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摘要

此前有报道称，在C3D2F1 3T3-a细胞中，γ辐照后G1阻滞可被聚(adp -核糖)聚合酶(Parp1)， 3-氨基苯甲酰胺(3-AB)抑制剂抑制，而p53基因的第5外显子至第9外显子未发生突变。为了阐明γ辐射后Parp1通过p53通路参与G1阻滞的机制，我们研究了3-AB对G1阻滞时p53依赖信号通路下游p53蛋白积累的影响。通过凝胶位移法检测p53与其一致结合序列的结合活性，以评估p53的反式激活活性。的表达Waf1/Cip1/p21和Mdm2Northern blot检测mRNA表达。p53的DNA结合活性在γ射线照射后呈剂量依赖性增加，且在3-AB存在时增强。的表达Waf1/Cip1/p21和Mdm2在没有3-AB的情况下，8 Gy照射2.5 h后分别诱导约8倍和12倍。这些表达在3-AB存在时被抑制。在本研究中，已经证明Parp1参与调控的可能性Waf1/Cip1/p21和Mdm2通过P53转录激活的，这表明PARP1涉及DNA损伤后P53依赖性信号转导的下游。

关键词

Parp1, DNA损伤，G1阻滞，p53, p21, Mdm2

介绍

多条证据点到聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP1）参与细胞DNA损伤修复。在PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺（3-AB）存在下，DNA损伤因子等DNA损伤因子诱导的细胞毒性致恶化。响应于烷基化试剂的DNA修复被抑制在表达低水平的PARP1或显性阴性PARP1突变体中，仅表达​​DNA结合结构域;和抑制PARP1表达与反感RNA对抗PARP1.mRNA延迟DNA修复[1-3]。PARP1在无细胞系统中报道了PARP1在DNA修复中的作用;在NAD [4]存在下，DNA修复过程以PARP1依赖性方式暂时中断。由于PARP1特异性识别切割的DNA末端，因此认为在与链中断裂相关的DNA切除修复途径中的功能。除了证据表明PARP1直接在DNA修复上工作，还有报告说明PARP1大大促进了染色质中DNA连接酶的活性[5]。另外，“组蛋白穿梭模型”指出聚-ADP-核糖基化的组蛋白对DNA失去了亲和力，并通过松开DNA裂解末端的结构来促进DNA修复[6]。因此，PARP1似乎涉及各种生理学与DNA链脱落的功能。

在DNA损伤剂处理的细胞中，转录因子p53的蛋白水平升高，这是一种翻译后机制，延长了p53在细胞中的半衰期[7,8]。这种半衰期的延长和p53在细胞核内的积累影响了启动子区域p53结合位点基因的表达，导致基因表达的改变和诱导G1阻滞[7-9]。在许多已知受p53调控的基因中，诱导Waf1/Cip1/p21p53稳定后，抑制G1细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）复合物的催化酶的活性[10,11]。此外，p53蛋白还诱导其他基因的表达，如Mdm2和Gadd45除了诱导DNA损伤后的细胞周期阻滞外，这可能对其他功能很重要[9,12,13]。有研究表明，atc的致病基因产物参与了DNA损伤导致p53蛋白水平升高的信号通路，而b淋巴细胞atc患者在DNA损伤[14]后p53蛋白的积累没有增加。

本研究探讨了Parp1作为DNA损伤定量信息传递给p53的关键分子的可能性。为了阐明这一假设，我们通过检测Parp1抑制剂3-AB存在下p53调控基因的DNA结合和转录水平，分析了Parp1在DNA损伤后p53信号通路下游的参与。这些分析揭示了Parp1在γ辐射后G1抑制中的作用，但需要进一步阐明该信号传输的途径。

材料和方法

细胞培养

本研究使用C3D2F1 3T3-a细胞系，一种由C3H/HeJ和DBA/2J小鼠14天胚胎建立的成纤维细胞系[15]。该细胞系由小川克弘教授及其合作者在浅川医科大学建立并提供。细胞以3×10的速度接种⁵细胞在DMEM培养皿中培养(ICN生化公司。Costa Mesa, CA, USA)，含10%胎牛血清(FBS)。细胞每3天传代一次。翻倍的时间大约是17小时。据报道，该细胞系的第5外显子到第9外显子没有突变p53基因[15]。使用γ射线照射C3D2F1 3T3-a细胞^60.1 Gy/min Co射线辐照器。

PARP的抑制剂

3-AB购自东京化学工业株式会社(日本东京)

凝胶转移试验

稳定后，P53调节具有P53识别序列的基因的转录。作为测量细胞内P53转录激活能力的指标，使用凝胶换体测定，其测量其具有P53识别序列的寡核酸DNA探针的结合活性。作为P53结合共分序列，已经报道了自互补双链DNA 5'-GGACATGCCCGGCATGTCC-3'[16]。合成20-MEL DNA，在退火缓冲溶液中加热[20mM Tris-Cl（pH7.5），10mM MgCl₂，0.1 M NaCl]在95°C下10分钟，然后在65°C下90分钟，冷却至室温，并退火。通过15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离该DNA。通过在4°C下摇动过夜，用2 mL 0.2 M三乙基碳酸氢铵洗脱获得的双链DNA片段，通过乙醇沉淀收集，并溶解于30 mM NaCl，10 mM Tris-Cl（pH 8.0），1 mM EDTA。使用T4多核苷酸激酶和[γ]通过5'-末端扭结进行标记-³²P] 此后，根据Funk方法制备核提取物等．首先，用磷酸盐缓冲的盐水（PBS）洗涤细胞两次，2mL缓冲溶液A [20mM钾 - HEPES（pH7.6），20％甘油，10mM NaCl，1.5mM MgCl₂，每10厘米含量倒入0.2mM EDTA，0.1％Triton X-100,1 mM PMSF，1mM DTT]。将细胞从盘脱离后，将它们转移到离心管后，使其在冰上静置5分钟。将细胞用搅拌型均化器（L杵）搅拌20次，并以250×g再次离心5分钟以获得核馏分作为沉淀物。为此，加入2ml含有0.5M NaCl的缓冲溶液A，并通过在4℃下振荡30分钟萃取沉淀物。此外，通过以10,800×G以10,800×g离心15分钟收集上清液。将上清液对缓冲溶液A透析，并以250×G离心5分钟以除去沉淀物。使用Bio-rad蛋白质测定（Bio-rad Laboratories，Hercules，Ca，USA）进行蛋白质量化，并分配核提取物并储存在-80℃。通过加入3×10，在含有150mM NaCl的缓冲溶液A的25℃下在25℃下进行反应10分钟。⁴cpm/0.6毫克氯³²p标记探针，4 mg聚(dI-dC)和50 ng抗p53抗体(Ab421, Merck Millipore, Darmstadt，德国)到核提取物(相当于2 mg蛋白质)，体积为18.5µL。随后，在120 V、4°C下，加入1.9µL含有5%甘油、50 mM EDTA、0.05 %溴苯酚蓝、0.05 %二甲苯氰的溶液，进行4%聚丙烯酰胺凝胶电泳4小时。凝胶干燥后用图像分析仪(BAS2000, FUJIFIRM, Tokyo, Japan)进行分析。

北印迹分析

从N末端翻译发起密码子的鼠标Waf1/Cip1/p21cDNA，下面两个寡核苷酸，一个64聚体和一个62聚体寡核苷酸，感觉5 -ATGTCCAATCCTGGTGATGTCCGACCTGTTCCGCACAGGAGCAAAGTGTGCCGTTGTCTC-3 (64 - mer)和反义5“-ACGGCAACAGAGAAGCCAGGGCACCTGTCACTCGTCAACTCGGCACTAACGCTACGCGAGTA-3”(62 - mer) 110年基地[17],由固相phosphoramidite方法使用应用生物系统公司392 DNA / RNA合成器。将这两种寡核苷酸分别在95°C下加热150 ng 5 min和65°C下加热2 min后，将其逐渐冷却至室温并进行退火。此后，用DNA聚合酶I（Klenow片段）通过延伸反应用[α]标记-³²P] dCTP。用人鼠同源性100%的区域作为引物Mdm2[18]。换句话说，对人的氨基酸1 ~ 7和298 ~ 304分别定义了意义引物5'-TGTGCAATACCAACATGTCTG-3' (21-mer)和反义引物5'-TTCCAATAGTCAGCTAAGG-3' (19-mer)MDM2使用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法分离cDNA。将亚克隆到pBluescript SK（+）载体（Stratagene，La Jolla，CA，USA）中的0.8-kbp HindIII和SacI片段用作探针。使用多引物法标记50 ng DNA作为模板，[α-³²采用Megaprime DNA标记系统(Amersham, BUCKS, UK)和Sephadex G-50 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)自旋柱法进行dCTP标记，排除游离核苷酸，留下标记探针。比活性为1.0 × 10⁵CPM / NG。

结果

γ辐射后3-AB对p53转录活性的影响

采用电泳凝胶移位法分析DNA损伤后G1阻滞信号通路中3-AB对p53积累下游阶段的影响。在C3D2F1 3T3-a细胞核提取物中检测到p53的DNA结合活性。按照Zauberman的方法等等。在反应混合物中加入针对p53蛋白c端Ab421的抗体[19]，该抗体已知不会干扰p53特异的DNA结合活性，p53蛋白-DNA复合物带进一步超移，得到更清晰的信号[19]。为了与该信号进行比较，使用杆状病毒表达系统表达的纯化人p53蛋白作为对照(图1A)。p53的结合活性与γ射线的剂量依赖性有关。12gy照射后1小时的结合活性是未照射时的6倍(图1B)。在4 mM处存在3-AB时，我们注意到p53蛋白的基础DNA结合活性略有增加。在3-AB存在的情况下，p53的DNA结合活性在8 Gy照射1小时后进一步增强(图2)，说明3-AB并没有抑制p53的DNA结合，而是增强了。

图1所示。γ射线照射后p53蛋白的特异性DNA结合活性

通过凝胶移位测定显示γ辐射1小时后P53至DNA的特异性DNA结合活性。（a）制备纯化的人P53蛋白和C3D2F1-3T3-A细胞的核提取溶液。箭头表示P53抗体超级移位的条带（AB421）。（b）显示核提取物P53的特定DNA结合活性在γ辐照剂量为0,0.5,2,4,8和12 Gy后1小时后辐射1小时

图2。3-AB对γ-辐照后P53蛋白特异性DNA结合活性的影响

显示了在P53至DNA的特异性结合活性的8GY辐射后1小时的4mm 3-AB的效果。箭头表示P53抗体超级移位的带（AB421）

3-AB对WAF1/CIP1/p21和Mdm2 mRNA表达水平的影响

图3。3-AB对诱导的影响WAF1 / CIP1 / P21 mRNA辐照后表达

结果表明，在8 Gy辐照后0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和24 h，添加4 mM 3-AB对诱导Waf1/Cip1/p21 m RNA表达的影响。上图为各时间点mRNA水平的northern blot分析。在下面的部分，每一时间段的频带强度被绘制出来。白色圆圈表示未用3-AB处理过的样品，黑色圆圈表示用4mm3 - ab处理过的样品。纵轴为的相对表达水平WAF1 / CIP1 / P21 mRNA，横轴表示伽玛射线照射后的时间。数据被规范化使用GAPDH.作为内源性控制

分析了3-AB对P53响应信号传导因子mRNA表达水平的影响。在C3D2F1 3T3-A细胞中，mRNA表达水平WAF1 / CIP1 / P21在8 Gy照射后2.5 h左右暂时升高8倍，照射5 h后逐渐降低。在12.5 h和24 h，当G1阻滞明显时，表达仍维持一定程度。然而，在4mm3 - ab存在时，WAF1 p21 / CIP /2.5小时后mRNA约30％，与3-AB的不添加条件相比，它被抑制约50％（图3）。在C3D2F1 3T3-A细胞中，表达Mdm28 Gy辐照2.5 h后，mRNA短暂增加约12倍。在照射后5 h内，其浓度较照射后2.5 h的峰值下降约50%Mdm2其后表达逐渐下降。在4mm3 - ab的存在下Mdm2辐照后，表达抑制约75％2.5小时。注意，持续更高Mdm2在照射后24小时，细胞处于G1抑制状态时观察到表达(图4)Mdm2在3-AB的存在下，在3-AB存在下在10-24小时的表达可以在图2中显示的3-AB存在下与较高的P53 DNA结合活性有关。

图4。3-AB对诱导的影响Mdm2γ射线照射后mRNA的表达

图中显示了在8Gyγ辐射后0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5和24小时添加4 mM 3-AB对mdm2 mRNA表达诱导的影响。上部显示了Mdm2mRNA水平。在下部，绘制了每个时间点的条带强度。白色圆圈表示未添加3-AB的对照组，黑色圆圈表示添加4 mM 3-AB。纵轴表示mdm2 mRNA的相对表达水平，横轴表示伽马照射后的时间。数据用标准化方法处理GAPDH.作为内源性控制

讨论

有许多关于DNA损伤后G1抑制机制的报道。DNA损伤后，p53蛋白稳定并在细胞内积累。然后其转录激活能力增强，并作为转录调节因子诱导表达抑制G1 cyclin-Cdk复合物活性的蛋白，导致G1阻滞[11]。C3D2F1 3T3-a细胞γ射线照射后，G1期阻滞被Parp抑制剂3-AB抑制，g2期阻滞加速[20]。鉴于此，我们检测了3-AB对p53依赖的G1阻滞信号通路的影响。已知DNA损伤后，p53蛋白对特定DNA识别序列的结合活性增加。在4 mM处存在3-AB时，我们观察到p53蛋白的基础DNA结合活性略有增加。在8gy γ射线照射后，3-AB的加入进一步提高了p53蛋白的DNA结合活性。因此，poly (adp -核糖)合成反应可能参与了p53的DNA结合步骤。然而,p53蛋白识别共识DNA序列使用只有20个碱基对,而在生理环境中很可能额外的监管区域存在p53目标基因的启动子序列,p53与其他转录因子相互作用,两者都可以影响p53 DNA结合。 Therefore, this DNA binding assay alone cannot conclusively determine the role of Parp1 in the transcriptional activation ability of p53. We examined the influence of 3-AB on the mRNA expression levels ofWaf1/Cip1/p21和Mdm2这两种基因已知在γ射线照射后会被p53诱导。

WAF1/CIP1/p21已被分离出来并作为细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂进行分析。p53识别序列存在于人类的上游区域Waf1/Cip1/p21已经报道了基因[17]，在γ射线照射后在约2小时内观察mRNA表达的诱导[11]。MDM2与P53蛋白形成复合物，称为蛋白质，其负调节P53作为遍突蛋白连接酶的功能[21]。两个p53结合序列在上游存在Mdm2基因[22]，在γ-辐照后P53稳定化后P53蛋白强烈地诱导mRNA的表达[9]。在本研究中，观察到mRNA的瞬时表达的增加Waf1/Cip1/p21和Mdm2基因在8 Gyγ射线照射后2.5小时。在3-AB存在下，两种mRNA表达的瞬时增加减少。因此，Parp1活性的抑制被证明可以对抗这些基因mRNA水平的辐射依赖性增加。在这个早期时间点，两种转录物和更清楚地观察到Mdm2信使rna。这可能是由于p53蛋白作为转录因子在每个基因的调控区域的贡献不同。在相同的实验条件下，即使在照射后12 h，观察到G1阻滞时Waf1/Cip1/p21在3-AB存在的情况下，基因被持续抑制到约50%。通过抑制周期蛋白依赖性激酶，直接参与细胞周期进展的基因的表达水平持续受到抑制，被认为是在3-AB存在下，G1阻滞被抑制的重要因素。相反,Mdm2γ-辐射10小时后mRNA表达在3-AB存在下比其缺失的存在约两倍。卡斯坦等．报道了过度表达的Mdm2伽玛照射后抑制G1骤停[18]。因此，增加Mdm2γ-辐射10小时后的表达水平也可能有助于3-AB治疗后所见的G1抑制抑制。由于MDM2是P53蛋白的阻遏物，Mdm2职能终止G1逮捕[23]，并且没有证据表明其参与禁止逮捕。然而，本研究表明瞬态表达Mdm2可能参与诱导G1逮捕。为了确认这些MRNA表达变化的重要性作为在3-AB存在下作为G1抑制抑制的因素，有必要检查是否表达的变化Waf1/Cip1/p21和Mdm2也发生在蛋白质水平。

从我们对3-AB治疗后p53结合和转录调控的分析中收集到的结果表明，Parp1参与了p53的转录激活和调控Waf1/Cip1/p21和Mdm2涉及DNA损伤后P53依赖的信号通路。在小鼠C3D2F1 3T3-A成纤维细胞中。在人MCF-7细胞和BJ / TERT细胞中，另一个PARP抑制剂1,5-二羟基异喹啉也被抑制Waf1/Cip1/p21和Mdm2γ辐照后mRNA表达，表明PARP1在GAMMA-辐照后G1抑制调节中的保守作用[24]。

3-AB对mRNA表达的改变可能是由于mRNA半衰期的改变或p53对mRNA表达的转录激活能力的改变。这些可能性可以通过测量每个mRNA的半衰期和研究每个基因的转录激活能力的核运行检测。也有可能poly (adp -核糖)合成反应通过直接抑制周期蛋白依赖激酶的活性或下游周期蛋白依赖激酶的靶蛋白的活性而诱导G1阻滞。或者，可能存在一个p53独立的G1阻滞机制，涉及到与p53依赖途径的串扰。因此，有必要考虑Parp1参与这一替代途径的可能性。我们认为Parp1可能作为DNA链断裂的信号迅速发挥作用，准确地传递DNA链断裂的定量信息。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

承认

这项工作部分由MEXT KAKENHI（15K14416）提供支持。

参考

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