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收稿日期:2020年2月09日
录用日期:2020年2月22日
出版日期:2020年2月28日
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©2020 Pathare G.这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可协议发布,该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
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pathway G (2020) α-Klotho与过氧化氢酶在原发性高血压中的表达整合分子医学7 DOI: 10.15761/ im .1000395
HN爵士医学研究会,HN信实基金会医院和研究中心,印度孟买l.t.路法院,400002
HN爵士医学研究会,HN信实基金会医院和研究中心,印度孟买l.t.路法院,400002
信实基金会医院和研究中心,印度孟买Raja Ram Mohan Roy路,400004
信实基金会医院和研究中心,印度孟买Raja Ram Mohan Roy路,400004
HN爵士医学研究会,HN信实基金会医院和研究中心,印度孟买l.t.路法院,400002
DOI: 10.15761 / IMM.1000395
α-Klotho是一种抗衰老基因,在细胞水平上作为一种新的氧化应激抑制因子出现。α-Klotho通过抑制IGF-1/Insulin-FOXO (Forkhead box-O转录因子)依赖性的抗氧化酶失活来抑制氧化应激。本研究旨在测定印度原发性高血压患者外周血单个核细胞(PBMCs) α-Klotho和过氧化氢酶基因表达及过氧化氢酶活性,并与血压正常的健康对照组进行比较。研究招募了48名年龄48岁的高血压患者和bmi匹配的对照组。采用实时荧光定量PCR法检测基因表达。采用酶联免疫吸附法检测PBMCs中过氧化氢酶活性和血清中可溶性α-Klotho水平。与对照组相比,患者α-Klotho和FOXO1基因表达量显著降低(p<0.001和p=0.002)。过氧化氢酶在高血压患者中的表达也较低,但无统计学意义。α-Klotho基因ΔCt-based表达与过氧化氢酶呈正相关(p<0.001),与对照组呈正相关(p=0.008)。高血压患者FOXO1基因表达与α-Klotho基因表达呈正相关(p=0.006),与过氧化氢酶基因表达呈正相关(p=0.001)。 Catalase activity in patients were significantly low (p<0.001) as compared to controls and positively correlated with soluble α-Klotho levels (rs=0.32, p=0.027), which were also 30.2% lower (p<0.001) in the patient group. Present study demonstrates low soluble levels and gene expression of anti-aging protein α-Klotho in hypertensive patients. α-Klotho may influence Catalase expression in essential hypertension through its effect on FOXO1 expression.
α-Klotho,抗衰老基因,心血管疾病,基因表达,酶活性
原发性高血压可能是研究最多但了解最少的复杂人类疾病[1]。目前,它被认为是一种由若干遗传和环境因素共同作用引起的多因素疾病。维持正常血压(BP)涉及许多生理机制,其中任何一种机制的异常都可能在原发性高血压的发展中起一定作用。最近的研究强调动脉老化是高血压发展的危险因素[3,4]。α-Klotho是一种由Kuro-o鉴定的抗衰老基因et al。被发现可以改善衰老表型,延长寿命。α-Klotho缺陷转基因小鼠表现出一些类似人类衰老的表型,包括动脉粥样硬化、动脉壁和各种软组织的异位钙化、肺气肿、心血管疾病(CVD)和加速死亡[5]。随后的动物模型研究表明,α-Klotho缺乏导致盐敏性高血压[6]。因此,α-Klotho似乎是衰老和包括高血压在内的心血管疾病之间的联系。
α-Klotho基因编码一个单传跨膜蛋白——由细胞内、跨膜和细胞外结构域组成——和一个循环α-Klotho蛋白。这种循环的α-Klotho作为一种肽激素,影响各种信号通路,包括p53/p21, cAMP,蛋白激酶C, Wnt通路以及胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)信号级联[7]。α-Klotho的抗衰老作用部分归因于通过抑制胰岛素/IGF-1信号通路在细胞水平上增加对氧化应激的抵抗力:延长寿命的进化保守机制[7]。此外,胰岛素/IGF-1信号通路在高血压中的作用已被充分证实,高血压受试者血清IGF-1水平升高[8,9]。氧化应激是原发性高血压发生发展的基本机制之一。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶构成了对抗ROS的第一道防线。这些酶的活性受损与ROS和其他自由基[10]不受控制的产生有关。α-Klotho通过抑制IGF-1/Insulin-FOXO (Forkhead box-O转录因子)依赖性的这些抗氧化酶失活来抑制ROS和氧化应激[11,12]。
α-Klotho启动信号级联,首先与细胞膜上尚未确定的α-Klotho受体结合,抑制胰岛素/IGF-1受体[13]的酪氨酸激酶活性,随后抑制胰岛素受体底物。FOXOs是调节机体衰老的胰岛素样信号的下游靶点[14-17]。FOXO蛋白介导胰岛素/IGF-1在哺乳动物[18]中多种途径的关键功能的抑制作用,包括细胞代谢、增殖、分化、氧化应激、细胞存活和衰老、自噬和衰老。因此,α-Klotho通过抑制胰岛素/IGF-1通路调节FOXOs。最近一项细胞系研究表明,α-Klotho抑制PI3K/ akt介导的FOXO3a磷酸化,进而增强FOXO3a与Mn-SOD启动子的结合,从而导致α-Klotho增加线粒体[19]中Mn-SOD mRNA和蛋白的表达。
山本et al。发现α-Klotho蛋白在HeLa细胞和小鼠模型[11]中对FOXO1蛋白的作用比FOXO3a或FOXO4蛋白更明显。此外,文卡特斯et al。报道了过氧化氢酶基因[20]的启动子区存在FOXO1 DNA结合元件。因此,本研究旨在分析高血压患者PBMCs中α-Klotho和过氧化氢酶的表达及过氧化氢酶活性,并与正常对照进行比较。同时分析两组小鼠α-Klotho的可溶性水平。f2 -异前列腺素在人体血浆和尿液中相对稳定且普遍存在,已被证明是研究脂质过氧化和氧化应激最敏感、最可靠的生物标志物之一在活的有机体内(21、22)。因此,我们测量了所有受试者血清中8-iso-前列腺素F2α (8-iso-PGF 2α)的水平,以量化两个研究组的氧化应激。
48例诊断为原发性高血压(收缩压/舒张压bb0 140/90 mmHg)和48岁体重指数(BMI)匹配的健康正常血压(收缩压/舒张压<120/80 mmHg)对照患者纳入研究。根据第七届联合全国委员会(JNC7)[23]报告指南招募高血压患者。如果收缩压/舒张压≥160/100,患者立即转介咨询师;如果收缩压/舒张压<160/100,患者在入组前经过6-8天的监测。确诊原发性高血压后,经书面知情同意纳入高血压组。所有受试者均获得人口学状况、临床病史、家族史和用药的详细信息。他们没有表现出临床症状或任何其他器质性疾病的病史,也没有服用任何药物。该研究方案得到了机构伦理委员会的批准,该委员会遵循印度医学研究理事会(ICMR)制定的针对人体参与者的生物医学研究伦理准则所规定的伦理标准。
空腹12小时静脉血样本在平原和K2-EDTA抽真空器在登记时(对于确定血压高的受试者,该样本在开始高血压药物治疗前收集)。血清样本用于常规生化检查,如血糖、脂质、肾和肝谱测试。将检测结果超出正常范围的健康人排除为对照组。剩下的血清被混叠并储存在-80°C,待进一步使用。
采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法(德国汉堡免疫生物实验室有限公司)检测患者和对照组血清和尿液样本中的8-iso-PGF2α水平。用该方法测定游离和酯化的总8-iso-PGF2α。在测定之前,根据制造商的说明水解脂蛋白或磷脂偶联的8-iso-PGF2α。
根据制造商的说明(免疫生物实验室有限公司,德国汉堡),用ELISA法检测血清样品中的可溶性α-Klotho水平。
用商用ELISA法测定PBMC裂解液中过氧化氢酶的活性。从K中分离得到pbmc2- edta抗凝血采用Ficoll- histopque®-1077 (Sigma-Aldrich)梯度分离法。PBMCs在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(1 mM EDTA)中裂解,细胞裂解液在-80°C保存,直到进一步分析。使用Oxiselect活性测定试剂盒(STA-341, Cell Biolabs, Inc, USA)按照制造商说明测定过氧化氢酶活性。
从K中分离得到pbmc2- edta抗凝血采用Ficoll- histopque®-1077 (Sigma-Aldrich)梯度分离法。用NucleoSpin RNA分离试剂盒(machery - nagel, Duren, Germany)从PBMCs中提取RNA。用琼脂糖凝胶电泳和Qubit 2.0荧光计分别检测RNA的质量和数量。使用PrimeScript 1将每个样本的1微克RNA反转录为cDNA圣链cDNA合成试剂盒(Takara Bio USA, Inc.)按照制造商说明进行。
采用StepOnePlus™实时PCR系统(应用生物系统)中的实时聚合酶链反应(qRT-PCR)对α-Klotho (Hs00183100_m1)、FOXO1 (Hs00231106_m1)和过氧化氢酶(Hs00156308_m1)的TaqMan基因表达进行定量评价。内控基因为管家基因GAPDH (Hs03929097_g1)。相对基因表达量根据比较Ct法计算(2-ΔΔCt)由Livak和Schmittgen[24]描述。所有实验都按照制造商的协议重复进行。
结果以参数变量的频率、百分比和平均值±标准差(SD)和非参数变量的四分位(25 /75)区间的中位数表示。分别采用学生非配对t检验和Mann-Whitney U检验来确定两个研究组对参数变量和非参数变量的差异显著性。相关性评价采用Spearman秩相关检验。对于所有试验,p值<0.05被认为有统计学意义。使用统计软件SPSS(21.0版本,芝加哥,伊利诺伊州)进行分析。在表达研究中,根据患者的年龄、BMI和性别进行分组,并在每次使用Taqman分析进行基因表达分析时与相应匹配的健康对照组进行比较。因此,两组之间的所有相关性合计为48例患者和相应的17例对照组。
患者和对照组的基线人口学特征如表1所示。如表2所示,两组患者与对照组的脂质谱比较无明显差异。
表1。患者组与对照组的人口学参数比较
参数 |
控制(N = 48) |
病人(N = 48) |
年龄(年) |
45.8±6.7 |
48.8±5.7 |
男性/女性 |
43/5 |
45/3 |
BMI(公斤/米2) |
26.3±3.9 |
27.1±5.77 |
SBP(毫米汞柱) |
124.6±7.7 |
164.3±14.8 * * * |
菲律宾(毫米汞柱) |
79.58±6.0 |
102.08±6.78 * * * |
*数值表示为平均值±标准差。
†***p与各对照组比较<0.001。
表2。患者与对照组的脂质谱比较
参数 |
控制(N = 48) |
病人(N = 48) |
TC (mg / dL) |
169.6±34.4 |
172.6±31.6 |
高密度脂蛋白胆固醇(mg / dL) |
38.8±11.6 |
43.0±11.6 |
TC / hdl - c |
4.6±1.3 |
4.2±1.0 |
甘油三酸酯(mg / dL) |
110.9±43.7 |
126.5±69.7 |
VLDL-C (mg / dL) |
22.2±8.7 |
25.3±13.9 |
低密度(mg / dL) |
108.6±30.2 |
104.3±29.0 |
低密度脂蛋白胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇 |
2.9±1.1 |
2.6±0.9 |
*数值表示为平均值±标准差。
†TC:总胆固醇;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;VLDL-C:极低密度脂蛋白胆固醇;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇
与对照组相比,高血压患者血清中8-iso-PGF2α水平显著升高(11.3倍/ 91.1%,p<0.001)(图1)。在对照组中,8-iso-PGF2α水平与可溶性α-Klotho水平(rs= -0.413, p=0.004)和过氧化氢酶活性(rs= -0.344, p=0.017)呈负相关。这种氧化应激标志物与脂质参数之间没有观察到相关性。血清水平的分析内和分析间变异系数(CV)分别为1.6%和1.4%。尿水平的检测内和检测间CV分别为1.1%和2.1%。
图1所示。高血压患者和对照组血清8-异位前列腺素F2α水平的变化
值表示为四分位(25 /75)范围的中位数。
与对照组相比,高血压患者血清中可溶性α-Klotho水平显著降低(30.2%,p=0.001)(图2)。组内和组间CV分别为0.7%和3.0%。
图2。高血压患者和对照组可溶性α-克洛托水平的变化
值表示为四分位(25 /75)范围的中位数。
高血压患者过氧化氢酶活性明显低于对照组(80.3%,p<0.001)(图3),且与可溶性α-Klotho水平呈正相关(rs=0.32, p=0.027)。过氧化氢酶活性测定的CV谱内和谱间系数分别为4.6%和10.1%。
图3。高血压患者和对照组PBMCs中过氧化氢酶活性的变化
值表示为四分位(25 /75)范围的中位数。
α-Klotho、FOXO1和过氧化氢酶在高血压患者中的相对基因表达量分别比对照组低3.02倍、1.55倍和1.23倍(图4)。所研究基因的ΔCt值见表3。根据ΔCt值,高血压患者α-Klotho和FOXO1基因表达明显偏低(p分别<0.001和p=0.002)。过氧化氢酶的表达也低于对照组,但没有达到统计学意义。α-Klotho和过氧化氢酶ΔCt-based表达在高血压组(rs=0.753, p<0.001)和对照组(rs=0.618, p=0.008)之间呈正相关。FOXO1基因表达与患者组α-Klotho基因表达(rs=0.388, p=0.006)、过氧化氢酶基因表达(rs=0.471, p=0.001)呈正相关。
图4。与正常对照相比,高血压患者中(a) Klotho, (b) FOXO1和(c)过氧化氢酶的相对基因表达水平
显示了患者相对于对照组的基因表达。值表示为四分位(25 /75)范围的中位数。
基因 |
ΔCt值 中位数(25th/ 75th百分位) |
显著性水平 (p值) |
|
控制(N = 17) |
病人(N = 48) |
||
克罗索 |
14.938 (14.278/16.244) |
16.936 (15.943/18.556) |
0.001 |
FOXO-1 |
5.945 (5.202/6.806) |
7.039 (6.018/7.623) |
0.002 |
过氧化氢酶 |
4.760 (3.755/5.481) |
5.305 (4.630/5.999) |
0.076 |
本研究观察到过氧化氢酶与α-Klotho基因表达在高血压患者和正常对照中的直接相关。此外,我们还报告了与对照组相比,α-Klotho在高血压患者中的表达明显较低。与对照组相比,高血压患者的PBMCs中过氧化氢酶活性和血清中可溶性α-Klotho水平均显著降低,且在患者组中这两个参数之间观察到显著的正相关。
强有力的证据表明,氧化应激,由于活性氧的增加和/或抗氧化储备的减少,是高血压的发展和持续的一个重要因素。之前在人类和动物模型中的研究已经确立了高血压患者氧化应激增加的状态[25-27]。本研究还发现,高血压患者中氧化应激的可靠标志8-iso-PGF2α水平升高,同时过氧化氢酶活性显著降低。
过氧化氢酶在高血压中的作用已有研究,其过表达已被报道可在动物模型[27]中预防高血压。戈麦斯et al。显示自发性高血压大鼠(SHR)细胞过氧化氢酶活性明显低于对照Wistar京都(WKY)大鼠[28]细胞。在之前的一项研究中,同一小组也报道了SHR细胞[29]中过氧化氢酶蛋白表达水平的下调。因此,过氧化氢酶在SHR细胞中的低活性和低表达可能增加氧化诱导细胞死亡的脆弱性[28]。与这一发现平行的是,詹et al。证明对SHRs提供抗氧化治疗会导致其皮层和髓质[30]中过氧化氢酶的酶活性显著增加。Schrineret al。报道过氧化氢酶在转基因小鼠中过表达有助于清除线粒体中的ROS,并延长其寿命[31]。
同样,贺东et al。高血压患者PBMCs中过氧化氢酶活性最低[32]。其原因可能是过氧化氢酶自身底物H水平的增加抑制了过氧化氢酶的活性2O2, Venkatesan证明了这一点et al。[20]和Sigfridet al。[33],可以解释本研究中观察到的高血压患者过氧化氢酶活性较低的原因。此外,在本研究的对照组中,总体过氧化氢酶活性与8-iso-PGF2α血清水平呈负相关。这与氧化应激导致过氧化氢酶失活的文献相一致。
另外,过氧化氢酶活性较低可能是其基因表达较低的结果,这也在本研究的高血压受试者中观察到,与对照组相比。乌丁也报道了类似的发现et al。结果表明,高血压模型小鼠主动脉中过氧化氢酶基因表达下调,活性明显降低。因此,过氧化氢酶活性下调已被观察到在高血压。
许多研究已经探讨了α-Klotho在抗氧化系统中的作用,并表明其抗衰老特性是其对抗氧化应激能力的结果。在本研究中,与对照组相比,在高血压患者中观察到较低的可溶性α-Klotho水平,这与之前的几篇报道一致。在中国人群中,Su和Yang将收缩期高血压的发生部分归因于血清α-Klotho水平[35]的降低。在西班牙、意大利和日本的队列中,α-Klotho循环水平降低与冠状动脉疾病[36]、CVD[37]的发生和严重程度相关,并作为慢性肾脏疾病[38]患者动脉硬化的独立标记物。本研究表明,α-Klotho水平在原发性高血压患者中也存在耗竭,这可能是该病的一个重要特征。
在小鼠模型中,Klotho已被证实对维持正常血压至关重要,与对照WKY大鼠相比,在SHRs中Klotho基因和蛋白表达显著降低[39,6]。夏教授说,与目前的研究相似,在人类中也是如此et al。也发现,与健康对照相比,动脉粥样硬化患者PBMCs中Klotho的基因表达较低[40],而Martín-Núñezet al。据报道,在动脉粥样硬化疾病[41]中,Klotho基因的血管表达较低。旷et al。据报道,在小鼠中观察到与年龄相关的Klotho表达减少,通过增强FOXO磷酸化从而促进核排出[42],从而增加氧化应激。此外,也有IGF1抑制FOXO-1表达的报道[43,44]。尽管已有研究报道FOXO3a[45]可调节过氧化氢酶的表达,但也有研究发现FOXO-1可调节过氧化氢酶的表达[46,47]。阿瓦德et al。AMPK是已知的调节FOXO1的激酶之一,其激活可导致FOXO1(总蛋白和核蛋白)以及过氧化氢酶mRNA和蛋白含量的增加。此外,AMPK抑制FOXO1和过氧化氢酶,但不抑制FOXO3a[47]。过氧化氢酶启动子区域[20]中FOXO1 DNA结合元件的存在进一步证明了FOXO1的重要性。文卡特斯et al。过氧化氢(H2O2)通过PI3K/ akt依赖的磷酸化负调控FOXO1,最终抑制过氧化氢酶[20]的表达。Yamamoto已经提出了α-Klotho和FOXO1通过胰岛素/IGF-1/PI3K/Akt通路激活之间的联系et al。[11]。我们进一步假设α-Klotho可能以类似的方式通过FOXO1调节过氧化氢酶的表达。本研究发现高血压患者PBMCs中Klotho、FOXO1和过氧化氢酶基因表达较低,过氧化氢酶活性较低。此外,α-Klotho和过氧化氢酶在高血压患者和对照组的表达之间的直接相关性也支持这一理论。然而,需要在细胞水平上研究确切的机制来验证这一假设。
由于年龄和肥胖是已知的高血压的危险因素,我们试图通过招募年龄、性别和BMI相匹配的高血压患者来减弱它们对研究结果的影响。本研究的另一个优点是,我们只招募了新诊断的原发性高血压患者,而没有服用抗高血压药或任何其他药物,我们试图避免药物对数据分析的影响。然而,大多数患者由男性组成。对男性和女性分别进行的分析(数据未显示)与研究中分析的总患者人群的分析一致。
综上所述,本研究表明PBMCs中氧化应激增加,过氧化氢酶抗氧化能力降低,可溶性α-Klotho水平降低,α-Klotho表达降低与原发性高血压相关。此外,α-Klotho与过氧化氢酶的表达和FOXO1转录因子的低表达也有直接的相关性。根据本研究观察到的α-Klotho与过氧化氢酶之间的这种关系,以及文献记载的α-Klotho在胰岛素/ IGF-1信号通路中的调节作用,α-Klotho似乎对过氧化氢酶的基因表达有影响。因此,α-Klotho在抗氧化应激相关疾病(如高血压)中的应用具有重要意义,值得进一步探索。
作者要感谢孟买HN爵士医院和研究中心允许招募患者参与研究。这项工作得到了印度孟买Sir HN医学研究协会的财政支持。
作者没有潜在的利益冲突,经济或其他方面。
研究文章
收稿日期:2020年2月09日
录用日期:2020年2月22日
出版日期:2020年2月28日
©2020 Pathare G.这是一篇开放获取的文章,根据创作共用署名许可协议发布,该协议允许在任何媒体上不受限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
pathway G (2020) α-Klotho与过氧化氢酶在原发性高血压中的表达整合分子医学7 DOI: 10.15761/ im .1000395
图1所示。高血压患者和对照组血清8-异位前列腺素F2α水平的变化
值表示为四分位(25 /75)范围的中位数。
图2。高血压患者和对照组可溶性α-克洛托水平的变化
值表示为四分位(25 /75)范围的中位数。
图3。高血压患者和对照组PBMCs中过氧化氢酶活性的变化
值表示为四分位(25 /75)范围的中位数。
图4。与正常对照相比,高血压患者中(a) Klotho, (b) FOXO1和(c)过氧化氢酶的相对基因表达水平
显示了患者相对于对照组的基因表达。值表示为四分位(25 /75)范围的中位数。
表1。患者组与对照组的人口学参数比较
参数 |
控制(N = 48) |
病人(N = 48) |
年龄(年) |
45.8±6.7 |
48.8±5.7 |
男性/女性 |
43/5 |
45/3 |
BMI(公斤/米2) |
26.3±3.9 |
27.1±5.77 |
SBP(毫米汞柱) |
124.6±7.7 |
164.3±14.8 * * * |
菲律宾(毫米汞柱) |
79.58±6.0 |
102.08±6.78 * * * |
*数值表示为平均值±标准差。
†***p与各对照组比较<0.001。
表2。患者与对照组的脂质谱比较
参数 |
控制(N = 48) |
病人(N = 48) |
TC (mg / dL) |
169.6±34.4 |
172.6±31.6 |
高密度脂蛋白胆固醇(mg / dL) |
38.8±11.6 |
43.0±11.6 |
TC / hdl - c |
4.6±1.3 |
4.2±1.0 |
甘油三酸酯(mg / dL) |
110.9±43.7 |
126.5±69.7 |
VLDL-C (mg / dL) |
22.2±8.7 |
25.3±13.9 |
低密度(mg / dL) |
108.6±30.2 |
104.3±29.0 |
低密度脂蛋白胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇 |
2.9±1.1 |
2.6±0.9 |
*数值表示为平均值±标准差。
†TC:总胆固醇;HDL-C:高密度脂蛋白胆固醇;VLDL-C:极低密度脂蛋白胆固醇;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇
基因 |
ΔCt值 中位数(25th/ 75th百分位) |
显著性水平 (p值) |
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控制(N = 17) |
病人(N = 48) |
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克罗索 |
14.938 (14.278/16.244) |
16.936 (15.943/18.556) |
0.001 |
FOXO-1 |
5.945 (5.202/6.806) |
7.039 (6.018/7.623) |
0.002 |
过氧化氢酶 |
4.760 (3.755/5.481) |
5.305 (4.630/5.999) |
0.076 |