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摘要

客观的在本研究中，我们旨在评价精子DNA染色质的完整性苯胺蓝染色(AB)及其可能对精子参数的影响。我们稳定了精子计数和活力的预测AB截断值，并分析了在卵母细胞捐献(OD)计划中少精子患者染色质去密度的影响。

方法:回顾性纳入2016年至2018年期间发生OD周期的172对夫妇。对总精液和游泳后的样本进行AB检验。采用多元线性回归法检验AB检验与男性特征(BMI、年龄)和精液参数(形态、浓度、活力)的相关性。ROC分析进一步证实了这一相关性，显示了一个预测的AB测试截止值。最后，为了验证精子质量是否影响临床结果，我们比较了AB测试阳性的两个亚组，分别为少精子患者(n=12)和正常精子患者(n=58)。

结果: 172名男性的总样本和游泳样本中AB染色的分布相似(p= 0216)。AB试验与精子活力呈负相关(p=0,008)和浓度(p=0,001)，但不包含形态学(p= 0, 6)。ROC分析显示，精子染色质成熟度对正常精液浓度(AUC=0.675, IC 95%: 0.708 - 0.622, p<0.05)和正常活力(AUC=0.665, IC 95%: 0.667 - 0.649, p<0.05)的AB检验截断值为19%。亚组间比较显示妊娠阳性试验显著减少(p=0,03)和活产儿(LBR)(p=0,040)， AB检验≥19%。

结论:本研究发现精子染色质完整性在精子参数和OD计划的临床结果中可能起关键作用。为了证实我们的发现，需要增加样本量。

关键字

苯胺蓝，捐卵，精子参数

简介

在医学辅助生殖(MAR)中，女性因素一直被认为是实现怀孕的关键因素。高龄产妇(AMA)对体外受精(IVF)结果有负面影响:它通过增加染色体非整倍体影响卵母细胞，进而影响胚胎质量[1-3]。然而，在过去的几年里，一些研究将注意力集中在父亲因素在辅助生殖技术(ART)结果中的作用[4-6]。众所周知，大约50%的不孕夫妇中，男性因素会导致不孕[7]，据估计，大约15%的精液参数正常的男性在受孕[8]方面存在问题。父系因素与受精率降低和胚胎发育有关[9-11]。在许多情况下，常规精液分析(精子图)是体外受精过程中选择精子的唯一标准，这一条件受到了广泛的批评。此外，还有一些作者得出结论，精液参数正常的男性可能仍然无法生育[12-14]。最近，科学关注的焦点集中在其他质量标记，如精子的结构和功能完整性及其在ART成功中的决定性作用[15-17]。实际上，评估精子质量不仅可以考虑精液标准参数，还可以考虑精子DNA损伤、精子膜通透性和精子染色质凝结[18,19]。精子核的完整性是由正确的染色质包装来保证的，这通常是通过用鱼精蛋白(鱼精蛋白)取代组蛋白来形成紧密的dna -蛋白质结构[20]来保证的。 It has been evaluated that incorrect protamination is associated with advanced paternal age (APA) and can alter both sperm fertilization capacity and early embryo development [21]. Therefore, sperm chromatin condensation may have an important role in influencing sperm competence to achieve pregnancy in ART [22-25]. In the present study, we evaluate sperm DNA chromatin integrity with Aniline blue (AB) staining test that distinguish unstained mature spermatozoa from stained immature ones [26-27]. The aim of the study is to define a predictive AB cut-off value for semen parameters and to analyze the impact of chromatin decondensation in oligoastenozoospermic patients in OD cycles.

材料与方法

研究人群

我们回顾性分析了2016年1月至2018年12月在欧洲医院生育中心登记的172例OD型男性患者。入选标准:不育史1年或以上，精子参数正常或亚可育，8-9个玻璃化卵母细胞，暖后存活率为>50%。只包括新鲜的射精精液。无精子症、性腺功能减退、睾丸扭转、合并泌尿生殖道感染、既往化疗或放疗和药物治疗的患者被排除在分析之外。所有患者均无1/2型人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒、梅毒密螺旋体和梅毒。我们的人群在精液样本和游泳处理后进行了AB检验。在本研究中检测到的172例AB测试截止阳性患者中，70例被分为两个亚组:少弱精和正常精。该研究是根据《赫尔辛基宣言》所表达的原则进行的，经欧洲医院内部伦理委员会批准，获得了夫妇的知情同意。

精液评估和准备

在授精当天，所有受试者进行精液分析:禁欲3-5天后，用手淫的方式将新鲜精液收集在无菌罐中。精液分析遵循世卫组织2010年[28]标准，5°百分位:精液量1.5 (1,4-1,7)ml;每次射精的精子总数为39(33-46)万个，精子浓度为每毫升15(12-16)万个;进行性运动能力，32% (31-34);总(进行性，非进行性)运动能力，40% (38-42);形态4,0%(3,0 - 4,0)。游泳准备精液。根据世卫组织2010指南[28]对游泳前后的精子计数、活力和形态(Diff Quick染色，MBT医学生物技术公司，意大利)进行分析。

苯胺蓝染色

原生精液和游泳精液均进行了AB检验。将一叠样品涂在载玻片上，晾干。之后，风干的涂片在37%的甲醛磷酸盐缓冲盐水溶液(pH 7.2)中固定15分钟，然后用5% (w/v) AB水溶液(Sigma®，德国)在4%的乙酸(pH 3.5)中染色2分钟。用无菌水冲洗载玻片，观察精子进行AB染色:如果深蓝色染料占据整个精子头区域或顶体后区域，则为阳性;相反，如果精子头是无色的，则被认为是阴性的。

化验及临床程序

捐献的卵母细胞按照Kitazato程序进行加热(Kitazato解冻试剂盒;BioPharma, Shizouka，日本)。升温1小时半后，存活的卵母细胞进行ICSI，只分析正确受精的(2PN)卵母细胞。使用常规评分系统[30]评估胚胎形态，使用Gardner和Schoolcraft[31]描述的评分系统评估囊胚形态。胚胎培养在37°C, 5% O2和6% CO2的培养箱中进行，顺序培养基(奎因优势培养基;圣人,美国)。在OD周期中，我们实验室的政策是在第3天转移1或2个胚胎或在第5天转移1个囊胚。胚胎移植在经腹超声引导下使用华莱士导管(Wallace;史密斯医疗，都柏林，爱尔兰)[32]。多余的胚胎被玻璃化(Kitazato玻璃化试剂盒; BioPharma, Shizouka, Japan). The β-HCG value was assessed 14 days after embryo transfer. Clinical pregnancy was confirmed by ultrasound visualization of the gestational sac/s with fetal heartbeat.

统计分析

男性年龄、体重指数(BMI)和精液参数以中位数(min-max)表示。采用Kolmogorov-Smirnov检验检验AB检验的正态分布，采用非参数Mann-Whitney U检验评价结果是否有差异。采用多元线性回归检验AB检验、BMI、男性年龄、形态与精液浓度或活力的相关性。采用ROC曲线和曲线下面积(AUC)，考虑置信区间(CI 95%)，验证标准精液参数的预测AB检验截止点。我们用Wilcoxon检验评估亚组间临床结果的差异。使用社会科学统计软件包(SPSS 23.0，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。p值≤。05被认为是显著的。

结果

表1描述了172个OD周期的男性群体的年龄、BMI、精液参数和游泳前后的AB值。男性中位(最小-最大)年龄为44 76岁(36.00-53.92岁);男性中位(min-max) BMI为2870(27.00-34.00)。AB检验值在整个样本和上游样本中的分布相似(p= 0,262)(图1)。由表2可知，AB检验值与精子浓度呈负相关(p=0,001)和动力(p= 0008);而与形态学没有任何关联(p= 0, 6)。男性特征，例如男性年龄(p=0,3)和BMI (p=0,07)与精子核完整性无关。随后，对172例男性患者进行一次单精子参数的分组:148例精子浓度正常，24例异常;154例总运动能力正常，18例异常;75例形态正常，97例形态异常。

图1。游泳前后AB检测结果比较。AB检验结果以中位数表示，采用非参数Mann-Whitney U检验(p= 0,262)。p值<0,05被认为是显著的

表1。值表示为中位数(R);R，范围(最小-最大);BMI，身体质量指数;AB，苯胺蓝

表2。BMI，身体质量指数;AB，苯胺蓝。P-value<0,05被认为是显著的

从ROC曲线可以看出，精子染色质成熟度与形态无关(AUC=0.550, IC 95%: 0.103-0.87, p=0.245)(图2a)，但AB检验对正常精液浓度(AUC=0.675, IC 95%: 0.708- 0.622, p<0.05, cut off=19%)和正常活力(AUC=0.665, IC 95%: 0.667 - 0.649, p<0.05, cut off=19%)具有显著的预测价值(图2b)(图2c)。为了验证精子质量是否影响OD周期的临床结果，我们比较了AB试验阳性(≥19%)的两个亚组，分为少精子和正常精子。如表3所示，实现怀孕能力差异有统计学意义(ß-hCG阳性检测)(p=0,03)和活产率(p=0,04)在精子参数正常但AB截止值高的组(≥19%)。

图2。ROC曲线。2)ab检验预测精液的接收工作特征曲线形态: auc = 0,550，p=0,245, IC 95%: 0,103-0,87，分界点= 29%。2 b)ab -检验预测的ROC曲线浓度: AUC = 0675,p<0,05, IC 95%: 0.708 - 0.622截止点=19%。2 c)ab -检验预测的ROC曲线能动性: AUC = 0665,p< 0,05 IC 95%: 0.667 - 0.649截止点=19%。P-value<0,05被认为是显著的

表3。按AB检验截止阳性值(AB检验≥19%)进行人群划分。精少弱精亚组和正常弱精亚组的精液总活力和浓度

讨论

我们的研究以OD周期为模型，以更好地理解男性影响，并将注意力集中在精液参数、年龄、BMI和通过AB测试评估的染色质凝结。对于精子的制备，使用了游泳，因为据报道，最终精子的染色质凝结比密度梯度[34]更好。我们没有发现整个精液样本和游泳后的AB值有显著差异。在整个精液样本中，由于精子发生是一个连续的过程，根据禁欲的天数，可能会有不同数量的不成熟、成熟和衰老的精子，染色质损害凝结[33-35]。我们可以合理地假设，以精子活力为基础的选择技术“游泳上升”(swim-up)并不能消除染色质凝集[36]受损导致DNA受损的精子。AB值与男性参数的多元回归分析显示，AB值与男性年龄、BMI和精子形态无相关性;然而，染色质成熟度与浓度和活力呈负相关(p<0.001)，这与文献[27,37-39]中的其他研究一致。就形态学而言，Pourmasumi等人(2019)显示该参数与AB染色[27]之间呈负相关，而我们的文章则没有发现相关性。Hammadeh et al.(2001)[40]认为染色质凝结和精子形态之间没有相关性，即使作者宣称精子染色质评估构成了男性生育能力的一个有价值的参数，完全独立于传统的精液参数。

我们通过ROC曲线对多元回归分析结果进行了校正，发现精子数量和活力的AB测试截断值为19%，但对精子形态没有影响。尽管一些作者发现了与临床结果相关的AB测试截止值[26,41]，但我们发现了与精液参数相关的截止值，这可能是男性不育症的潜在指标。AB试验≥19%与浓度和活力异常(低弱精子症)的男性更相关，这可能是由于不同的精子源性染色质重塑导致更大的组蛋白滞留(>15%)或染色质不凝结[38,42,43]。为了评估AB测试截断19%对临床结果的影响，我们考虑了OD周期，其中女性因素(产妇年龄)对结果[44]有很大影响。在我们的研究中，少弱精患者与正常弱精患者相比，精子染色质解致密化不影响ICSI结果(卵母细胞受精和胚胎发育率)，但检测到妊娠阳性试验和LBR减少。我们的数据与其他研究结果一致，没有显示正确的染色质包装与ICSI结果[26]之间的联系。然而，已知DNA包装的改变可以与精液参数和ICSI结果[21]相关。染色质凝集对受精和胚胎发育率的影响是有争议的，但从我们的结果来看，染色质凝集对ART临床结果的影响似乎更大[22,46-52]。我们的数据显示了AB测试阳性与受损精子参数之间的相关性:精子染色质填充不良使DNA更容易受到活性氧(ROS)攻击[16]。氧化应激对线粒体功能和DNA都有负面影响:这会导致精子活力下降和DNA完整性受损[53]。总之，精子染色质凝结是确保DNA正确包装的必要条件。

结论

本研究评估了OD周期中染色质完整性对男性伴侣精子参数的影响。我们发现精子浓度和活力的预测阳性截断值为19%，但对形态没有影响。我们的初步数据集中在精子参数的选择方法相关的染色质完整的老年男性接受OD周期的精子。正确的DNA包装对于ART技术的成功是至关重要的，我们的研究结果可以建议更多地关注运动能力下降的患者(天精子症)。

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