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摘要

双酚a (BPA)是一种内分泌干扰物，存在于大多数塑料成分中，对脂肪组织、免疫系统和肠道具有促炎作用，而肠道是最先暴露在BPA影响下的组织。人类长期通过受污染的食品和饮料接触BPA。本研究旨在研究极低剂量BPA (0.1 nM)对肠上皮细胞分化过程中的影响，并与低剂量BPA (1 nM)进行比较，确定益生菌在预防BPA诱导的肠通透性改变和炎症中的作用。

人结肠腺癌衍生细胞(cco -2细胞)在分化过程中分别用0.1 nM和1 nM BPA在G-1和G-15 (GPR30特异性激动剂和拮抗剂)和益生菌的存在下进行处理，之后进行跨上皮电阻(TEER)测量、共聚焦荧光实验、实时RT-PCR和Western blot分析。

即使在0.1 nM的剂量下，BPA也能显著降低分化Caco-2细胞的TEER。肠细胞单层通透性的增加和Caco-2细胞厚度的减少证实了BPA的作用。此外，BPA可诱导GPR30的表达和ERK1/2和NF-κB的磷酸化，尤其是在Caco-2细胞分化早期。然而，G-15抑制GPR30降低了BPA对ERK1/2和NF-κB磷酸化的影响。有趣的是，用益生菌LGG培养的细胞上清可以防止TEER的降低、紧密连接(TJs)的改变和pNF-κB的诱导。

极低剂量BPA (0.1 nM)和低剂量BPA (1 nM)诱导肠道炎症和改变肠道通透性的机制与GPR30有关。用益生菌LGG处理可以逆转BPA的作用。

关键字

双酚a (BPA)，内分泌干扰化学物质(EDC)，肠细胞，炎症，益生菌，生物后。

简介

在西方国家，肥胖、代谢综合征、糖尿病、过敏、自身免疫性疾病和炎症性肠病(IBD)的患病率迅速增加[1-6]。这些情况最有可能是由遗传易感性之间的复杂相互作用造成的;由对共生菌群的反应引起的免疫失调;药理、心理和饮食因素[7,8]。特别是，从组织培养、动物和人类研究以及流行病学证据中获得的大量报告支持了环境化合物在人类代谢和炎症疾病中的作用[9-11]。BPA(双酚A)是一种“致肥物质”，在塑料中大量存在，对细胞增殖、炎症途径、免疫系统和肠道都有影响[12-18]。BPA分布在世界各地，在环境影响疾病和人类健康方面发挥着重要作用[19]。此外，双酚a从锡制的食品和饮料容器中释放出来，主要通过摄入食品和饮料被吸收。因此，人类长期接触BPA，首先接触肠上皮细胞。

BPA可以结合多个雌激素受体，特别是跨膜非经典雌激素受体GPR30，它介导雌激素依赖的非基因组反应快速信号事件[20-22]。BPA也可以从人体体液(0.1-10 nM)中回收。人血清中BPA的浓度约为0.1-1000 nM[23,24]。一些研究表明，低浓度的BPA可以改变细胞[25,26]。早期研究表明BPA会破坏大鼠和小鼠的肠道屏障[18,27,28]。

世界卫生组织将益生菌定义为"适当剂量施用可对人体健康有益的活微生物，对宿主的健康产生有益影响"(世卫组织/2001)[29]。益生菌作为一种预防和治疗代谢功能障碍的新方法，近年来受到了广泛关注。然而，活的益生菌需要在肠道内定植才能发挥其功能，而由于各种病理或生理条件的影响，定植并不总是有效的，特别是当受试者服用肠道细菌干扰药物时。后生物制剂是由益生菌在基质中发酵产生的，不需要在肠道中定植，被认为是益生菌的一种替代方法。后生物制剂已用于预防几种疾病。乳杆菌GG (LGG)是一种特性最好的益生菌株，已广泛应用于治疗多种疾病[30]。益生菌已成功地用于防止小鼠体内BPA活性和解毒水溶液[31,32]。在这里，我们证明了BPA在低剂量和极低剂量下诱导炎症和干扰肠通透性，大约是WHO接受剂量的1000和10000倍，主要在分化的Caco-2细胞中。此外，我们还发现低剂量和高剂量双酚a都能增加分化和非分化肠道Caco-2细胞的炎症标记物。一种非常常见的益生菌，如LGG，可以防止炎症和由低剂量和极低剂量BPA引起的肠通透性改变。

本手稿中描述的活性剂量长期存在于我们的环境中，被认为是不可避免的。它们对炎症和肠通透性的影响可能为包括代谢性疾病和肠炎症性疾病(IBD)在内的多种疾病创造一个易发环境。预防这些影响的后生物制剂可对健康和疾病产生重要影响。

在本研究中，我们利用分化过程中的人结肠癌衍生细胞系(Caco-2)，研究了低(1 nM)和极低(0.1 nM)剂量BPA对肠上皮细胞的作用，以及生物后LGG的影响。

材料和方法

细胞培养，材料和试剂

人结肠癌腺癌衍生细胞(cco -2细胞)[33]是结肠癌细胞，可分化为上皮样细胞，我们将其单分子培养，并用不同浓度的BPA (0.1 nM和1 nM)处理其分化(20天)。Caco-2细胞来自实验室间细胞系集合(Centro di BiotecnologieAvanzate，热那亚，意大利)，在添加10%胎牛血清、100单位青霉素-链霉素/mL和1 mmol/L谷氨酰胺的dmem中生长(所有这些产品均为意大利米兰Gibco Invitrogen公司生产)。细胞保存在湿度(95%)空气和5% CO的环境中²在37°C。从70%到80%的融合培养中获得单细胞悬浮液，然后在10播种⁵细胞/厘米²用可拆卸的聚碳酸酯微孔细胞培养插入13或25毫米的玻璃盖上(Transwell, 24毫米直径，0.4毫米孔径;美国纽约康宁)。

双酚- a (BPA)由西格玛-奥尔德里奇化学公司(意大利米兰)提供。G-1是一种GPR30激动剂(100 nM)， G-15是一种GPR30拮抗剂(1 μM)，购买自Azano制药公司(Albuquerque, nM)。所有其他化学品均来自Sigma化学公司(St. Louis, MO, USA)。

经上皮电阻实验

跨上皮电阻(TEER)是测量细胞单层电阻的一种非常灵敏和可靠的方法，可以确定单层的完整性和通透性。48小时内TEER的测量方法如前所述[34]。简单地说，在我们从培养箱中取出Transwell仪器后，我们允许在无菌罩下孵育10分钟，以使样品适应。然后，我们用1.0 cm测量每个Transwell的TEER²平面电极连接到电压表(Millipore, Billerica, MA)。

由于电解质载体运输需要细胞以极化方式生长，细胞间TJs结构，因此Caco-2细胞在实验前至少需要培养20天(融合后的11-13天)。在播种和0.1 nM和1 nM BPA处理后的2 ~ 20天内，每48 h测量细胞单层TEER，以评估分化过程中的通透性。

共聚焦荧光显微镜:闭塞蛋白染色

Caco-2细胞接种在玻璃盖上，每48 h用0.1 nM或1 nM BPA处理一次，持续20天。细胞在3%多聚甲醛中固定10分钟，用0.2% Triton X-100渗透10分钟，在室温1% FBS-PBS中封闭30分钟。多克隆抗兔闭塞蛋白抗体(1:100;Santa Cruz, DBA Milan, Italy)在黑暗潮湿的室内进行了1小时的实验。然后将细胞与Alexa-488结合抗兔二抗(Invitrogen,Milan,Italy)室温孵育45分钟。细胞被安装，然后用共聚焦荧光显微镜(LSM 510;蔡司，莱比锡，德国)使用蔡司AIS软件进行共定位分析，如前所述[36]。除非在图例中另有说明，显微照片在同一放大率(63×物镜)下显示在图中。

然后，我们不需要进行数学运算，获得了沿光轴(识别为z轴)的三维样品扫描图像。这种共聚焦荧光显微镜技术使我们能够以肌动蛋白作为荧光染料，以三维排列方式直接研究活细胞中的整个肠道细胞体积。

免疫印迹分析

cco -2细胞分别用0.1 nM和1 nM的BPA和GPR30激动剂或拮抗剂G-1或G-15处理30分钟，孵育3 ~ 20天。将细胞洗涤2次，重悬于裂解缓冲液(50 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1% Triton, 1 mM PMSF, 1 mM VO4, 100× Aprotinin, 50× LAP，除LAP从意大利米兰Sigma购买外)。使用SDS- page和标准运行缓冲液(25 mM Tris, 192 mM甘氨酸和0.1% SDS)分析细胞裂解物，并使用转移缓冲液(25 mM Tris, 192 mM甘氨酸，0.1% SDS和20%甲醇，所有这些都从意大利米兰的Sigma-Aldrich购买)转移到硝化纤维素膜上(Whatman Gmbh, Dassel，德国)。用5%脱脂干牛奶阻断膜，并用小鼠抗py - erk1 /2和兔抗erk1 /2 (Santa Cruz, Milan, Italy)、兔抗pnf -κB (Cell Signaling, Euroclone, Milan, Italy)和小鼠抗微管蛋白(Sigma-Aldrich, Milan, Italy)进行检测。使用ECL (GE Healthcare, Amersham，白金汉郡，英国)对波段进行可视化，曝光时间为2-10分钟。通过对一个波段的所有像素进行积分，减去背景，计算该波段周围像素的平均值，来评估波段强度[33,500,36]。

实时rt - pcr分析

根据制造商的说明和先前的描述，使用RNeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)从Caco-2细胞中分离出细胞总RNA[37,38]。三次重复进行反应，以肽酰丙氨酰异构酶A (PPIA)为内标。用于实时RT-PCR分析的引物序列如表1所示。

表1。引物序列用于实时RT-PCR分析。

基因	序列
GPR30	向前:5'- CTTCATCGTGCCCTTCGCC -3' 反向:5”——GAGAAGGCGGCGAGGTTGA-3”
IL-7	转发:5”——ACTTCCTCCCCTGATCCTTG-3” 反向:5“-GCTGTCCAATAATTGATCGATGC-3”
MCP-1	向前:5'- CTCTGCCGCCCTTCTGTG -3' 反向:5'- GGGACACTTGCTGCTGGT -3'
PPIA	转发:5”——TACGGGTCCTGGCATCTTGT-3” 反向:5”——GGTGATCTTCTTGCTGGTCT-3”

缩写的列表。GPR30: G蛋白偶联雌激素受体-30,IL-7:白细胞介素-7,MCP-1:单核细胞化学吸引蛋白-1,PPIA:肽酰丙氨酰异构酶A

细胞因子，趋化因子和生长因子测定

使用Bio-Plex多重人类细胞因子和生长因子测定试剂盒(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)在培养上清液中测定由分化的Caco-2细胞产生的27种不同的细胞因子、趋化因子和生长因子，根据制造商的说明，如前所述[39]。特别是在分化过程中检查Caco-2条件培养基，特别是在分化开始(第3天)和结束(第20天)。

LGG上清的制备方法

乳杆菌GG (LGG)(5×10⁹CFU，)从Dicofarm (ATCC53103)购买，在添加FBS和谷氨酰胺(无抗生素)的DMEM中培养50 ml。培养物在37℃的振荡器中孵育一夜(Thermo, Euroclone, Milan, Italy;每分钟160次振荡)。采用Beckman DU-7, Chaska, MN分光光度法在波长600 nm处测定细菌浓度;通过光密度(OD)的读取，可以用以下公式计算细菌浓度:OD 2 = 1.5 × 10⁹菌落(CFU) /毫升。细菌培养在室温下以3000转/分离心10分钟。回收上清，用0.22微米过滤器过滤[40-42]。

统计分析

GraphPad Prism 5.lnk软件(GraphPad software, San Diego, CA, USA)用于统计分析和构建图形表示。统计学分析采用方差分析与Bonferroni校正。p值< 0.05表示有统计学意义。用于统计分析的重复数如图所示。

结果

双酚a (BPA)对渗透性、阻隔功能和厚度的影响

结肠癌细胞系Caco-2细胞可分化为肠上皮样细胞，其上皮间电阻力(TEER)是屏障完整性的良好标志。Caco-2细胞单分子培养，在分化过程中(20天)每48 h用0.1 nM或1 nM BPA处理一次。与双酚A处理的对照组细胞的TEER相比，双酚A处理17天和20天后TEER显著下降(p<0.01, p<0.001)(图1A和1B)。接下来，在TEER降低的同一时间点，通过检测TJ结构蛋白occludin的水平来评估紧密连接(TJs)的完整性。培养17天后，在两种浓度BPA的存在下，occludin的表达显著降低(p<0.05)，如Western blot分析(图1C和1D)和免疫荧光(图1E)所示。

图1所示。双酚a (BPA)对肠道通透性的影响．(A-B) Caco-2细胞单分子培养，在分化过程中分别用0.1 nM和1 nM BPA处理(20天)。与对照细胞相比，BPA(0.1和1 nM)在17天和20天诱导TEER下降的时间过程。柱状表示均值，柱状表示三个独立实验的标准差。采用带Bonferroni校正的方差分析比较bpa处理的细胞和未处理的细胞(NT)。(* * p < 0.01, * * * * p < 0.0001)。(C-D)使用闭塞蛋白和微管蛋白抗体作为负载对照，对未处理的cco -2细胞和经不同浓度(0.1 nM和1 nM) BPA处理的cco -2细胞的蛋白裂解物进行Western blot分析。所示的放射自显像是三个独立实验的代表，并进行了密度分析。星号表示差异有统计学意义(***p<0.001)。(E) Caco-2单分子膜分别用0.1 nM和1 nM BPA处理，并用抗闭塞素抗体染色，然后用共聚焦显微镜观察。(F)肌动蛋白的共聚焦荧光定位z轴．该结果是三个独立实验的代表性结果，结果相似

共聚焦显微镜允许扫描样品中的薄平面沿光学z-轴通过控制微米增量。通过光学测量，BPA降低了细胞厚度z-轴，从对照样品的40微米到在0.1 nM和1 nM双酚a处理的样品的12微米(图1F)。

BPA对细胞内通路和炎症的影响

BPA被定义为一种“弱雌激素”。一些研究支持bpa依赖的雌激素活性是由g蛋白偶联受体30 (GRP30)激活介导的，它导致ERK/MAPK和AKT磷酸化[43]。我们研究了BPA在CaCo-2细胞分化第3天和第20天诱导ERK1/2磷酸化的能力。0.1 nM和1 nM双酚a孵育细胞30分钟，均显著增加ERK1/2磷酸化(p<0.001)(图2A和2B)。

图2。BPA激活炎症途径。使用p-ERK1/2、ERK (A-B)和pNF-κB (C-D)抗体对未处理的cco -2细胞和不同浓度BPA(0.1和1 nM)处理30分钟的cco -2细胞的蛋白裂解物进行Western blot分析(3-20天)。微管蛋白被用作加载控制。放射自显像是四个独立实验的代表，并进行了密度分析。采用带Bonferroni校正的方差分析比较bpa处理的细胞和未处理的细胞(NT)。星号表示差异有统计学意义(*p<0.05， *p<0.01)。采用real-time RT-PCR方法测定0.1 nM和1 nM双酚a孵育3天和20天后Caco-2细胞分化过程中IL-7和MCP1 mRNA水平;结果以相对表达单位(REU)表示。以PPIA作为标准对照。柱状图表示三个独立实验的平均值±SD。 ANOVA with Bonferroni correction was performed to compare BPA-treated cells and non-treated cells (NT). Asterisks indicate statistically significant differences (***p<0.001)

由于MAPKs参与i κκ-依赖的NF-κB激活[44]，我们评估了在0.1 nM和1 nM BPA存在30分钟的分化第3天和第20天磷酸化的NF-κB (p65)水平。在分化早期，两种浓度的BPA都以统计学意义上显著的方式刺激了pNF-κB的磷酸化，这表明在未成熟和分化的Caco-2细胞中，NF-κB都参与了BPA介导的炎症反应(图2C和2D)。

接下来，我们测量了分化Caco-2细胞上清液中27种不同细胞因子、趋化因子和生长因子的表达。我们的结果表明，在0.1 nM和1 nM BPA处理后，细胞培养基中白细胞介素-7 (IL-7)和单核细胞化学引诱蛋白-1 (MCP-1/CCL2)的分泌适度增加(分别p<0.05和p<0.01)(表2)。此外，在1 nM BPA处理的Caco-2细胞中，我们证实IL-7和MCP-1 mRNA水平适度增加，特别是在分化早期(p<0.01和p<0.001)(图2E-2F)。所有这些数据都表明，低浓度和极低浓度的BPA会增加炎症标志物。

表2。Caco-2释放细胞因子和生长因子。

错过一些细胞因子。在未处理的细胞和0.1 nM和1 nM双酚A处理的细胞中，使用Bio-Plex多重细胞因子检测试剂盒检测分化Caco-2细胞产生的27种不同的细胞因子、趋化因子和生长因子，如方法部分所述(*p<0.05;* * p < 0.01)

细胞因子和生长因子 (pg / mL)	CTRL	双酚a(0.1海里)	双酚a(1纳米)
il - 1β	3095±0386	2963±0213	2, 79±0542
IL-1ra	102396±2375	95143 * * 3414(±)	91357 * * 3285(±)
- 2	18573±0878	18岁,47±0966	18日,07年±0565
il - 4	2366±0159	2276±0192	2183±0060
IL-5	5815±0179	5855±0148	6502 * 0454(±)
il - 6	49±0382	10、03±0471	10、15±0359
IL-7	3144±0193	4、16 * 0240(±)	4106 * 0526(±)
引发	29406±9948	21526±9日,7062	24386±16903
IL-9	15863±0206	14日,68±0866	14427±0849
il - 10	81383±7361	86983±13234	80年,04±2616
il - 12	386653±23208	397505±75682	357052±41264
IL-13	18日,39±1390	16405±2088	18467±2162
IL-15	20083±0848	18853±1212	19202±1851
IL-17	27793±0416	26日,86±1509	27326±1006
Eotaxin	23163±0550	22123±2161	23713±0545
bFGF	43466±3371	48253±6398	45056±3043
g - csf	29日,36±0946	28316±2188	29日,69±2325
gm - csf	55816±0963	52263±4329	48岁的59±3034
干扰素γ	79753±5965	74043±5368	74年,52±1992
IP-10	222年,41±19990	230343±50996	213年,11±42083
MIP-1a	1093±0068	1085±0054	1197±0185
MIP-1b	8583±0248	8603±0651	7786±0529
MCP1	9日,51±0098	76 * 0076(±)	11005 * * 0404(±)
PDGF	90年,25±2871	85865±2722	99625 * 0756(±)
激昂的演说	26日9±0537	26615±1427	26日,64±0547
肿瘤坏死因子α	25日,89±0514	25日,67±1160	28566±5696
VEGF	2738、802±425326	2586、653±537244	2708、85±482474

极低剂量双酚a (BPA)对GPR30表达和功能的影响

Caco-2细胞表达ERß极低水平，但ERα未检测到(数据未显示)。GPR30RT-PCR检测的mRNA水平在0.1 nM和1 nM BPA孵育时显著增加(p<0.01, p<0.001)(图3A)。为了确定BPA的作用是否通过激活GPR30受体介导，我们使用了GPR30选择性激动剂(G-1)和GPR30特异性拮抗剂(G-15)。0.1 nM和1 nM BPA处理cco -2细胞在分化的两个阶段(3和20天)均诱导ERK1/2和p65的激活，与刺激G-1诱导的结果相似。相反，G-15在分化过程中逆转了BPA的作用(图3B至3L)。

图3。BPA增加GPR30的表达和功能。(A)在0.1 nM和1 nM BPA孵育3天和20天后，通过RT - real- PCR分析cco -2细胞中GPR30 mRNA的表达水平，并以相对表达单位(REU)表达。柱状图表示三个独立实验的平均值±SD。采用带Bonferroni校正的方差分析比较bpa处理的细胞和未处理的细胞(NT)。星号表示差异有统计学意义(**p<0.01;* * * p < 0.001)。

(B)用不同浓度的BPA(0.1和1 nM)和G-1 (100 nM)和G-15 (1 μM)处理cco -2单分子膜。然后用抗闭塞素抗体染色。共聚焦显微镜显示，与BPA暴露后观察到的一样，G-1处理使紧密连接中断，而G-15处理防止了BPA的有害影响。

用不同浓度(0.1 nM和1 nM)、G-1 (100 nM)和G-15 (1 μM) BPA处理的cco -2细胞，分别在分化3天(C-F)和20天(G-L)后，分别用pERK1/2、pNF-κB、ERK1/2和微管蛋白抗体作为负载对照，用Western blot分析cco -2细胞和未处理的cco -2细胞的蛋白裂解物。放射自显像是四个独立实验的代表。采用带Bonferroni校正的方差分析比较bpa处理的细胞和未处理的细胞(NT)。星号表示差异有统计学意义(*p<0.05;* * p < 0.01;* * * p < 0.001)

通过共聚焦显微镜，我们观察到BPA和G1都降低了咬合蛋白水平，而G-15逆转了这一作用，表明BPA诱导的咬合蛋白水平的改变可能是由GPR30介导的(图3B)。

LGG上清处理改善肠道屏障，防止bpa诱导的炎症

我们接下来评估了生物后处理是否可以防止BPA对肠道屏障和炎症的影响。为此，我们在Caco-2细胞分化的第17天加入LGG上清液(LGG)，孵育24小时。在这些条件下，补充LGG抑制了bpa介导的TEER下降(图4A和4B)。此外，LGG显著增加occludin水平，并阻止BPA诱导的nf -κB的激活(图4C至4E)。

图4。LGG上清液对BPA的影响。(A-B) Caco-2细胞单分子培养，在分化过程中分别用0.1 nM和1 nM BPA处理。与对照组相比，LGG治疗24小时后，在分化17天后，0.1 nM和1 nM bpa诱导的TEER下降的时间过程(红线)。柱状表示均值，柱状表示三个独立实验的标准差。采用Bonferroni检验将BPA和lgg处理的样品与NT样品进行比较(*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001， ****p<0.0001)。(D-E) cco -2细胞用LGG处理30分钟，用0.1 nM和1 nM BPA刺激，以pNF-κB和微管蛋白抗体作为负载对照，用Western blot分析。所示的放射自显像是三个独立实验的代表，并进行了密度分析。采用带Bonferroni校正的方差分析比较bpa处理的细胞与未处理的细胞(NT)和LGG处理后的细胞。星号表示差异有统计学意义(*p<0.05)

综上所述，我们的结果表明，LGG上清可以限制BPA对肠道屏障功能的影响。

讨论

在本研究中，我们发现0.1 nM和1 nM的BPA显著降低TEER，并抑制TJ完整性，同时降低Caco-2单分子层厚度。此外，在细胞分化过程中，BPA通过增加NF-κB指标p65的表达增强炎症途径，同时刺激促炎介质IL-7和MCP1的分泌。BPA的促炎作用似乎是由GPR30的过表达和激活介导的。事实上，BPA在Caco-2细胞中也产生了同样的有害影响，Caco-2细胞用选择性GPR30激动剂G1处理后，被G15(一种GPR30特异性拮抗剂)逆转。

双酚a对未分化的Caco-2细胞的炎症作用表明，早期的双酚a暴露，例如母亲摄入的食物和饮料，可能会破坏肠道发育过程中正常的产前和产后成熟，并可能产生永久性的表观遗传和跨代修饰[27,28,45]。

此外，成人持续摄入BPA可能会影响位于隐毛绒毛底部的未分化/干细胞，这些细胞与不同的肠道上皮内淋巴细胞接触，因此对肠道免疫调节有很强的影响[34,46,47]。

特别是，肠通透性增加是与屏障功能障碍相关的粘膜炎症的早期事件，结肠直肠癌风险增加与长期慢性炎症有关[48,49]。BPA以其活性和游离形式存在于食品和饮料中，首先和最频繁地接触肠道上皮细胞[19]，并在局部和全身炎症病理的易感性中发挥相关作用。

越来越多的证据表明，BPA的内分泌干扰作用剂量低于参考限值[25-28,50]。在这篇文章中，我们使用非常低剂量的BPA(0.1和1 nM)通过测定NF-κB水平来检测炎症途径。

NF-κB通过控制炎症基因的转录，在调节慢性炎症中发挥核心作用，含有p65的NF-κB二聚体似乎具有深刻的促炎活性[51]。

在我们的实验中，未分化细胞在0.1 nM和1 nM的BPA处理后，以及在分化20天后，NFkB水平增加。这些结果再次表明，分化程度较低的上皮细胞对非常小剂量的BPA敏感。这些效应之后是促炎趋化因子IL-7和MCP-1在培养基中的分泌适度增加。IL-7是由肠上皮细胞(主要是杯状细胞)产生的一种著名的促炎细胞因子，是一种多效免疫调节蛋白，参与B、T淋巴细胞的生存、增殖、分化和成熟[52-55]。MCP-1是一种趋化因子，据报道，与正常健康受试者相比，IBD患者的趋化因子MCP-1在增强肠道和全身炎症的严重程度方面发挥着显著作用[56-58]。

GPR30是一种非经典的雌激素受体，参与调节许多生物学过程，包括免疫反应和胃肠道生理，影响肠屏障成熟[25,59-61]。特别是，有报道称肠粘膜肥大细胞中GPR30的存在在IBD患者中增加[62]。与Chan在2010年发表的研究结果一致，我们描述了在激活ERK1/2的支持下，BPA培养cco -2细胞上GPR30的表达和活性增加[63]。

最近，研究证明0.1 nM的BPA可诱导培养的成熟乳腺脂肪细胞和从人脂肪组织活检中分离的SVF细胞[25]发生炎症。

LGG及其上清液(或生物后)可改善肠屏障功能[64]。后生物制剂具有原始细菌的大部分作用，但不能解决与细菌治疗相关的所有问题[40-42]。因此，我们使用LGG上清进行实验。有趣的是，LGG上清可以抑制BPA对TEER、TJ分布和炎症的影响。

以前的研究已经强调了益生菌在bpa诱导效应中的作用。双歧杆菌谕令应变益力多,干酪乳杆菌菌株Shirota可以对大鼠[31]的BPA饮食暴露发挥保护作用，有趣的是，某些益生菌被发现有能力去除水溶液[32]中的BPA。我们使用LGG益生菌的后生物证明BPA的大部分影响可以在没有细菌体的情况下被阻止。最近的研究表明，后生物制剂在体内和体外都具有有益作用[40-42,65-67]。BPA暴露是否会增加患肠道炎症的风险，而后生物制剂可以预防这种炎症，还有待于通过体内或体外研究来更好地确定。

确认

没有一个

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

MN和IC在文章的设计、采集、数据解释和起草方面做出了主要贡献。CC、VDE、FO、RT、PF对结果进行了分析、解释和讨论。MVB和RV主要参与了概念设计、解读、成果讨论和整体工作的监督。所有的作者都严格地修改并批准了最终版本。

参考文献

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