爱尔兰皇家外科学院外科学系
爱尔兰博蒙特医院教育和研究中心
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DOI: 10.15761 / ICST.1000337
实体瘤的临床数据显示高密度白细胞浸润与患者预后不良之间存在相关性。肿瘤相关中性粒细胞(TAN)和巨噬细胞(TAM)可占浸润性乳腺癌肿瘤总质量的50%，这些炎症细胞通过产生促血管生成介质和细胞外蛋白酶对组织重构和血管生成的发展产生积极影响。Lipoxins (LXs)，含有三羟基四烯的类环氧二酮，是炎症的内源性“制动信号”。LXs下调促炎细胞因子，抑制基质金属蛋白酶9 (MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子(HIF)，并可能作为选择性雌激素受体调节剂(SERM)。我们假设LXA4可改变乳腺癌患者的免疫耐受，增强抗肿瘤免疫反应。
方法:将转移性人乳腺腺癌细胞系MDA-MB-231和小鼠4T1乳腺癌细胞系培养于培养物和采收的肿瘤条件培养基中，离心900g，过滤0.22 m， -20℃保存。从健康志愿者的血液中分析人类中性粒细胞。采用流式细胞仪检测fitc偶联抗小鼠IACM-1单抗、pe偶联抗人CD11b和fitc偶联抗人CD62L细胞表面受体表达。使用CytoSelect细胞浸润培养板抑制肿瘤细胞浸润。miRNA用miRNeasy分离，用TaqMan反转录。miRNA表达归一化至内控Sno135值。
结果:LXA4(200nm)处理显著降低肿瘤条件培养基培养诱导的人中性粒细胞上CD11b粘附受体的表达(985±24.88 MCF:中药vs 806±61.23 MCF: p<0.05，方差分析)。LXA4可逆转中药诱导的人、鼠中性粒细胞l -选择素脱落(36.21±1.86 vs 47.41±5.8、70.53±2.11 vs 108.59±12.06，差异均p<0.05)。此外,LXA4通过调节肿瘤细胞ICAM-1的表达，抑制乳腺癌细胞侵袭(77±9细胞/场IL-1β (10ng/ml) vs 57±7细胞/场IL-1β+LXA4 (200nm)， p<0.05，方差分析)，并减弱转移潜能在体外(248.06±53.0 MCF IL-1β (10ng/ml) vs 129.5±46.23 MCF IL-1β+LXA4 (10nm) p<0.05, MDA-MB231的方差分析n=4;91.91+-6.5 MCF IL-1β (10ng/ml) vs 49.32±9.4 MCF IL-1β+LXA4 (200nm) p<0.01, 4T1方差分析n=3)。LXA4抑制基质金属蛋白酶的分泌(MDA-MB231细胞中IL-1β 5.03±0.78 vs 3.98±0.47 (ng/ml) IL-1β+LXA4 100nm, 4T1细胞中IL-1β 288.7±16.9 vs 228.7±36.48(ng/ml) IL-1β+LXA4 100nm)。此外LXA4治疗4小时显著增加人(2.5倍变化)和小鼠4T1(1.6倍变化)肿瘤细胞miRNA 146的表达。
讨论:在小鼠模型中，miR-146转导到乳腺癌细胞已被证明可以抑制侵袭、体外迁移，并显著抑制肺转移。我们首次证明了LXA4可以增强miRNA 146的表达。综上所述，这些结果表明LXA4具有减少乳腺癌转移扩散的潜力。针对肿瘤相关炎症和血管生成的联合抗血管生成治疗策略可能会在单独抗VEGF策略失败的情况下成功。进一步研究LXA4作为一种潜在的抗肿瘤药物是值得的在活的有机体内小鼠乳腺癌模型。
乳腺癌，转移，粘连受体，尾静脉
乳腺癌是全球第二大常见癌症，2018年确诊的新病例超过200万例。此外，约85%的此类患者接受手术干预，因为切除术仍然是乳腺癌的基本治疗方式。然而，手术操作破坏了肿瘤的结构完整性，使恶性细胞脱落进入循环系统，增加了转移的风险。最近一项针对非手术治疗和手术治疗乳腺癌患者的流行病学研究表明，前者在4年随访时出现死亡率峰值，后者在8年[3]时出现另一个独特的峰值。一个世纪的研究已经开始阐明手术切除与与直觉相反的远处转移风险增加之间的联系[4,5]。在动物模型中，由于物理操作[5]，手术切除已被证明增加围手术期肿瘤流入局部血液和淋巴管。在体外模型显示，手术可以通过诱导基质金属蛋白酶(MMP-9)的释放和触发肿瘤细胞表面细胞粘附分子(ICAM)的表达来增强侵袭潜能。由于细胞损伤释放的生长因子(EGF, IL-6)和缺氧(VEGF)在手术应激时高度上调，进一步增强了肿瘤栓塞和微转移的可能性。这些考虑是特别重要的，因为大约90%的癌症相关死亡是局部浸润和远处转移的直接结果。在如何调节这种有害的围手术期环境以改善长期预后方面，临床实践中存在差距。
Lipoxin A4 (LXA4)是一种含有花生四烯酸(AA)衍生物的三羟基四烯，属于类乙二烷类[8]。与前列腺素和白三烯等研究较深入的类二十烷类化合物的促炎作用相反，脂素已被证明具有有效的抗炎和抗血管生成特性[9,10]。Lipoxins被认为通过其在g蛋白偶联的AXL受体上的立体特异性激动剂活性发挥细胞反应，触发细胞内钙动员和进一步的细胞内信号通路，目前尚不清楚[8,9]。LXA4具有改变侵袭性促炎环境的实验能力[9-14]。在浸润性乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞(TAM)可占总组织[15]的50%。TAM的主要表现为从普通M1巨噬细胞到M2巨噬细胞的表型转换，通过改变趋化因子谱促进新血管生成、肿瘤生长、肿瘤侵袭、基质重塑和抑制适应性免疫系统[16,17]。LXA4治疗可将改变的M2巨噬细胞转化为典型的M1表型，具有抗肿瘤作用，包括显著增加吞噬能力和活性氧生成[12]。在乳腺癌[18]中，血管生长因子(VEGF)表达增加与预后不良密切相关。多项研究表明，LXA4暴露可显著降低VEGF和缺氧诱导因子(HIF-1a)表达，从而降低肿瘤生长和血管生成[9-11,13]。此外，围手术期降低VEGF表达可通过阻断VEGFR-2信号级联来减少微转移，该信号级联可诱导肿瘤细胞[14]的局部内皮通透性。
肿瘤抑制小分子rna (miRNAs)和致癌小分子rna (oncomiRs)与癌症发展有关4，根据个别miRNAs的表达谱对恶性肿瘤进行了分类[19,20]。某些miRNAs，如miR-126, miR-335和miR-146，在乳腺癌中差异表达，已经与转移阶段有功能联系，(21、22)。越来越多的研究表明，miR-146家族在炎症过程中发挥作用，miR-146a已被证明与之相关乳腺癌易感基因1表达，编码乳腺癌1型易感蛋白[23]的人类肿瘤抑制基因。miR-146转导至乳腺癌细胞下调表皮生长因子受体的表达，抑制体外侵袭和迁移，并显著抑制小鼠模型[24]的肺转移。许多沉默的mirna似乎通过靶向癌基因发挥肿瘤抑制作用，因此mirna的重新表达可能是癌症治疗的有效途径[25]。LXA4已被证明可以通过微泡[26]介导miRNA的表达和转移。
围手术期提供了一个辅助治疗改善患者预后[27]的治疗窗口，但目前还没有合适的治疗方法。脂质介质可破坏免疫耐受，增强手术时的抗肿瘤免疫反应。针对肿瘤相关炎症和血管生成的联合抗血管生成治疗策略可能会在单独抗VEGF策略失败的情况下成功。这项工作的目的是评估LXA4作为乳腺癌手术围手术期潜在的辅助治疗，特别注意转移侵袭能力。
转移性人乳腺腺癌细胞系MDA-MB-231从美国类型培养集合(ATCC, Rockville, MD)中获得。小鼠4T1乳腺癌细胞系来自美国类型培养集合(Manassas, VA)。MDA-MB231和4T1细胞分别培养在DMEM或RPMI 1640培养基中，添加10%FCS、青霉素(100单位/ml)、硫酸链霉素(100 mg/ml)和2.0mM谷氨酰胺。细胞在37°C的5% CO中保持2当细胞融合时，用0.05%胰蛋白酶-0.02% edta进行胰蛋白酶转代培养。
MDA-MB231或4T1细胞(5x105/)在培养液中培养至亚汇合(约80%)，PBS洗涤3次，仅以培养液作为对照，IL-1b (MDA-MB231为20ng/ml, 4T1为10ng/ml)， RvD1单独或RvD1加IL-1b(分别为200nM、100nM和10nM)在37℃5% CO的新鲜培养基中处理2然后收集中药，在900g和4°C下离心20分钟，通过0.22 mm孔径过滤器(Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)，并在-20°C保存直到使用．
如前所述，用流式细胞术检测MDA-MB231和4T1细胞上ICAM-1的表达。简单地说，将细胞培养到亚融合状态，用40 ng/ml IL-b作为刺激剂孵育，并用200nM、100nM或10nM的LXA处理4．100ml细胞悬浮液(0.2x106/ml)与1ml fitc偶联抗小鼠iac -1单抗或5ml fitc偶联抗人ICAM-1单抗孵育。以fitc偶联小鼠IgG1 k同型作为阴性对照。在配备氩激光激发波长λex = 488nm的FACSCalibur流式细胞仪上分析ICAM-1受体在肿瘤细胞上的表达。至少收集了10,000个事件。数据记录在平均通道荧光(MCF)强度的对数尺度上，并使用Lysis II软件进行分析。仪器每天校准一次。
人体血液的测量多形核的白细胞(PMN) l选择素脱落:取100ml人新鲜血液样本，与100ml中药在RT中孵育1 h，然后与5ml fitc结合的抗人CD62L在RT中孵育30 min。5ml fitc共轭同型IgG1 k作为阴性对照。用流式细胞仪检测PMN细胞中l -选择素脱落。
100ml新鲜人或小鼠全血与100ml肿瘤条件培养基(TCM) (MDA或4TI视情况而定)室温孵育1h。用2ml fitc偶联抗小鼠CD11b或5µl pe偶联抗人CD11b染色。以5ml pe偶联抗小鼠Ly-6G, 2ml fitc偶联同型IgG或5ml pe偶联同型IgG2a k作为阴性对照。4℃孵育30 min后，流式细胞仪检测CD11b的表达。
按照生产说明书，用ELISA法测定细胞培养上清中MMP-9的总分泌量。简单的说，每孔50l样品在rt条件下孵育2小时。吸吸/洗x 3后，在每孔中加入100ml小鼠总MMP-9结合物，在rt条件下孵育2小时。加入100ml底物溶液，然后在rt下孵育30分钟。加入100ml停止溶液，使用Microtiter Plate Reader设置为450nm确定每孔的光密度。(维克多TMX3multilable Reader PerkinElmer，俄亥俄州，美国)。
使用CytoSelect细胞侵袭培养板(Cambridge Biosciences)评估肿瘤细胞侵袭潜能。简单地说，在侵袭室的下孔中加入含10% FBS的培养基500µl和处理过的细胞悬液300µl (1.5x106/ml)到每个插入件的顶部，在37°C的5% CO中浸泡48小时2.轻轻擦拭插入物的顶部以去除非侵入性细胞。将插入物转移到400 μ l的染色液中，在rt下孵育10min。在光显微镜下，每个插入物在200x下至少有三个单独的视野，对侵袭性肿瘤细胞进行计数。
使用miRNeasy Micro Kit (Qiagen)提取总rna，并使用TaqMan MicroRNA reverse Transcription Kit进行反转录。TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems)用于定量PCR检测mRNA水平。PCR在LightCycler 480 (Roche)上进行。Ct值用于转录本的量化。miRNA的表达归一化为Sno135，被认为是内控miRNA。数据采集和分析使用2−ΔΔCt方法[28]。
CD11b:CD11b调节白细胞粘附、迁移和中药孵育1h，与对照组相比，CD11b在人中性粒细胞上的表达增加(844.72±78.88 MCF/细胞vs 984.96±24.88 MCF/细胞(p<0.05，图1)。IL-1β的添加进一步提高CD11b的表达(1161.95±70.25MCF/细胞)。治疗LXA4显著降低中药诱导的CD11b(870.23±74.69 MCF/细胞)和IL-1β(921.46±32.03)的表达。
图1:LXA4治疗可显著降低肿瘤条件培养基培养诱导的人中性粒细胞上CD11b粘附受体的表达*，p<0.05，方差分析n=5。LXA4治疗可显著降低IL-1β孵育诱导的人中性粒细胞上CD11b粘附受体的表达。数据为均值±SEM *， p<0.01，方差分析n=5。
L-selectin:l -选择素在调节白细胞入侵的多步黏附级联过程中被裂解，这种脱落负责放大白细胞招募[29]。与对照组相比，中中药诱导中性粒细胞l -选择素脱落(36.21±1.86 MCF/细胞vs 53.18±0.97 MCF/细胞(p<0.0001，图2A)， IL-1β刺激进一步增加脱落(29.96±1.23MCF/细胞)。相比之下，LXA治疗4Il-1β/LXA组合4显著逆转为49.21±3.33 MCF/细胞(p<0.001)和39.0±7.27 MCF/细胞(p<0.078)。与对照组相比，中药诱导的小鼠l -选择素脱落(70.54±2.11 MCF/细胞vs 101.27±10.9 MCF/细胞(p<0.01，图2B)。IL-1β的加入进一步增加到50.96±10.0 MCF/细胞。相比之下，LXA治疗4Il-1β/LXA组合4显著逆转为110.08±25.15 MCF/cell (p<0.05)和102.52±12.11 MCF/cell (p<0.001)。
图2:LXA4治疗可显著逆转由肿瘤条件培养基或IL-1β诱导的人和小鼠中性粒细胞的l -选择素脱落。数据表示均值±SEM *， p<0.0001， & p<0.001 ^ p<0.078方差分析n=4。人类中性粒细胞。(A). *， p<0.01， &，p<0.05， %，p<0.001方差分析n=4。小鼠中性粒细胞。（B[CC1])
ICAM-1:ICAM-1黏附受体激活癌细胞，促进细胞运动、侵袭和转移。我们的实验证明LXA4下调小鼠和人乳腺癌细胞中ICAM-1的表达。炎症因子IL-1β刺激MDA-MB231或4T1细胞后，ICAM-1的表达由50.63±2.82 MCF/细胞增加到248.06±53.0 MCF/细胞，p<0.0014在MDA-MB231上，ICAM-1下降至129.45±46.23 MCF/细胞，p<0.05(图3A)。同样，在4T1时，ICAM-1的表达量从42.1±4.05MCF/细胞增加到91.91±6.49MCF/细胞，p<0.001, LXA4则逆转到29.77±1.74 MCF/细胞，p<0.001(图3B)。
图3:LXA4(10nm)可降低IL-1β预处理24小时后乳腺肿瘤细胞表面ICAM-1的表达。数据为平均值±SEM。* p<0.001 IL-1β与对照培养基，^p<0.05 IL-1β+LXA4人MDA-MB231细胞与IL-1β的方差分析n=4 (A)。*p<0.001 IL-1β与对照培养基，^p<0.001 IL-1β +LXA4对小鼠4T1细胞IL-1β方差分析n=3。(B)
MMP-9:与对照组相比，IL-1β刺激MDA-MB231细胞MMP-9分泌增加5.02±0.78 vs 3.75±0.38 (ng/ml) p<0.05。LXA4显著降低了MMP-9的分泌3.98±0.47 (ng/ml)， p <0.05, n=5。（图4一)．在4T1细胞中，IL-1β刺激使MMP-9分泌增加288.7±16.90 (ng/ml)，而对照组为237.6±39.33 (ng/ml)， p<0.05。和LXA治疗4显著降低至228.7±36.48 (ng/ml) p<0.05, n=5(图4B)。
图4:LXA4(100nm)可减少乳腺癌细胞MMP9的分泌。细胞经IL-1β或IL-1β+LXA预处理4为24小时。数据为平均值±SDM。*p<0.05 IL-1β与对照培养基。^ p < 0.05 il - 1β+ LXA4MDA-MB231细胞与IL-1β单用方差分析n=4 (A)。* p<0.05 IL-1β与对照培养基，^ p<0.05 IL-1β +LXA4与IL-1β单用方差分析n=3 (B)。
入侵:与对照组相比，IL-1β刺激增加MDA-MB231通过基底膜的侵袭(76.7±8.94个细胞/野vs 58.5±4.37 *p<0.05 n=4)。宽松的治疗4抑制受刺激的侵袭(57.3±6.71个细胞/野^p<0.05 n=4。(图5)。
图5:LXA4抑制IL-1β (10nM持续48h)刺激MDA-MB-231细胞通过基质包被的基底膜侵袭。入侵细胞在光镜下定量在10个随机场Transwell。数据用均值+/- SEM表示。* p<0.05 IL-1β Vs对照组，^ p<0.05 IL-1β +LXA4与IL-1β方差分析n=4
microrna的:LX4治疗改变了人类MDA-MB231(2.57倍)和小鼠4T1(1.87倍)乳腺癌细胞的miRNA表达。LX4处理和未处理的乳腺癌细胞之间的miRNA表达有显著的倍性差异在体外4小时(图6)
图6:LXA4PCR结果显示，治疗4小时显著增加了MDA-MB231和4T1肿瘤细胞miRNA 146的表达。数据用平均数表示，代表4个独立的实验。LXA4与对照组相比，MDA-MB231组*p< 0.05 (A). 4T1组*p<0.079 (B)，方差分析。
手术通过诱导mmp[31]的释放和增强肿瘤细胞[32]上的粘附分子表达，增强了自由恶性细胞的侵袭能力．我们的数据显示，LXA4显著下调肿瘤细胞黏附受体的表达，减少肿瘤细胞的侵袭。已知ICAM-1黏附受体可激活癌细胞，促进细胞运动、侵袭和转移[33]。LXA4下调小鼠和人乳腺癌细胞中ICAM-1的表达。
循环中性粒细胞在肿瘤细胞阻滞和外渗过程中与转移性肿瘤细胞密切相关在活的有机体内在动物模型中已被证明可促进肿瘤细胞在靶器官微血管系统中的沉积[34-36]中性粒细胞细胞外陷阱(NET)隔离循环肿瘤细胞并协助[37]转移。这项研究表明，LXA4降低了肿瘤环境中培养的PMN上的滚动受体l -选择素和粘附受体CD11b。
许多沉默的mirna似乎通过靶向癌基因发挥肿瘤抑制作用，因此mirna的重新表达可能是癌症治疗的有效途径[38]。我们的miRNA数据表明，LXA4治疗增加了人乳腺癌细胞中miR-146b的表达。赫斯特埃尔一l之前将miR-146家族与乳腺癌转移联系起来，表明乳腺癌转移抑制因子1 (BRMS1)显著上调miR-146的表达，进而下调表皮生长因子受体(EGFR)的表达，抑制侵袭和迁移在体外并显著抑制小鼠[24]模型的肺转移。miR-146a表达的降低也会导致肺癌细胞[39]中COX-2的上调和过表达。miR-146也被证明可以通过靶向乳腺癌[40]中的RhoA来抑制细胞迁移和侵袭。
乳腺组织中miR-146a和miR-146b表达下调与乳腺癌[41]的发生和恶化有关。LXA4的免疫调节作用机制是复杂的。众所周知，LXA4抑制vegf刺激的内皮细胞增殖[42,43]和LXA4已被证明会降低缺氧诱导因子1- α（低氧条件下HIF-1α)在肝癌小鼠模型中的表达[44,45]。LXA4通过减少前列腺素E₂的产生和雌激素信号，表明选择性雌激素受体调节剂(SERM)样抑制雌二醇作用[46]，从而抑制小鼠子宫内膜异位症的进展。
手术切除仍然是乳腺癌的基本治疗方式，尽管手术操作可能导致肿瘤细胞扩散到循环系统，虽然乳腺癌手术被归类为小手术，但手术操作产生了大量的免疫调节，对疾病复发率和患者长期预后[47]有显著影响。围手术期为辅助治疗改善患者预后提供了一个治疗窗口，在这种情况下，辅助免疫调节促化解脂质可能增强围手术期宿主抗癌防御机制。我们的初步工作是有希望的，需要在一系列的研究中更充分地阐明在活的有机体内探索这些脂质介质在围手术期的治疗效益与先天免疫反应降低对术后愈合的潜在不良影响之间的平衡的实验。
小鼠尾静脉注射工作是在爱尔兰健康产品监管局(HPRA)的许可下进行的，符合欧盟的规定欧盟指令2010/63 /并获得了爱尔兰皇家外科医生学院伦理委员会的伦理批准(#REC 595)。在受试者知情同意的情况下采集人类志愿者血液样本。这项工作获得了Beaumont医院伦理委员会的伦理批准(参考编号17/88)。
在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。原始数据在一个附加的可用文件中提供。
列出的作者声明他们与任何组织或实体没有任何关联或参与任何金融感兴趣在这项工作中并无利益冲突。
这项工作是由博蒙特医院癌症研究信托基金资助的。
所有与作者标准被列为作者，所有作者证明他们已经充分参与工作，对内容承担公共责任，包括参与概念，设计，分析，写作，或修改的稿件。
H.C进行并监督其他人协助实验工作，并分析结果。sfv建议并协助miRNA工作，并分析结果。e。b。做了一些细胞生物学和流式细胞术实验。A. H修改了手稿。C.C设计了概念和实验，编写并编辑了手稿。所有作者阅读并批准最终稿。
作者要感谢成本行动CA14204的贡献。
Hiroshi宫本茂
罗切斯特大学医学中心
研究文章
收稿日期:2020年4月21日
录用日期:2020年5月10日
发布日期:2020年5月13日
©2020 Browne E.这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可条款发布，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Browne E, Chen H, Vencken S, Condron CM (2020) Lipoxin A4是一种治疗乳腺癌转移的新药物。整合癌症科学治疗7:DOI: 10.15761/ICST.1000337。
图1:LXA4治疗可显著降低肿瘤条件培养基培养诱导的人中性粒细胞上CD11b粘附受体的表达*，p<0.05，方差分析n=5。LXA4治疗可显著降低IL-1β孵育诱导的人中性粒细胞上CD11b粘附受体的表达。数据为均值±SEM *， p<0.01，方差分析n=5。
图2:LXA4治疗可显著逆转由肿瘤条件培养基或IL-1β诱导的人和小鼠中性粒细胞的l -选择素脱落。数据表示均值±SEM *， p<0.0001， & p<0.001 ^ p<0.078方差分析n=4。人类中性粒细胞。(A). *， p<0.01， &，p<0.05， %，p<0.001方差分析n=4。小鼠中性粒细胞。（B[CC1])
图3:LXA4(10nm)可降低IL-1β预处理24小时后乳腺肿瘤细胞表面ICAM-1的表达。数据为平均值±SEM。* p<0.001 IL-1β与对照培养基，^p<0.05 IL-1β+LXA4人MDA-MB231细胞与IL-1β的方差分析n=4 (A)。*p<0.001 IL-1β与对照培养基，^p<0.001 IL-1β +LXA4对小鼠4T1细胞IL-1β方差分析n=3。(B)
图4:LXA4(100nm)可减少乳腺癌细胞MMP9的分泌。细胞经IL-1β或IL-1β+LXA预处理4为24小时。数据为平均值±SDM。*p<0.05 IL-1β与对照培养基。^ p < 0.05 il - 1β+ LXA4MDA-MB231细胞与IL-1β单用方差分析n=4 (A)。* p<0.05 IL-1β与对照培养基，^ p<0.05 IL-1β +LXA4与IL-1β单用方差分析n=3 (B)。
图5:LXA4抑制IL-1β (10nM持续48h)刺激MDA-MB-231细胞通过基质包被的基底膜侵袭。入侵细胞在光镜下定量在10个随机场Transwell。数据用均值+/- SEM表示。* p<0.05 IL-1β Vs对照组，^ p<0.05 IL-1β +LXA4与IL-1β方差分析n=4
图6:LXA4PCR结果显示，治疗4小时显著增加了MDA-MB231和4T1肿瘤细胞miRNA 146的表达。数据用平均数表示，代表4个独立的实验。LXA4与对照组相比，MDA-MB231组*p< 0.05 (A). 4T1组*p<0.079 (B)，方差分析。
