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简介

乳腺癌是世界上最主要的女性癌症类型，2018年有200万例。表皮生长因子受体(EGFR)与癌细胞转化有关，是一种有吸引力的治疗策略靶点。其在乳腺癌早期的过表达与恶性缓解和总生存率降低有关。

目前，对于乳腺癌患者，测量EGFR需要复杂的仪器，需要临床不切实际的时间、费用和人员。因此，有必要开发一种更加实用的方法，该方法敏感、简单、快速和低成本，用于EGFR[3]的即时检测。

生物传感器是一种将生物相互作用转化为物理信号的设备。这种相互作用被记录在一个传感器(电化学的，光学的，机械的…)上，然后将其转化为电子信号[4-6]。

丝网印刷电极(SPE)技术提供了一种很有前途的解决方案，因为它满足了上面提到的大部分需求，这就是为什么SPE对各种商业用途具有很高的灵活性[7]。

本文介绍了用于EGFR检测的电化学金集成固相萃取生物传感器的初步研究结果。接下来的策略是通过原位电化学沉积4-羧甲基苯胺(CMA)使金电极生物功能化，然后接枝抗egfr抗体。利用电化学阻抗谱(EIS)对所开发的生物传感器进行了表征，结果发现它在50-120 pg/mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)的范围内具有高度敏感性，并且与其他干扰物(如HER2和HER3)相比，对EGFR具有非常强的选择性。

材料和方法

化工产品

本研究使用的试剂为:4-氨基苯乙酸(4-羧甲基苯胺(CMA))、亚硝酸钠(NaNO₂)、盐酸(HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、乙醇胺、PBS、磷酸盐缓冲盐水补间(PBS-Tween)和(Fe^{2 +}菲^{3 +})是从法国Sigma Aldrich公司购买的。EGFR蛋白和抗EGFR抗体购自法国研发系统公司。

抗体(Ab)和抗原(Ag)溶液

根据供应商的方案，抗体和抗原在PBS (pH 7.4)中稀释，以获得最终浓度为10µg/mL的原液。抗原(EGFR)为0.5 mg/mL，抗体(anti-EGFR)为0.5 mg/mL，分成等份，-20°C保存。然后在PBS中进一步稀释EGFR的原液，形成分析中使用的标准溶液(50,80,100,120 pg/mL)。

电化学表征

所有电化学测量均在室温(20±2℃)法拉第箱中进行，使用PSTrace软件(5.0.5版本，PalmSense B.V，荷兰)控制的PalmSense 4恒电位器(PalmSense B.V，荷兰)。循环伏安法(CV)用于用氧化还原探针K进行SPE表征_3.[Fe (CN)₆) / K₄[Fe (CN)₆在pH7.4的PBS缓冲液中5 mM。所使用的电位窗口在-0.4 ~ 0.6 V之间，扫描速率为0.06 V/s。CV重复三次，直到获得稳定的测量值。电化学阻抗谱(EIS)测量用于评估免疫传感平台的识别性能，灵敏度和选择性。在测量过程中，SPE被浸泡在5 mM K的电子介质溶液中后，相对于集成Ag/AgCl参比电极的电位保持在0.174 V_3.[Fe (CN)₆) / K₄[Fe (CN)₆在pH=7.4的PBS缓冲液中。使用开放存取软件EIS频谱分析仪进行数据采集和分析。

4-羧甲基苯胺的SPE活化

CV用于4-羧甲基苯胺(CMA)电化学沉积，如[8-13]所述。先在去离子水中超声处理10min，再用HCl 1M和NaNO两种溶液制备3mm CMA溶液₂加入1M形成浓度为15 mM的浓度。该溶液在冰箱中保存10分钟，然后与之前制备的CMA溶液混合，生成重氮衍生物。在-0.2到-1.2 V的窗口内以20 mV/s的扫描速率对CMA溶液中的SPE进行了15个CV循环，足以用CMA覆盖整个SPE表面。电沉积的循环伏安图见图1C。

图1:(A)生物传感器平台包含8个集成SPE，每个SPE包含一个银/氯化银参考电极(RE)、碳糊对电极(CE)和一个金工作电极(WE)。(B) WE在(I)和(II) CMA电化学沉积前后的循环伏安图。(C) CMA在WE表面电沉积的循环伏安图

SPE上的Ab固定

然后将抗egfr固定在CMA修饰的SPE上，首先将CMA分子的羧酸基团激活，在去离子水中EDC (0.4M)/NHS (0.1M)中孵育40分钟。然后用PBS洗涤去除多余的EDC/NHS，然后立即与抗egfr抗体PBS(10µg/mL)室温孵育40分钟。在室温下将SPE在乙醇胺溶液(1‰PBS)中孵育30分钟，以防止检测阶段的非特异性结合。

结果与讨论

金表面的生物功能化

用于EGFR检测的完全集成的生物传感器平台之前已经对许多复杂介质进行了制备和表征(图1A)。固相沉积由CMA沉积前后的CV表征，如2.3节所述。这种表征的结果如图1B所示。从裸金到沉积CMA后氧化/还原峰的消失是由于金表面CMA层的阻塞造成的，从而产生了弱的电子动力学转移。

PBS中EGFR的检测与干扰

图2A显示了不同浓度EGFR下生物传感器的Nyquist图(Np)。最大的半圆对应着抗egfr的固定。在50 pg/mL的EGFR中培养生物功能化WE后，获得了第二个具有更小半圆的Np，确认了由于特定结合而导致的传感器整体电化学阻抗的变化。随着EGFR浓度的增加，Nps持续下降，表明生物传感器对目标分析物有良好的响应。然后使用Randles等效电路模型拟合Nyquist图(图2A)，其中WE表示为电阻(R₁)，电荷转移电阻(R₂)，沃堡阻抗(W₁)和恒相元件(CPE)。

图2:(A) K的奈奎斯特阻抗图(Re(Z) vs Im(Z_3.[Fe (CN)₆) / K₄[Fe (CN)₆) (5mM)在PBS (pH=7.4)中处理不同浓度的EGFR。(B) EGFR、HER2、HER3生物功能化生物传感器检测曲线

真实阻抗(Re(Z))在奈奎斯特图中用x轴表示。这是R1和R2在图上的数学表示。所以奈奎斯特曲线尺寸的减小意味着R的减小₂的我们。如图2A所示，R2的下降与EGFR的浓度有关，这意味着R2的下降与生物传感器的灵敏度直接相关。归一化数据如图2(B)所示为|ΔR₂| / R₂(而|ΔR₂| / R₂R = |₂(EGFR) - r₂(anti-EGFR) | / R₂(抗egfr))，方程为[Y = (4.77×10^-3±4.74×10^-4) X +(0.1760±0,0540)]，r平方= 0.9709。

为了测试生物传感器的选择性，使用前面提到的相同的生物功能化步骤进行了其他测试，只检测了EGFR以外的生物标记物。为此，我们选择了HER2和HER3。这些生物标记物的结构与EGFR相似[14,15]，虽然一些研究发现唾液中存在HER2[16,17]，但尚不清楚是否也存在HER3。该生物传感器对EGFR的敏感性高于HER2 (Y = (-1.43×10^-4±0,0011)X +(0.3946±0.1116)，r -平方= -0.4934)和HER3 (Y = (7.94×10^-4±9.8350×10^-5) X +(0.0963±0.00803)，r -平方= 0.9554)，证明其对EGFR的选择性优于其他两种生物标志物。

结论

总之，我们希望报告CMA钝化层在SPE上的成功电沉积，以及抗egfr抗体在该电极上的成功固定。初步测试表明，EGFR浓度和工作电极的电荷转移电阻之间从50 pg/mL到120 pg/mL之间呈线性发展(r -平方= 0.9709)，以及由于非特异性结合而产生的最小干扰水平，与对其他生物标志物(如HER2(斜率= -1.43×10^-4±0,0011)和HER3(斜率= 7.94×10^-4±9.8350×10^-5)的敏感性相比，对目标生物标志物具有良好的敏感性(斜率= 4.77×10^-3±4.74×10^-4)。因此，该生物传感器为唾液中EGFR检测工具的未来发展提供了一个很好的平台。

确认

该研究得到了英国黎巴嫩技术中心的支持。

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