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摘要

简介:结肠炎相关结直肠癌(CAC)的免疫与散发性结直肠癌(CAC)的免疫有本质区别。本研究的目的是评估这种差异是否能增强免疫检查点抑制剂抗pd1对CAC的疗效。

方法:在小鼠体内，偶氮甲烷(AOM)和右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导CAC发生肿瘤。DSS结束两周后，小鼠分别用抗pd1抗体(n=9)或同型抗体(n=9)治疗。比较临床和组织学结肠炎的严重程度、肿瘤计数、CD8+ t淋巴细胞和中性粒细胞浸润情况。

结果:与对照组相比，抗pd1抗体没有使结肠炎加重(p=0.424)和标准化病理评分(p=1.000)的差异。在宏观检查中，治疗小鼠肿瘤的中位数为24.0个[21.5/31.0]，对照组为17.0个[4.0/23.5](p=0.037)。治疗组小鼠整个结肠上皮内肿瘤组织的百分比(33.1%[27.2/39.0])明显高于对照组(15.3% [8.1/25.0])(p=0.003)。两组肿瘤内CD8+ t淋巴细胞密度相似(p=0.546)。相比之下，治疗小鼠非肿瘤结肠上皮细胞的CD8+ t淋巴细胞密度明显高于对照组(p=0.019)。关于先天免疫，与对照组相比，治疗小鼠的肿瘤内中性粒细胞密度相似(p=0.864)，非肿瘤结肠上皮中中性粒细胞密度增加(p=0.012)。

结论:出乎意料的是，检查点抑制剂抗pd1治疗CAC可刺激肿瘤增殖而不加剧结肠炎。

关键字

抗pd1，结肠炎相关结直肠癌，免疫治疗，炎症性肠病

简介

免疫治疗(抗pd1、抗pdl1或抗ctla4)的不良反应主要是自身免疫并发症，如致命的[1]结肠炎。预防原则引起了人们对慢性肠道炎症患者可能因这些治疗而引起炎症发作的担忧。因此，这些患者一直被排除在癌症免疫治疗试验之外，当然包括结肠直肠癌[2]。然而，通过免疫疗法治疗的炎症性肠病(IBD)患者的文献资料在大多数病例中并未描述消化道炎症的严重发作[3-5]。

在散发性结直肠癌中，对免疫治疗的反应主要取决于失配修复缺陷[2]的存在。但结肠炎相关结直肠癌(CAC)与散发性结直肠癌在许多方面不同，特别是在免疫[6]方面。尽管只有10%的CAC出现错配修复缺陷[7]，我们假设IBD过程中发生的慢性免疫激活可能对免疫治疗CAC的疗效产生积极影响。本研究的目的是探讨抗pd1免疫疗法对CAC小鼠模型的治疗作用。

材料与方法

CAC模型动物

CAC模型为AOM (azoxy甲烷)/DSS(右旋糖酐硫酸钠)小鼠模型[8]。5周龄的雄性BALB/c野生型小鼠(Charles River)单次腹腔注射AOM (13.4M;Sigma-Aldrich)，剂量为每公斤体重10毫克。注射AOM一周后，小鼠分别接受1.5% DSS(分子量= 36,000-50,000;MP生物制药公司)在饮用水中进行DSS的第一个和第二个循环之间间隔一周的循环，没有DSS的饮用水的第二个和第三个循环之间间隔两周的循环。从第三个周期的DSS结束后，给小鼠饮用不含DSS的水，直到处死。这些老鼠每周至少称重一次。

免疫疗法

老鼠被分成几组Anti-PD1-treated组和a控制组。的Anti-PD1-treated各组大鼠腹腔注射抗pd1抗体5次(InVivoMAb抗小鼠PD-1，克隆:RMP1-14, BioXCell, 100µg/针)，每次间隔3.5 d。第一次注射在第三周期DSS结束后两周进行。的控制对照组腹腔注射IgG2a同型对照(InVivoMAb大鼠、抗三硝基酚、BioXCell)，按与抗pd1注射相同的时间顺序。两组小鼠均于末次注射后1.5周颈椎脱位处死。

本实验获得了当地动物伦理审查委员会(n°APAFIS#14004-2018030914101923v5)的批准。

病理

献祭后立即取出整个结肠并纵向切开，以量化肉眼检查整个结肠粘膜可见肿瘤的数量。结肠在10%福尔马林中固定24小时，然后用石蜡包埋，制成包含完整器官的“瑞士卷”。石蜡包埋切片(5µm)脱蜡后用H&E试剂染色。计算每只小鼠的完整结肠的h&e染色玻片上可见肿瘤的数量。结肠炎的组织学严重程度由先前描述为[9]的标准化评分进行评估。这些病理分析是由一个训练有素的胃肠病理学家(NG)盲目进行的。

此外，这些切片被数字化(Scanscope AT turbo, Leica)，并用Aperio ImageScope软件进行分析，并计算每只小鼠整个结肠上皮内肿瘤组织的百分比。这种量化方法是一个自动化的独立于观察者的过程。

免疫组织化学

每个结肠制备2片载玻片，分别用靶向CD8 (ab203035, Abcam, 1/200稀释)和髓过氧化物酶(MPO) (ab9535, Abcam, 1/50稀释)的抗体进行免疫组化分析，以识别CD8+ t淋巴细胞和中性粒细胞。对整个组织的免疫染色切片进行数字化处理(徕卡AT涡轮扫描仪)。使用Aperio ImageScope软件，对每张幻灯片的肿瘤进行限定，以勾画出整个肿瘤结肠组织(第1层)。此外，对除肿瘤区域外的所有结肠上皮也进行限定，以勾画出非肿瘤结肠组织(第2层)。使用Aperio膜算法对这些表面进行量化，并对固定特异性抗体的细胞数量进行量化。由此计算肿瘤结肠组织(第1层)和非肿瘤结肠组织(第2层)中CD8+ t淋巴细胞和中性粒细胞的平均结肠密度。

统计数据

定量数据用中位数和四分位差(IQR)表示，用Wilcoxon-Mann-Whitney检验比较值。两个定量变量之间的相关性是使用散点图和斯皮尔曼秩相关系数的组合分析进行的。p值< 0.05被认为有统计学意义。所有分析均使用Prism 8 GraphPad进行。

结果

Anti-PD1-treated而且控制两组均为10只。在DSS周期中，每组1只小鼠死亡。在18只接受腹腔内注射的小鼠中(Anti-PD1-treatedn = 9,控制N =9)，没有人在预定的献祭日期前死亡。两组结肠炎的严重程度通过临床体重减轻和组织学标准化评分进行评估，结果相似(表1)。

表1。结肠炎、肿瘤与免疫浸润之间Anti-PD1-treated而且控制组

	Anti-PD1-treated集团 N = 9	对照组 N = 9	假定值
结肠炎
第一个DSS周期:权重变化(g)	+ 1.0 (+ 0.2 / + 2.1)1	+ 1.3 (+ 1.2 / + 2.2)	0.448
第二个决策支持系统周期:重量变化损失(g)	(0.2 + -0.5 / + 0.6)	(0.6 + 0.0 / + 1.0)	0.286
第三个决策支持系统周期:权重变化(g)	-1.1 (-2.2 / + 0.3)	-0.1 (-0.7 / + 0.9)	0.424
治疗期2:重量变化(g)	-0.6 (3.7 / + 1.1)	0 (-0.7 / + 0.9)	0.424
结肠炎的组织学评分	2.0/10 (2.0/2.5)	2.0/10 (2.0/2.0)	1.000
肿瘤
肉眼检查:肿瘤数目	24.0 (21.5/31.0)	17.0 (4.0/23.5)	0.037
纵向切片:肿瘤数目	8.0 (7.5/9.5)	6.0 (4.0 - -7.5)	0.015
肿瘤组织在整个结肠上皮中的百分比(%)	33.1 (27.2/39.0)	15.3 (8.1 - -25.0)	0.003
免疫渗滤
CD8+ t淋巴细胞-8的密度(细胞/mm2)
在肿瘤结肠中	3.3 (2.3/5.0)	3.8 (2.3/6.0)	0.546
在非肿瘤结肠中	3.8 (2.5/9.4)	1.3 (0.8/3.1)	0.019
中性粒细胞密度(MPO+)(细胞/mm2)
在肿瘤结肠中	17.9 (5.0/35.0)	12.1 (6.8/25.4)	0.864
在非肿瘤结肠中	26.1 (3.6/69.5)	2.5 (1.6/4.7)	0.012

¹中位数[IQR25 / IQR75]

²治疗期间:从第一次注射(抗pd1或IgG2a对照)到牺牲

肿瘤评估

肿瘤组织在结肠上皮内的百分比明显增加Anti-PD1-treated对照组(33.1% [27.2/39.0])控制组(15.3% [8.1/25.0])，(p=0.003)。同样，各结肠在宏观检查后发现的肿瘤数量和在一个纵向载玻片的显微镜检查中统计的肿瘤数量明显多于对照组Anti-PD1-treated(p=0.037, p=0.015)(图1)。数据如表1所示。

图1所示。通过宏观检查(1-A)、显微镜检查结肠纵向载片(1-B)和计算机量化肿瘤组织在整个结肠上皮内的百分比(1-C)。

图2。散点图探讨非肿瘤结肠上皮中CD8+细胞密度与MPO+细胞密度的相关性。

免疫组织化学

与对照组相比，检查点抑制剂治疗对肿瘤内CD8+ t淋巴细胞密度的影响不大控制组(p = 0.546)。与此相反，在非肿瘤结肠上皮中CD8+ t淋巴细胞密度显著增高Anti-PD1-treated组(p = 0.019)。关于先天免疫，与对照组相比，治疗小鼠的肿瘤内中性粒细胞密度相似(p=0.864)，非肿瘤结肠上皮中中性粒细胞密度增加(p=0.012)(表1)。

两组小鼠成池后，中性粒细胞密度与非肿瘤结肠上皮CD8+ t淋巴细胞密度呈正相关(Spearman系数r = +0.607, p=0.019)。在散点图(图2)上，抗pd1处理的小鼠很容易区分控制小鼠非肿瘤结肠上皮细胞CD8+ t淋巴细胞和中性粒细胞密度增加。

图2。散点图探讨非肿瘤结肠上皮中CD8+细胞密度与MPO+细胞密度的相关性。

讨论

本研究结果显示，在小鼠CAC模型中，抗pd1治疗并没有带来任何肿瘤消退。相反，这种免疫疗法甚至增强了肿瘤的增殖，而没有引发结肠炎的临床或组织学发作。

在Yassin等人之前的研究中．与DSS同时给药小鼠抗pd1会导致[10]结肠炎的加重。然而，在我们的研究中，抗pd1治疗后，临床或组织学结肠炎并没有加重，但在非肿瘤结肠上皮中，中性粒细胞和CD8+ t淋巴细胞的免疫浸润明显增加。这两种方法的主要区别之一是治疗的注射时间。虽然这些作者倾向于在DSS治疗的急性期注射抗pd1，但我们在去除DSS两周后对结肠炎的慢性期小鼠进行了治疗。这些在小鼠中的数据与在人类中报道的病例一致，即在大多数病例中，当在疾病的潜伏期给予这种治疗时，似乎不会使结肠炎恶化[3-5]。此外，Yassin等人[10]并没有检测到我们所强调的肿瘤增殖加重，这种差异可能与抗pd1注射方案的差异有关。

有几种假说可以解释我们观察到的抗pd1肿瘤没有退化的现象。首先，CAC的特征是低肿瘤浸润淋巴细胞，即使存在错配修复缺陷[11]，这与散发性结直肠癌[2]对免疫治疗无应答相关。在其他方面，已经从健康供体中鉴定出不同的细菌菌株，能够诱导肠道中的CD8+ T细胞激活，并增强免疫检查点抑制剂[12]的治疗效果。因此，治疗无效可能与IBD患者[13]存在肠道失调有关。

在我们的系列研究中，检查点抑制剂治疗的一个意想不到的效果是肿瘤增殖恶化，而抗pd1的注射并没有改变CD8+ t淋巴细胞对肿瘤的浸润。Yost等人研究了CD8+ t淋巴细胞在抗pd1[14]激活后招募新的t淋巴细胞的能力。在我们的CAC模型中，这个过程不发生在肿瘤中，但发生在非肿瘤结肠上皮中。此外，中性粒细胞被招募到非肿瘤结肠上皮，中性粒细胞的招募与CD8+ t淋巴细胞的招募成比例相关。这种对静止疾病的先天免疫和适应性免疫的激活可能解释了在慢性炎症期间这些肿瘤增殖的刺激。

总之，这项小鼠临床前研究强调了检查点抑制剂导致CAC肿瘤增殖的意想不到的效果。虽然没有观察到临床或组织学结肠炎的恶化，但抑制PD1-PDL1相互作用似乎促进了CAC的发展。

利益冲突:所有作者声明与本研究没有潜在的利益冲突。

资金

这项工作得到了法国卫生研究所INSERM、“avenir基金会”AP-RM-17-008、“François Aupetit协会(AFA)”、“Université de Paris”、“Ligue contre le cancer”和avenir投资项目ANR-11-IDEX-0005-02、巴黎Sorbonne Cité、卓越实验室INFLAMEX to EOD的资助。

作者的贡献

研究构思与设计:M. Collard, N. Guedj, L. Maggiori, P. Hammel, X. Treton, Y. Panis, E. Ogier-Denis。数据采集:M. Collard, J. tourneurl - marsille, M. Albuquerque。数据分析与解释:M. Collard, N. Guedj, E. Ogier-Denis。文章起草人:M. Collard, N. Guedj, J. tourneurl - marsille。对重要知识内容进行批判性修改:M.阿尔伯克基，L.马乔里，P.哈梅尔，X.特雷顿，Y.帕尼斯，E.奥吉尔-丹尼斯。最终批准:所有作者。

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