肪干细胞的研究中，它们的骨再生潜力被清楚地证明了。当将转染的干细胞嵌入藻酸盐凝胶中治疗大鼠时，可以观察到颅骨缺损模型的骨完全愈合[74]。因此，由于脂肪组织来源的干细胞易于收集，至少在这种应用中是首选的BMDSCs。

然而，大多数利用间充质干细胞进行骨再生的临床试验都不成功。Meijer等人[65]阐述了可能的原因，并确定了具有成骨能力的细胞数量、所使用支架的生物相容性、成骨因子的存在和血管供应等重要参数。此外，也有报道称，在大多数情况下，临床前试验的结果不能作为临床研究的布局，因为啮齿类动物和人的再生时间等差异会产生不同的实验结果[65]。

在MSC介导的基因传递中，一个关键问题是修饰细胞的定位，进而表达蛋白的定位。然而，当骨髓间充质干细胞被注射时，观察到注射细胞不易回到骨骼，98%的骨髓间充质干细胞通过肝脏和脾脏丢失[75]。为了克服这个问题，可以转染细胞，使其与骨归原蛋白(如CD49d)一起表达成骨生长因子(如BMP-2)[76]。

重组BMP-2的传递

通用特性

可运送到损伤部位的生长因子可将内源性干细胞招募到作用部位，使其暴露于配体后发生分化，从而诱导骨原位愈合。FDA批准的产品INFUSE®骨移植物含有BMP-2被吸附到胶原蛋白海绵上，已在临床上用于脊髓损伤。然而，在手术后观察到一些不良事件，如感染、严重肿胀、异位骨化或泌尿生殖系统问题[77-79]，这些事件被认为与给药生长因子的生理上量有关。这导致了一种假设，即这些不良事件可能通过减少交付的生长因子量到适当的临床相关剂量而消除。因此，开发一种能够以足够浓度持续释放蛋白质的输送系统是一项高度优先的挑战。图2描述了各种BMP-2交付策略的概述。这些策略将在下一节中更详细地讨论。

图2。重组表达的BMP-2或BMP-2变体的传递策略

漫画说明了不同的固定策略(一)BMP-2可以被吸附到固体表面或被包入水凝胶中(B)．更高的偶联特异性可通过亲和相互作用实现，例如使用生物素化BMP-2与strepavidin涂层基质偶联(C)．共价偶联可以实现非位点定向的结构被激活，例如由NHS酯(D)或者通过点击化学进行站点定向(E)．

非共价结合的策略

被包裹或吸附的BMP-2的传递:在活的有机体内，生长因子以非共价的方式与细胞表面的受体相互作用。信号分子，如BMP-2，在大多数情况下是可溶的(即没有膜结合)，因此可以扩散或主动运输到反应细胞。因此，许多研究实验室强调非共价结合策略，利用生长因子被吸附到或封装在各种合适的支架材料。

胶原蛋白等天然聚合物有几个优点。例如，它们具有内源性的酶切割位点，材料的降解时间遵循内源性的胶原组织重构时间。胶原蛋白海绵是最早和研究最好的用于BMP-2输送的材料。这种材料的一个缺点是依赖于所谓的早期爆发效应，通常在给药时观察到[80]。为了获得蛋白质的持续释放并减少这种最初的爆发释放现象，设计了genipin交联明胶微粒。与聚乳酸-乙醇酸(PLGA)微粒相比，明胶微粒显示出较低的爆发释放在体外．这些明胶微粒嵌入聚富马酸丙烯(PPF)的复合支架显示BMP-2的持续释放在活的有机体内皮下小鼠模型。该研究还表明，与单独使用支架相比，封装在支架内的微球可以更好地控制生长因子的释放[81]。为了生产完全合成的可生物降解材料，人们设计了胶原蛋白等天然聚合物的仿制品。在其中一项研究中，将基质金属蛋白酶(MMP)的裂解位点和RGD (Arg-Gly-Asp)基团引入聚乙二醇(PEG)聚合物中。在这里，BMP-2的释放被证明是由MMP-2介导的降解所诱导的在体外．用大鼠颅骨缺损模型研究了含5µg BMP-2的水凝胶对骨愈合的影响。mmp敏感的、装载BMP-2的水凝胶诱导新骨的形成，与装载BMP-2的胶原海绵(Helistat®)相似[82]。另一种更复杂的材料也在骨再生的背景下进行了研究，是一种MMP可切割的聚乙二醇水凝胶，其功能化的α2β1整合素特异性肽(GFOGER;单字母氨基酸编码，O =羟脯氨酸)。在一个小鼠临界尺寸缺损模型中，即使在缺乏BMP-2的情况下，这种材料也被证明对骨愈合有效，但在水凝胶中掺杂低剂量的BMP-2 (0.03 μg)可提高骨形成能力，并在8周后实现骨间隙的完全桥接[83]。含有RGD (arg - gry - asp)的混合纳米纤维网/藻酸盐递送系统与胶原海绵在BMP-2释放方面进行了比较[84]。与相同剂量(1.0 μg rhBMP-2)的胶原海绵相比，术后8周纳米纤维网/藻酸盐组的骨形成明显增加。为了获得具有明确和可重构结构的3D支架，Lee等．[85]通过固体自由形式制造(SFF)技术、计算机辅助设计(CAD)和计算机辅助制造(CAM)技术创建聚合物3D支架。装载BMP-2的微球被封装在这些微立体影射产生的支架中，7天后BMP-2开始线性释放。当在大鼠颅骨缺损模型中研究该结构的性能时，11周后观察到约75%的骨形成[85]。

对结果的详细描述，使用BMP-2和材料的不同组合，如前所述，导致了材料类型对骨再生方法的成功有重大影响的假设。通过比较加载相同剂量BMP-2的刷灰岩和PLGA控释系统，这些材料相关的影响变得明显。PLGA明显比刷灰岩更成骨，这是由于刷灰岩的吸收速率较慢[86]。因此，BMP-2不能以足够高的浓度释放，这可能表明至少需要最小的爆发释放。另一方面，坚硬的刷状石材料也可能阻碍入侵细胞的迁移，而入侵细胞对骨再生过程至关重要。

利用亲和作用传递BMP-2:蛋白质固定化的一种策略依赖于特定标记的蛋白质与适当功能化表面的亲和相互作用。与共价耦合不同，亲和相互作用较弱，其强度取决于特定的相互作用伙伴。在大多数情况下，相互作用会受到影响，例如通过改变pH值，溶液温度，或通过使用竞争配体。在活的有机体内，这些参数当然只能在有限的程度上改变。然而，这种方法有深刻的优势，依赖于交互的高度特异性、交互伙伴的主要统一方向、温和的耦合条件和各种商业上可用的亲和标记系统的广泛可用性。当生长因子的受控释放至关重要时，亲和性相互作用的可逆性可能是有利的，例如，如果配体必须从效应细胞内化才能获得完全的信号传导能力。

然而，在选择亲和-标签偶联策略时，也有一些需要考虑的限制，如费时费力的蛋白质工程、亲和配体的总体成本、改变蛋白质性质的可能性、固定化生长因子的不可预测的释放或标签定位的有限可能性。亲和力标签通常被放置在蛋白质的N端或c端，以减少其生物活性的变化。然而，将亲和标记定位在蛋白质序列的N端或c端在某些情况下可能不利于其运输和折叠。

常见的亲和固定化方法可以通过大量不同的分子融合标记来实现，例如基于电荷的小(聚精氨酸或聚组氨酸-)亲和标记，基于与抗体相互作用的表位标记(血红素(HA)， Myc, FLAG™，V5表位)，蛋白质融合标记(蛋白a，小泛素相关修饰物(SUMO)，谷胱甘肽)年代-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、某些蛋白质结构域(纤维素结合域、几丁质结合域)、生物素化(基于生物素亲和素的强亲和力)，以及许多其他结构域[87-90]。

如前所述，BMP固定化在物理吸附、封装和非特异性共价固定化方面得到了广泛的开发。然而，融合标签的添加主要是在bmp中用于蛋白质纯化(histag[91]，麦芽糖结合蛋白[92])，或用于检测和富集[93,94]，只有在少数情况下设计用于支架上更永久的固定。在成熟的BMP序列中插入任何类型的标签都强烈限制在n端，这是由于其c端埋埋的结构造成的。由于BMP蛋白的特定结构域包括一个亲结构域和一个成熟结构域，因此在真核异体表达系统中使用的任何标签的插入也被强烈限制在成熟部分的n端，这可能会对细胞内蛋白质的运输和成熟肽的正确加工造成阻碍。

通过his -tag固定BMP-2:在蛋白质科学中，研究得最好的亲和标记之一是6个组氨酸的菌株，显示出对二价金属离子的高度亲和。作者报告了一种通过引入his标签来固定BMP-2的应用等．[95]。BMP-2表达为融合蛋白，6个组氨酸(his6-tag)融合到人BMP-2成熟部分的n端。10µg的BMP-2蛋白被装载到脱矿骨基质(DBM)上，该去矿骨基质与五组氨酸抗体(MAbs-DBM)共价修饰。抗体被用来增强脱矿支架的负载能力。这些支架随后在C2C12细胞的成骨分化的细胞分析中进行测试在活的有机体内在雄性sd大鼠体内诱导异位骨形成。结果清楚地表明，his-tag固定化BMP-2能够诱导C2C12细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性，且以剂量依赖性的方式与其是否吸附到未修饰的脱矿化支架上或与五组氨酸抗体修饰的支架结合无关。然而，在相同的BMP-2剂量下，his-tag-BMP-2与MAbs-DBM结合可诱导更高的ALP信号。在活的有机体内植入2周后，his-tag-BMP-2/DBM和His-BMP-2/MAbs-DBM均诱导支架附近的异位骨形成，而未加载支架时则观察不到异位骨的形成。此外，his-tag-BMP-2/MAbs-DBM显示骨组织层较厚，钙化水平较高[95]。

通过双功能肽链固定BMP-2:Hamilton和同事最近建立了一种噬菌体展示程序，用于分离短的双功能胶原蛋白和BMP-2结合肽[96]。为此，他们使用了生物素化BMP-2(通过传统的n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)耦合技术连接)，然后将其固定在链霉亲和素涂层的96孔微板上。十个不同的噬菌体展示库，设计了一个中央特定的氨基酸核心基序，筛选与BMP-2结合的肽。识别的bmp -2结合肽通过一个灵活的连接子分别与胶原结合肽序列结合(在以前的工作中[97]生成)。这种双功能多肽与BMP-2混合提供注射胶原凝胶。研究了构建物(200 μ l胶原凝胶含2mg BMP-2)的成骨性能在活的有机体内．术后两周，在含有肽的组中，大约25%的种植体被新骨覆盖，而在没有双功能肽的对照组中没有观察到骨形成。进一步的分析表明，BMP-2结合肽与BMP-2的结合不受人体血浆的影响，因为血浆成分理论上可以相互作用，从而竞争肽与BMP-2的结合[96]。

肝素/壳聚糖作用固定化BMP-2:肝素，又称硫酸肝素，是一种高硫酸化的糖胺聚糖，表面带强负电荷。它主要储存在免疫系统的肥大细胞中，出现在真核细胞的细胞外基质中，与多种生长因子相互作用，并作为细胞基质的抗菌和补水因子[98]。由于其对BMP-2的强亲和力，近年来出现了一些使用肝素/肝素结合位点相互作用的BMP固定化方法。

在Kim的一篇论文中等．[99]采用经典的EDC/ nhs介导的耦合化学方法将钛牙种植体与肝素共价覆盖。这项工作的重点是开发一种具有抗菌性能和增强成骨功能的种植体。在室温下将其浸泡在BMP-2溶液(10或50 ng/mL)中24小时，BMP-2与肝素移植钛片结合。在体外实验显示，如小鼠巨噬细胞细胞系所分析的，炎症潜力降低，BMP-2从肝素-钛盘持续释放，并刺激成骨细胞功能，这进一步被BMP-2 (50 ng)固定钛表面生长的细胞中显著提高的碱性磷酸酶活性和钙含量所证实。Lee也采用了类似的方法使钛表面功能化et al。2012年报道[100]。

最近也发表了一种将BMP-2固定在聚己内酯纤维上的类似方法，研究了其诱导牙周韧带细胞成骨分化的潜力[101]。聚己内酯纤维表面用肝素-多巴胺功能化，再用BMP-2包被。该出版物报道了BMP-2持续释放超过28天，对牙周韧带细胞(PDLCs)没有明显的细胞毒性。与未修饰的PCL纤维相比，固定BMP-2的纤维显著诱导成骨分化，ALP活性、钙沉积和骨钙素和骨桥蛋白mRNA表达水平显著增加[101]。随后在活的有机体内研究表明，植入BMP-2/Hep - dopa /PCL/PLGA支架植入大鼠股骨缺损诱导的骨形成比BMP-2/Hep/PCL/PLGA-和PCL/PLGA支架诱导的骨形成更多[102]。同样，BMP-2也被固定在钙包覆壳聚糖支架上[103]。这些在活的有机体内研究对象是新西兰公兔。在双侧胫骨前侧钻取直径为4mm的缺损，将支架植入缺损部位。植入3周后分析支架的成骨潜力。结果表明，BMP-2在壳聚糖支架中保持活性，其释放动力学取决于磷酸钙盐的存在。含有磷酸钙盐(CPS)和BMP-2的壳聚糖支架比单独的支架具有更强的成骨诱导作用[103]。

生物素-链霉亲和素相互作用固定化BMP-2:生物素与链霉亲和素结合的复合物是已知的最强的非共价生物相互作用，具有解离常数(K_D10)^-13年M[104]。复杂的地层是坚固的，只有在恶劣的变性条件下才会破坏结合。因此生物素和链霉亲和素是一种非常方便的蛋白质固定化选择。在BMP-2固定化的背景下，生物素-链霉亲和素相互作用已被用于研究结合BMP-2的生物活性[105]，以及量化各种材料上的少量固定化BMP-2[106]。最近，利用生物素-链霉亲和素相互作用构建了一个连续的BMP-2表面梯度，用于细胞筛选研究[107]。然而，由于链霉亲和素的生产是成本密集型的，这类方法在过去主要用于蛋白质纯化或蛋白质定量等基础研究。

通过合成寡核苷酸固定BMP-2:在一个在体外Schliephake及其同事[108]进行的一项研究中，一组互补的DNA链被用于BMP-2的固定。本研究的目的是研究寡核苷酸是否适合固定和缓慢释放成骨生长因子，从而增强钛种植体的成骨潜力。采用阳极极化法将60聚非编码DNA寡核苷酸固定在钛表面。以二琥珀酰亚酸(DS)为连接分子，通过化学交联实现BMP-2与互补序列的结合。然后在室温下将功能化的BMP-2与钛锚定的寡核苷酸杂交(其耦合方案与生物素化的BMP-2与链霉亲和素相互作用的方案类似，见图2C)。在体外实验采用人骨髓基质细胞(hMSCs)进行。28天的释放研究表明BMP-2从钛表面持续释放。细胞增殖明显增加，成骨标志物骨桥蛋白和碱性磷酸酶表达上调。此外，bmp -2偶联支架显示明显更多的粘连点。对释放的BMP-2进行生物活性测试，结果显示其生物活性与未偶联的BMP-2相当，证明偶联过程不影响其生物活性。

由于许多亲和结合方法清楚地表明，BMP-2对特定支架的亲和增强了该结构的成骨潜力，一些研究小组已经专注于生长因子在各种材料上的共价结合。

使用共价耦合重组BMP-2的交付策略

大多数可注射的BMP载体不能在注射部位保留BMP。因此，大多数运营商在几天后会失去50%或更多的预加载BMP在活的有机体内．因此，与可溶性或缓释蛋白相比，共价固定化生长因子的交付将提供对细胞行为的可控和持续影响的优势。

用共价结合BMP-2官能化的种植体[109]证明了这种生长因子在种植体表面均匀分布的传递很容易，主要是周向骨诱导，小梁骨在4周内快速填充间隙，容易控制和避免异位骨形成。BMP-2和表皮生长因子(EGF)的共价固定化也在二氧化钛(TiO₂)纳米管表面通过N,N-羰基二咪唑(CDI)耦合或直接结合到生长因子的胺基或通过间隔物如11-羟基y-undecylphosphonic酸(PhoA)[110]。通过N,N-羰基二咪唑偶联蛋白是非位点定向的，可能至少部分导致偶联蛋白失活或变性。如果暴露于骨髓来源的间充质干细胞，BMP-2涂层不会像EGF那样促进细胞增殖、附着、粘附或增殖。这些发现表明，这些细胞活动不是由BMP-2触发的，或者细胞一般可能是BMP-2不敏感的。

由于自然生长因子只包含有限的反应基团子集(NH₂-， OH- COOH-和sh基团)存在于特定氨基酸的侧链中，化学偶联反应必须满足这些官能团的偶联需求。为了将光谱扩展到更广泛的潜在耦合化学物质，双功能连接器被设计用于生长因子与支架的耦合。最近开发了几种耦合方法来进一步控制生长因子的定位，包括使用含有半胱氨酸的标签、肽适体和纤维蛋白或胶原底物[111]。然而，这些方法需要蛋白质修饰，因此也会影响个体的结果细胞的反应。最近,Tabiszet al。[112]发表了一种BMP-2定点偶联支架的策略，该策略利用一种人工氨基酸，通过琥珀密码子抑制在细菌表达过程中引入该氨基酸[113]。与野生型BMP-2相比，构建的BMP-2变体具有相同的生物活性，可以位点定向耦合并在固体表面具有生物活性。这种技术提供了一种有趣的替代方法，因为用于偶联的连接子已经在蛋白表达时被引入到蛋白中，从而避免了二次修饰。该技术的另一个特点是，人工氨基酸的位置不局限于BMP-2的n端，因此，这种定位当然不会阻碍BMP-2与其同源受体的结合。

用位点定向和共价结合BMP-2修饰的工程表面通过优化的连接剂固定可能是维持生长因子生物活性的一种极好的替代方法。其他表面，例如黄金表面首先用异质双功能连接子修饰，然后暴露于BMP-2。为了跟踪目的，BMP-2被Na碘化¹²⁵我在结婚之前。活化表面用于C2C12细胞的细胞基分析[114]。同样，共价固定的BMP-2激活了bmp依赖的信号转导，从而导致预期的细胞反应，如抑制肌管形成和上调ALP表达。筛选了特异性的BMP-2结合肽，并将其作为工程异质双功能间隔的一部分，使其能够同时结合BMP-2和胶原蛋白[96]。在基于细胞的分析中，双功能连接剂增加了胶原基质中BMP-2的滞留，并导致成骨活性的增加。但是，目前尚不清楚BMP-2是否可以在与肽结合的同时结合其同源细胞受体，或者是否必须先释放BMP-2才能与这些受体相互作用。然而,在活的有机体内结果表明，连接子的存在显著增加了成骨活性[96]。

使用共价耦合BMP-2衍生肽的交付策略

使用模拟BMP-2特异性生物活性的多肽可能是昂贵的重组生长因子的一种有吸引力的替代方法[115]。合成BMP-2多肽可以避免使用可能发生降解和变性的天然蛋白质在活的有机体内．但是，由于bmp的二聚性，I型表位(手腕表位)和II型受体(关节表位)的结合表位存在两次。因此，为了实现完全的受体激活，原生配体必须与两个I型和ii型受体链结合，形成异六聚体配体-受体组合[116]。因此，用一个简单的肽来模仿这些能力似乎是不可行的。然而，与位于关节ep内的氨基酸相对应的合成肽的偶联经EDC/NHS化学作用的海藻酸凝胶在大鼠小腿肌肉中诱导了长达7周的异位钙化，而bmp -2掺杂的胶原凝胶在3周后就出现了最大的异位钙化，但形成的钙化小骨在5周后消失[117]。肽功能化藻酸盐支架还能诱导小鼠成骨细胞ALP活性(ALP)。此外，可以证明，一旦暴露于这种结构，SMAD信号就会启动，导致骨桥蛋白表达上调和小鼠间充质干细胞中矿物沉积的增加[118]。金属种植体附近的骨生长经常受到损害，导致骨质量下降和种植体失败。BMP-2肽共价结合玻璃，钛，钴铬(CoCr)和金底物已被证明可以增强和加速成骨细胞和其他细胞系的生长和分化。化学固定合成多肽到钛植入物进行评估在体外而且在活的有机体内osteointegration能力[119]。一种模拟腕关节表位和关节表位的肽是通过所谓的F-moc化学合成的，并通过含有半胱氨酸的间隔剂进行额外的n端修饰，从而简化了在植入物表面的化学结合。与对照盘相比，该肽共价偶联于钛盘，在MC3T3-E1细胞中显示更高的增殖和成骨标志物如ALP的表达上调。重要的是，引入到犬下颌骨的肽修饰的种植材料显示出骨生长的显著增加，从而证实了钛表面的生化修饰确实可以提高骨愈合的速度，相比于未处理的钛表面。CoCr合金植入物也有潜在有用的发现，其中BMP模拟肽(通过n端半胱氨酸氨基酸耦合)的存在表明，与对照组相比，孵育2周后ALP活性增加了两倍，孵育3周后钙含量增加了四倍[120]。模拟BMP-2关节表位的多肽也被固定在阳极氧化的纳米管钛上[121]。结果显示，与非功能化阳极氧化钛相比，成骨细胞粘附增强。这在体外研究增加了阳极氧化材料，保持纳米表面纹理的材料，增加了促进成骨的材料列表。

在最近的文献中发现的一些报告表明，纳米尺度地形的表面结构可以影响胚胎和间充质干细胞的增殖和分化。因此，纳米尺度的地形与生长因子结合可能促进干细胞的增殖或谱系分化。为了发展这些基材，这些因素必须直接固定在基材表面。一项研究表明，通过化学气相沉积(iCVD)和BMP-2肽共价固定化，纳米模数聚氨酯丙烯酸酯(PUA)衬底均匀涂覆聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)(pGMA)，可比物理吸附等更有效地固定化BMP-2肽。茜素红S染色、免疫染色和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)结果显示，在这种纳米图案表面培养的hMSCs增强了成骨分化[122]。然而，尽管研究证明了肽修饰表面对细胞行为的影响在体外在美国，关于它们对成骨和破骨细胞发生(重塑)的影响的证据相对较少。在活的有机体内．

基因和蛋白质/肽传递策略的比较

在一个在体外研究中，直接比较了BMP-2的基因传递和重组BMP-2蛋白的异位传递。有趣的是，两种方法都显示了相似的矿化结果。在成骨蛋白表达水平上观察到差异，转染BMP-2的细胞表达的骨桥蛋白比在细胞培养基中用等量的重组BMP-2蛋白处理的细胞更多[123]。基因和蛋白质的传递各有优缺点。基因的传递提供了较长时间的蛋白质供应，并可通过诱导表达载体控制表达周期。但是在诊所使用病毒载体的安全问题仍然存在。在考虑非病毒载体的情况下，长片段DNA转染难度较大，转染效率可能不足以实现骨的完全修复。在基因传递中，蛋白质是由细胞连续产生的，因此稳定性不是问题。然而，在开发蛋白质输送系统时，应始终考虑并保证蛋白质在至少几周内的稳定性。此外，要获得成功的临床结果，必须正确分配所需的剂量和释放动力学。

正如所建议的，这两个系统都需要进一步的改进，改进后的系统需要更多的特性描述和临床试验所需的坚实的临床前数据。

未来的视角

迄今为止，组织工程在骨再生领域的复杂性激发了众多研究者，随着更多研究的开展，复杂性也随之增加[124]。为了创新产品的产生，需要更先进的生物材料工程策略，可能包括细胞和生长因子。创新材料的可控和可复制的生产技术必须在产品本身起成骨作用上加以阐述。理想情况下，这些材料与细胞一起应用，要么积极参与骨缺损的再生和/或分泌信号分子，作为整个细胞-细胞通信级联的初始触发，最终从周围组织招募骨祖细胞。这一启动信号极有可能是由BMP-2提供的，因为在异位部位(如肌肉组织)应用该蛋白(或另一种成骨BMP)会导致小骨的形成，其机制与自然骨生长和修复中发生的机制相似。理想情况下，所提供的信号在骨缺损需要愈合的时间内是足够活跃的。原则上，这可以通过基因操纵细胞来实现，但由于免疫方面的考虑，需要自体细胞。或者，也可以通过应用重组bmp来提供信号。在过去的几十年里，已经进行了大量的试验，所有这些试验都面临着同样的问题，依赖于这类生长因子的一般(生物)化学特性。由于这些蛋白质可以诱导异位骨的形成，必须确保反应性组织(如肌肉组织)即使在骨折情况下也不会暴露于这些蛋白质。 For that purpose, the osteogenic BMPs are evolutionary "designed" as badly soluble proteins which additionally bind strongly to components of the extracellular matrix. Local administration of huge amounts must consequently result in a kind of precipitate rendering the majority of the protein biologically inactive. This inactive clot is typically eliminated by several environmental mechanisms. The design of 2^nd因此，代bmp应侧重于通常在较长时间内提供较高生物活性的蛋白质变体。这可以通过合理的结构设计增强配体与细胞表面受体的个别结合亲和力来实现。由于结合亲和性增强，所需要的bmp的应用剂量可以显著减少，但蛋白质修饰承担诱导免疫反应的风险。另一种保持生长因子信号能力的生物活性和局部存在的方法可能是将生长因子与合适的支架结构紧密结合。正如本文所讨论的，这可能实现寻址材料侧(与支架优化BMP结合)和/或寻址生长因子侧(通过共价结合的BMP，理想情况下直接耦合到基质侧)，从而实现所选基质的健壮和可复制装饰。如果再生过程的最初步骤涉及由生长因子梯度募集的干细胞的迁移，那么该因子的偶联应该-至少部分-通过可被基质金属蛋白酶裂解的连接子发生。

总之，通过解决到目前为止已经确定的关键问题，创建基于细胞或非细胞的BMP-2输送系统似乎是可行的，在不久的将来，可以在复杂创伤和其他需要医疗干预的病例中常规使用。

确认

这项工作得到了欧盟第七框架计划FP7/2007-2013(资助协议No. 607051 (BIO-INSPIRE))和维尔茨堡大学(资助计划开放获取出版)的支持。

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