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摘要

目的:本研究旨在探讨出生后给予尼古丁对幼龄Wistar大鼠胰腺的影响。

方法:实验共选用30只雌性大鼠;他们分为三组作为对照组和接收0.1毫升生理盐水产后生活的前14天,B和C组为治疗组和接收0.05毫升的尼古丁在第一次分别为7和14天产后的生活。对大鼠在妊娠前和妊娠期间进行称重;在第1、4、7、10和14天哺乳期间，在第15天祭祀之前，对幼崽进行称重。组织处理采用苏木精-伊红和周期性-酸性希夫染色法。

结果:与对照组相比，实验组幼鼠的体重显著下降。胰腺组织学观察显示，与对照组相比，治疗组胰腺形态发生扭曲和退行性改变，血清乳酸脱氢酶(LDH)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)水平升高。

结论:暴露于哺乳期尼古丁对幼龄Wistar大鼠胰腺的结构和功能有不利影响。

关键字

哺乳期尼古丁，胰腺，形态学，G-6-PDH，LDH

介绍

发育的关键期是生物体生命早期阶段的一个阶段，在此期间，它对某些环境刺激表现出高度的敏感性，并因此时的经历而以特定的方式发育[1]。环境化学物质在代谢紊乱的发展中起着重要作用，尤其是在生命早期接触时[2]。母乳喂养被认为是提供理想膳食以满足新生儿营养需求和促进最佳生长发育的最合适方式[3]母亲吸烟会使发育中的胎儿和母乳喂养的婴儿受到尼古丁的不良影响，因为他们可能同时接触二手烟和通过母乳传播的尼古丁[3]。哺乳动物尼古丁暴露是胰腺病理状况发展的独立风险因素[4]。研究表明，母乳中的尼古丁含量是母体血浆中尼古丁含量的2.9倍[5]。可替宁是吸烟母亲母乳喂养的婴儿尿液中尼古丁的主要代谢物，其含量平均比母亲吸烟的奶瓶喂养儿童高出10倍[3]。吸烟母亲母乳喂养的婴儿的尿可替宁水平与成年吸烟者相似[6]。

由于哺乳动物暴露于尼古丁的程度，它们面临着它对胰腺、血糖、葡萄糖代谢、胰岛素、乳酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶[7]的各种影响的风险;因为这种暴露发生了子宫内或分娩后的哺乳期。尼古丁在胰腺病理生理的诱导中起着重要作用。因此，本研究的目的是缩小这些作用，并评估出生后尼古丁对幼年Wistar大鼠胰腺的影响。

材料和方法

实验动物

本实验选用30只雌性Wistar大鼠。它们被关在伊洛林大学健康科学学院动物屋的铁丝网笼子里，处于室温。实验期间为大鼠提供良好的通风、饲料和水。按[8]进行阴道涂片，测定每只雌性Wistar大鼠的发情期。这些大鼠在发情期隔夜暴露于雄性大鼠中。在第二天清晨进行的阴道涂片中发现黏液堵塞和精子细胞，证实了交配和可能怀孕。

实验动物的治疗

将怀孕的大鼠分为A、B和c三组，95%的尼古丁取自英国Poole Drug House (BDH) Chemical Ltd .。大鼠耐受最大剂量为13.76 mg/kg。丢弃垃圾后，母鼠在泌乳时腹腔注射尼古丁(0.1 ml对照剂13.76 mg/kg)。A组(对照组)于产后1 ~ 14日注射0.1 ml生理盐水，B组和C组分别于产后1 ~ 7日和产后1 ~ 14日注射尼古丁。

终止管理

动物的治疗在出生后15天终止，当用于组织学研究的幼犬使用20 mg/kg的氯胺酮肌肉注射安乐死。胰腺切除，用10%福尔马林固定。通过苏木精-伊红染色和周期性酸希夫(PAS)反应石蜡包埋切片进行胰腺细胞结构的组织学证实。其余用于酶学研究的大鼠采用颈椎脱位法处死(以消除氯胺酮引起的生化氧化还原变化的干扰)。采集胰腺，0.25 M蔗糖溶液均质，离心。然后用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定匀浆胰腺中乳酸脱氢酶(LDH)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)的水平。

酶学研究用比色法

用分光光度法测定大鼠胰腺组织中G-6-PDH和LDH的活性。G-6-PDH和LDH试剂盒购自美国Danvers Cell Signaling Technologies公司。同样重量的胰腺组织(0.085 g)在0.25 M蔗糖中均质。将组织匀浆在5000 rpm的离心机中离心15分钟，得到含有细胞器碎片和突触体的上清液。将上清吸入置于冰上的标记玻璃试管中。G-6-PDH和LDH活性根据试剂盒包中的制造商说明进行测定。

数据分析

所有数据使用GraphPad Prism®软件(Version 6)进行分析。G-6-PDH和LDH结果采用Tukey的多重比较检验进行方差分析。意义被设定为p<0.05。结果用柱状图表示，分别用误差柱表示均值和标准误差。使用Microsoft Excel应用程序将动物的体重绘制成条形图。

结果

形态学观察

与对照组相比，治疗组的出生体重较低，但在第1、4、7、10和14天，各组体重均逐渐增加(图1)。各处理组体重均高于对照组，尼古丁处理14天的C组体重高于尼古丁处理7天的B组;在PD7上也观察到同样的结果。到PD10时，对照组比治疗组体重增加更多，这一趋势继续发展到PD14。在PD14上，B组动物的体重略高于C组。

图1. 出生后第1天、第4天、第7天、第10天和第14天幼崽的平均体重。”A'用生理盐水处理，B和C分别在出生后的前7天和14天暴露于哺乳期尼古丁。图表显示了体重随出生后年龄的变化。

生物化学分析

在出生后第15天，使用幼崽胰腺匀浆测定乳酸脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性。图2中的结果表明，与对照组相比，治疗组胰腺中的LDH水平显著增加(p < 0.05),服用尼古丁时间较长的一组(14天)比只服用尼古丁7天的一组老鼠的活动水平更高。两组比较无显著性差异。

图2．图示大鼠PD 15时胰腺乳酸脱氢酶(LDH)的活性。“A”用生理盐水处理，而“B”和“C”分别在出生后的前7天和14天暴露于哺乳期尼古丁，与对照组相比，两组处理后的LDH活性均显著提高(p< 0.05)。

与对照组相比，暴露于尼古丁的两组中的G-6-PDH活性也有所增加，治疗14天的组的活性水平更高(p > 0.05).同样，暴露于哺乳期尼古丁14天的大鼠与对照组的G-6-PDH活性差异具有统计学意义(p<0.05)（图3）。

图3．图中显示了大鼠在PD15时胰腺中葡萄糖-6-磷酸酶的活性。“A”被生理盐水处理，而“B”和“C”分别在出生后的前7天和14天暴露于哺乳期尼古丁，与对照组相比，C组的活动显著增加(p< 0.05)。

组织学观察

对照组动物的组织学切片(图4A)显示以离散单元排列的交替细胞和纤维层，结构染色良好，结构明显正常，大量细胞在板层内的大小、形状和分布几乎一致。这些包括内分泌上皮细胞簇(朗格汉斯胰岛，(I);周围有许多浆液腺泡(A);外分泌部分，为复合腺泡;大的小叶间管(D)由单柱状上皮排列。夹层管的最初部分(C)穿透腺泡管腔。层间导管合并形成由柱状上皮排列的更大的小叶间导管。导管和血管(V)位于结缔组织中，结缔组织也为整个腺体提供了一层薄薄的包膜和分隔分泌腺泡小叶的薄隔膜。各处理组(图4B、4C)胰岛细胞的染色和退变强度均降低，图4C显示退变程度较高。导管也因腺泡肥大而缩小，而血管在图4B中难以看到，在图4C中几乎完全缺失。

图4。出生后第15天大鼠胰腺一般微结构的低倍和高倍放大显微照片。胰岛（I）、腺泡（A）、小叶间导管（D）、主导管（M）、血管（V）和夹层导管（C）。胰岛细胞染色强度降低，变性，板C显示出比B更高的变性。导管也因腺泡肥大而减少：与对照组相比，B组难以看到血管，C组几乎完全没有血管（H&E×100和×400）。

图5显示PAS反应的染色显示，对照组的大体轮廓更稀疏，治疗组的叶间导管减少。与对照组相比，治疗组的细胞结构退化（图5）。与对照组相比，治疗组大鼠的PAS阳性率降低。

图5。出生后第15天大鼠胰腺的显微照片显示，与对照组(PAS， ×100和×400)相比，治疗组大鼠的胰腺染色强度降低(PAS阳性降低)。

讨论和结论

在哺乳期接触尼古丁通常与新生儿体重的剧烈变化有关。正如在这项研究中观察到的，从出生的第一天开始，哺乳期尼古丁导致体重下降。然而，到了第四天，暴露在环境中的新生儿体重的增加超过了未暴露的幼鼠。

正如Santiago和Huffman[9]所指出的，低出生体重通常伴随着产前暴露于含有尼古丁的物质，而这可能会导致体重加速增加。据报道，尼古丁暴露会导致后代[10]的葡萄糖不耐受和大脑对胰岛素的反应受损，暴露于尼古丁的儿童可能会经历“追赶性生长”，随后出现儿童肥胖[11]。由于体重调节和能量平衡的信号最终被整合到下丘脑[12]中，因此体重稳态的中央内分泌控制的改变可能是尼古丁暴露导致体重增加的原因。这些变化导致后代食欲增加。与此同时，到PD 10时，哺乳期尼古丁并没有进一步增加体重，而是使未暴露的幼鼠体重增加，并超过了处理的幼鼠，直到PD 15研究结束。非常重要的是，在患帕金森病7期的一组幼犬中终止尼古丁暴露并没有导致与对照组动物相比的体重增加(从帕金森病8期到帕金森病15期)。

与接受生理盐水的对照组相比，在本研究中测试的尼古丁剂量和持续时间导致动物血清中乳酸脱氢酶(LDH)水平显著升高。乳酸脱氢酶是细胞内产生能量的重要酶，是厌氧碳水化合物代谢的标志酶，催化乳酸转化为丙酮酸[12]。高水平的这种酶是一个迹象，增加碳水化合物代谢治疗组。此外，LDH是一种细胞毒性标记物，可用于检测[3]细胞损伤程度。它的增加也提示可能增加胰腺细胞的损伤，在本研究中获得的病理结果。

同样，与对照组相比，哺乳期间服用尼古丁的动物体内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)水平升高，而长期接触尼古丁的动物产生更大损害的可能性非常显著。G-6-PDH是一种通过糖酵解途径[12]催化碳水化合物代谢的酶，该酶水平的升高可能会增加产后治疗大鼠的碳水化合物代谢(能量的产生)。

LDH和G-6-PDH水平的增加表明碳水化合物代谢/能量生产的损害。然而，更多的碳水化合物通过糖酵解途径代谢，酶活性相对较高。这可以用暴露于尼古丁后胰腺的细胞结构受损来解释。

先前的研究同样表明，当发育中的胎儿和新生儿暴露于尼古丁中时，胰腺会出现进行性线粒体损伤和β细胞功能障碍[12,14]，从而影响暴露后代出生后的细胞结构和功能。结构异常在糖耐量出现之前就已经被观察到，并且随着年龄的增长而逐渐恶化，即使在断奶时停止尼古丁暴露[9,15]。

总之，哺乳期是尼古丁可能导致结构和生理病理改变的关键时期。因此，应谨慎行事，并向积极摄入尼古丁或接触尼古丁的母亲提供建议，因为尼古丁不仅会导致胰腺畸变，而且还具有致畸作用，影响怀孕后的后代。

参考文献

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