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摘要

从七鳃鳗(Lampetra japonica)血清中纯化出一种105 kda的聚合凝集素。纯化方案采用SP-Sepharose离子交换色谱法和Superdex 200上的尺寸排除色谱法。凝集素吸附在SP-Sepharose柱上。结果表明，该凝集素的吸光度峰值为105 kDa。Native-PAGE和SDS-PAGE分别在105 kDa和35 kDa左右显示一条单条带，表明该蛋白以三聚体的形式存在。该蛋白经过Native-PAGE和SDS-PAGE后，从凝胶中切除，并通过MALDI-TOF/TOF作为血清凝集素(gi: 13094239)进一步分析。该凝集素能体外凝集兔红细胞(rrbc)和羊红细胞(srbc)。本研究从七鳃鳗血清中分离出凝集素，为深入研究可变淋巴细胞受体介导的先天免疫分子依赖性免疫防御机制提供依据。

关键字

日本七鳃鳗，凝集素，纯化

介绍

凝集素是一种碳水化合物结合蛋白，近年来在医学和免疫学研究中得到了广泛的研究[1]。它们在动物中发挥着许多不同的生物学功能，从糖蛋白合成到调节细胞粘附和控制血液中蛋白质水平[2]。同时，凝集素通过识别碳水化合物在先天免疫防御中发挥着许多重要作用[3]。它们还能在体外凝集红细胞[4]。七鳃鳗和盲鳗属于颌口目，由灭绝的和现代的无颌脊椎动物组成。它们作为一组原始脊椎动物，不仅具有脊椎动物先天免疫应答系统的几个原始特征，而且表现出具有抗原特异性免疫记忆的适应性免疫反应[5]。虽然在七鳃鳗中不存在T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)，但最近的研究发现，它们具有另一种免疫系统，可以特异性识别和响应外部病原体[6]。这种替代免疫系统可以使用基因组亮氨酸-丰富重复序列(LRR)盒式磁带进行多种抗原受体基因的组合组装，编码大量可变淋巴细胞受体(VLRs)，以抵抗病原体的入侵[7]。在被特定病原体感染后，表达特定VLRB分子的VLRB样淋巴细胞扩增表达，并开始以类似于B细胞分泌免疫球蛋白的方式分泌VLRB[7]。本研究旨在从七鳃鳗(Lampetra japonica)血清中纯化一种凝集素，为进一步研究七鳃鳗免疫防御机制奠定基础。

材料与方法

动物和试剂

七鳃鳗的处理(七鳃鳗粳稻)，所有实验程序均经大连医科大学研究所动物福利与研究伦理委员会批准(许可号:SYXK2004-0029)。12月在黑龙江同江河段(中国黑龙江省同江市)捕获成七鳃鳗。兔红细胞(RRBCs)和羊红细胞(SRBCs)分别取自兔和羊。NaHCO_3.C₂H_3.N、IAA、TFA均购自Sigma公司(Sigma- aldrich, St. Louis, MO)。NaCl，考马斯亮蓝G250, CH_3.COOH和磷酸盐缓冲液均为分析级，来自三工生物科技(上海三工生物科技有限公司)。AKTA avant 25是从GE公司(GE Healthcare)购买的。MALDI-TOF质谱仪购自BRUKER公司(BRUKER Daltonics, Bremen, Germany)。

七鳃鳗血清

采集了100条性别不明的健康成年断尾七鳃鳗的血液。取正常成年七鳃鳗(200-220g)断尾血，置于10ml塑料离心管中，4℃凝集过夜。4℃离心(4000 rpm)分离血清10 min， -20℃保存于1.5 ml离心管中。

SP-Sepharose色谱法

将20毫升七鳃鳗血清透析24小时，分别用6L由10mM NaPB和5mM EDTA (pH 6.5)组成的起始缓冲液进行三次透析。在4℃下离心(12000rpm) 10分钟去除微球，清除的上清液应用于SP-Sepharose柱(4.5×30.0cm) (GE Healthcare)，与起始缓冲液平衡。用1L起始缓冲液洗涤色谱柱，开始线性盐梯度。梯度总体积350ml，极限NaCl浓度600mM。以50 ml/hr的流速收集5 ml馏分。在主流出峰后，将洗脱的具有血凝活性的蛋白部分溶解在150 mM NaCl中。

粒径排除色谱法

在6 L 10mM NaPB、5mM EDTA和150mM NaCl Buffer (pH 6.5)的三种变化作用下，凝集活性蛋白透析24h。透析后的样品(5ml)在Sephadex 200柱(2.0× 70.0cm) (GE Healthcare)上进行尺寸排除层析，用用于样品透析的相同缓冲液平衡。以20 ml/hr的流速洗脱，收集1ml馏分。凝集素的吸光度峰值为105 kDa。最后，收集蛋白质组分，透析，冻干并在-20°C保存以备将来分析。

蛋白质浓度测定

以牛血清白蛋白为标准，采用布拉德福德法测定样品的蛋白质浓度。

质谱分析

用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native - page)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- page)对纯化的凝集素进行电泳。以牛血清中的白蛋白66 kDa(单体)和132 kDa(二聚体)作为Native-PAGE凝胶分子量标准(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。采用12% (w/v)凝胶进行SDS-PAGE。以磷酸化酶b (97.2 kDa)、白蛋白(66.4 kDa)、卵白蛋白(44.3 kDa)、碳酸酐酶(29.0 kDa)和胰蛋白酶抑制剂(20.1 kDa)作为SDS-PAGE的分子量标准(TaKaRa Biotechnology, Dalian, China)。这些蛋白带用考马斯亮蓝R-250可视化。从凝胶基质中切除特异性蛋白带，进行凝胶内胰消化。MALDI-TOF质谱在正离子模式下操作，采集周期如下:在轨道分析仪上以r60000分辨率记录全扫描(m/z500)，然后在LTQ分析仪上对20个最强烈的肽离子进行MS/MS分析。采用MS- mascot检索算法对NCBI数据库中所有的七鳃鳗序列进行MS原始数据检索。搜索条件为:Met氧化、Cys氨基甲基化、Trypsin、0.5Da Peptide mass to tolerance、1 Max missing cleavage Sequence coverage>10%。

红细胞凝集试验

在血凝活性测定中，将样品溶液在96孔平板(100 ul)中连续稀释两倍，分别与100 ul 2%的rrbc和srbc悬浮液在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2)中室温混合1小时。孵育后，在体外光镜下观察红细胞凝集情况。所有统计分析均采用SAS专有软件8.02版和学生双样本t检验进行。

结果与讨论

采用SP-Sepharose凝胶过滤柱层析法从血清中分离出七鳃鳗凝集素。柱中加入20 ml七鳃鳗血清，用600mM NaCl在50 mM磷酸盐缓冲液中洗脱，pH为6.5。收集5毫升馏分，在280 nm处检测蛋白质(图1a)。分数25的吸光度峰为495。只有25号有血凝活性。透析后的样品(#25)在Sephadex 200柱上进行粒径排除层析。它被分解成一个主峰和两个分钟峰(图1b)。仅在含有纯化凝集素的26号中发现了血凝活性。在Superdex 200色谱柱上，#26的洗脱量约为26 ml。26 ml的洗脱体积相当于大约105 kDa的分子质量。 The molecular weight of native Lectin was estimated to be 105 kDa, suggesting that this protein exists as a trimer (Figure 1b). Native PAGE analysis was also carried out. The result also supported the idea that lectin exists as a trimer because the molecular weight of native lectin was calculated as 105 kDa (Figure 1c). A single protein band corresponding to lamprey serum lectin was also found in the SDS-PAGE gel (Figure 1c). Its molecular mass was slightly larger than 29.0 kDa. Based on its migration distance, it can be deduced that its molecular mass is around 35 kDa from the molecular mass calibration graph. On MS/MS analysis, the protein was identified with significant protein scores (p>0.05) from Mascot searches of peptide mass fingerprints (Figure 1d). The peptide with m/z 1671 corresponds to the tryptic fragment of the complete sequence (R.WSSQLGSNP.A) (Figure 1d), which identified the protein is serum lectin (gi: 13094239). To examine hemagglutinating activities, we observed the ability of the lamprey serum lectin to agglutinate RRBCs and SRBCs. In the group of RRBCs and SRBCs, the agglutinphore group respectively could be observed in the dilution of 12.5 ug and 6.25 ug (Figure 1e). The ability of the lamprey serum lectin to agglutinate SRBCs was slightly stronger than RRBCs. This result suggests that the hemagglutinating activities of RRBCs and SRBCs were depended on the dose of lectin. Meanwhile, lamprey serum lection had a protein concentration of 1.45 mg protein/ml of serum by BCA assay.

图1:七鳃鳗血清粗提物对SP-Sepharose的离子交换色谱分析。流速= 50 ml/hr。血凝活性居第25位。虚线表示凝集素。

图1 b:Superdex 200上分数为25的凝胶过滤剖面。流速= 20 ml/hr。血凝活性居第26位。虚线表示凝集素。

图3。这个数字说明了病人对现行卫生部同意表格和修改后的同意表格之间的同意程序的满意程度的差异。

图1 c:凝胶分析和肽质量指纹图谱。(a) native-PAGE和SDS-PAGE。左车道:Native-PAGE。右车道:SDS-PAGE。(b)含有m/z 1671的肽段对应于完整序列的色氨酸片段(R.WSSQLGSNP.A)，鉴定该蛋白为血清凝集素(gi: 13094239)。

图1 d:七鳃鳗凝集素对红细胞的凝集试验。凝集试验抗原为rrbc和srbc。数据为平均值±SE，误差条表示(s.e.m)， n =3。

在本研究中，我们从七鳃鳗中纯化了一种凝集素金银花是无颌脊椎动物的代表。在大小排斥层析中，凝集素被洗脱为分子量约为105 kDa的温和峰，而SDS-PAGE在还原条件下显示为35 kDa的蛋白带。同时，native - page分析表明，天然凝集素的分子量为105 kDa。MALDI-TOF/TOF分析鉴定该蛋白为血清凝集素(gi: 13094239)。这些数据表明，凝集素是一个105 kda的三聚蛋白，具有血凝活性。以七鳃鳗和盲鳗为代表的Agnathans被认为是目前最古老的具有适应性和先天免疫防御的脊椎动物。可变淋巴受体是无颌脊椎动物适应性免疫反应的重要组成部分[7]。在有颌脊椎动物中，凝集素通过识别外源抗原在先天免疫防御中发挥着许多重要作用[4]。在这里，我们发现凝集素在七鳃鳗中也具有血凝活性。参与VLRs的先天免疫分子是否介导七鳃鳗的适应性免疫反应尚不清楚。 In the future research, we are going to isolate and purify VLRs in lamprey serum, as well as to further elucidate the VLRs mediate innate immune molecules dependent immune defence in lamprey.

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利益冲突

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致谢

国家重点基础研究计划项目(973计划，2013CB835304)、国家自然科学基金项目(31170353,31271323)、辽宁省教育厅科研基金项目(L2011187)和辽宁省自然科学基金资助辽宁师范大学(LS2015L010)。

参考文献

1. Ogawa T, Watanabe M, Naganuma T, Muramoto K(2011)来自海洋资源的多种碳水化合物结合凝集素。J氨基酸: 838914。(Crossref)
2. Rutishauser U, Sachs L(1975)不同凝集素诱导的细胞间结合。J细胞生物学65: 247 - 257。(Crossref)
3. 王晓明，王晓明，王晓明，等(2008)七鳃鳗血浆中甘露糖结合c型凝集素的分离及与沙门氏菌气单胞菌的结合。免疫病理学126: 407 - 412。［Crossref］
4. 郭晓楠，金晓康，李生，于青青，吴明明，等。(2013)中华绒螯蟹c型凝集素的一种新型抗菌模式识别受体。鱼贝类免疫35: 1554 - 1565。［Crossref］
5. 韩勇，刘霞，于涛，石波，肖锐，等。(2014)七鳃鳗B细胞连接蛋白新成员的鉴定。生物化学学报(上海)46: 526 - 530。［Crossref］
6. 韩莹，庞莹，于涛，肖锐，石斌等。(2014)七鳃鳗血清可杀伤HeLa和NB4肿瘤细胞。生物化学学报(上海)46: 623 - 626。(Crossref)
7. 郭鹏，平野明，Herrin BR，李军，余春等。(2009)七鳃鳗适应性免疫系统的双重性质。自然459: 796 - 801。(Crossref)