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摘要

端粒长度异常与几种癌症有关。然而，端粒长度如何作为乳腺癌的预后和/或预测因子，或用于鉴别其不同的分子亚型尚不清楚。

在这里，我们评估了一系列105例treatment-naïve her2阴性患者(80例管腔阴性和25例三腔阴性)的端粒长度，以评估端粒大小与乳腺癌亚型临床病程的相关性。

我们的结果显示存在一个17例长端粒患者的亚组;他们的大多数肿瘤是三阴性亚型，具有最高的组织学分级和高Ki67增殖指数，表明长端粒和癌症侵袭性之间存在关联。具体来说，端粒长和端粒缩短与三阴性患者相关。此外，端粒长患者的发病年龄明显早于所有不良反应患者，Ki67增殖指数最高，治疗反应最差。长端粒肿瘤也显示PS6免疫组化染色增加，如POT1突变携带者。综上所述，我们的发现似乎定义了一个与端粒长和端粒缩短减少有关的更具侵略性的三阴性病例(约40%)的新亚群。需要更多的研究和随访来验证这些初步结果。

关键字

长端粒，乳腺癌风险，三阴性亚型，端粒缩短率，POT1

介绍

端粒在各种癌症类型中起着重要作用，与有丝分裂相关的端粒逐渐缩短导致细胞在转化早期衰老和凋亡[1]。端粒长度异常（TL）可能对恶性肿瘤和癌症风险有预后意义。越来越多的癌症易感性和人群研究证据表明，缩短TL的基因变异与癌症风险增加之间存在相关性[2]。相比之下，基因突变导致的端粒缩短减少POT1该基因编码一种参与端粒维持的庇护素复合体的成员，导致慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌、黑色素瘤、胶质瘤和血管肉瘤[3]等多种癌症类型的长端粒和肿瘤进展。在乳腺癌中，TL经常被评估，但以前的研究没有在TL和三种主要分子亚型[4]之间建立可靠的预后和/或预测相关性。此前，短而不长的端粒被认为与更具侵袭性的乳腺癌亚型[5]有关。TL似乎也与乳腺癌风险的增加无关[6,7]。缺乏重要的证据可以解释为最近的观察化疗影响TL[8]。因此，在研究TL与疾病易感性或临床过程相关的研究中，应该考虑treatment-naïve患者，因为化疗修饰的TL可能会偏离真正的生物学关联。

材料和方法

病人her2阴性乳腺癌系列的TL以前测量为[9]。最初的系列由130例treatment-naïve her2阴性乳腺癌患者的外周血组成。在此系列中，我们重新评估了105例具有完整临床资料的患者的TL;80例患者腔内(雌激素受体- er -和/或孕激素受体- pr -阳性，her2阴性)，25例患者三重阴性(表S1)。采用qPCR检测化疗前外周血单个核细胞TL水平。

所有纳入本研究的患者均获得知情同意。所有研究程序均按照《赫尔辛基宣言》和良好临床实践标准进行。西班牙马德里大学Ramon y Cajal医院伦理委员会批准了这项研究(批准ID: CEIC REF. 04.082011)。

靶向下一代测序(tNGS)使用来自Sistemas Genómicos(补充材料和方法)的Onco4基因面板，采用tNGS对13例三阴性患者(10例Ltel患者和3例Ntel患者)进行测序。标记并扩增指标病例基因组DNA 25ng。使用安捷伦2100生物分析仪对纯化文库的质量和数量进行了评估。文库在Illumina的MiSeq平台上进行了测序。使用BWA比对器将Reads与人类参考基因组版本GRCh38/hg38进行比对。此时，低质量的读取和PCR重复被从bam格式的文件中删除。变体调用使用VarScan和GATK的组合，以及内部脚本来组合和过滤变体。只有在编码区域的微小等位基因频率(MAF) >0.01的变异，根据Sift、Polyphen2和Condel算法被认为是有害的才被考虑。已识别的变体使用Ensembl数据库进行注释。候选变异通过Sanger测序得到证实。

免疫组织化学研究:取患者活检组织标本，经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)，切成5 μm厚切片，苏木精伊红染色，光镜观察。将FFPE块切成5-l厚的切片进行免疫组化(IHC)研究。通过计数Ki67抗体染色的肿瘤细胞百分比来检测肿瘤的增殖指数(参考文献:IR626)。利用Cell Signaling Technology公司的抗ps6核糖体蛋白(Ser235/236)检测PI3K/Akt通路。参考2211)按照制造商的说明。未染色和过多的非特异性染色均为阴性染色

结果

her2阴性乳腺癌患者的端粒长度:最近，我们测量了her2阴性乳腺癌系列的TL，以评估其与化疗毒性的关系(9)。中位TL与毒性无关，但极短端粒(<3Kb)的百分比与紫杉醇相关的更大的毒性发作(疲劳、肌痛和神经病变)相关。另一方面，化疗前的TL显示了一系列异常长端粒的异常值;因此，我们重新评估TL对几个与侵袭行为相关的临床特征的影响，以更好地理解端粒在her2阴性乳腺癌中的作用。

最初的系列由130例treatment-naïve her2阴性乳腺癌患者的外周血组成，这些患者计划接受紫杉醇新辅助化疗。在这个系列中，我们研究了105名具有完整临床资料的患者;80例患者腔内(雌激素受体- er -和/或孕激素受体- pr -阳性，her2阴性)，25例患者三重阴性(表S1)。化疗前外周血单个核细胞的TL(观察TL)和对照人群[8]的TL(预期TL)进行年龄归一化(表1)。观察/预期TL之间的差异被纳入一个线性回归模型，在病例中显示较低的斜率(R2=0.204;P=0.033)， R2=0.574;P= 0.001)。与对照组相比，部分患者TL增加(图1A)。我们选择了TL增加的患者，通过识别那些TL比率为阳性(与预期测量相比观察到的)和短端粒(小于3Kb)百分比减少(小于10%)的患者，这与[1]细胞中端粒缩短率减少相关。105例患者中有17例属于长端粒(Ltel)组，其余88例被认为具有正常大小的端粒(Ntel)(图1B)。TL和短端粒百分比在Ltel组和Ntel组之间差异有统计学意义(p<0.001)(表1)。

图1所示。端粒长度(TL)与her2阴性乳腺癌系列的临床评价．(A) her2阴性序列(红点)和对照群体(蓝点)的TL (Kb)作为年龄(年)的函数。回归线为her2阴性系列(红色)和对照群体(蓝色)。her2阴性组与对照组之间差异不显著。(B) her2阴性患者端粒长、端粒缩短减少的TL (Kb)作为年龄(年)的函数(Ltel组;红点)和对照组(蓝点)。回归线显示为Ltel患者(红色)和对照组人群(蓝色)。(C)完整her2阴性系列中三联阴性(TN)和管腔阴性(Lum)患者以及Ntel和Ltel组的百分比(** p=0.004)。(D)完整her2阴性系列以及Ntel和Ltel组中肿瘤的恶性等级百分比(G1, G2或G3) (*** p<0.001)。(E)完整her2阴性系列患者每个肿瘤分级(G1, G2或G3)端粒长度比的中位数(观察:预期)。 (F) Average percentage of the tumour cells positively stained with Ki67 in patients of the complete HER2-negative series, and Ntel and Ltel groups (* p=0.016)

表1:平均端粒长度和临床特征的Ntel和Ltel组。

TN:三重阴性;呃:雌激素受体;公关:孕激素受体;* / * *:重要;NS:不重要

在Ntel /Ltel组之间的意义

端粒长度和临床参数的独立检测的渐近意义(双边

端粒长度和临床参数之间的独立测试的渐近意义(双边

患者组长端粒(Ltel)与正常端粒(Ntel)的临床特征比较

Ltel组与Ntel组比较(表1)显示，25例三联阴性(TN)患者中10例为Ltel组，占Ltel组患者的58.82%，17例Ltel患者中只有7例为luminal组(41.18%)。Ntel组仅有15例TN患者(17.05%)，luminal组73例(82.95%)。长端粒组TN亚型所占比例明显高于Ntel组(p=0.004)(表1)，提示存在长端粒组TN亚型(图1C)。组内比较组织学分级(1级、2级或3级)。Ltel组中3级患者最多(58.82%)，而Ntel组中只有22.73%的患者为3级(图1D)。在Ltel和Ntel组中，每个级别的患者百分比有显著差异(p<0.001)，提示TL和组织学级别之间呈正相关(表1)。同样，TL的中位比值(观察到的:预期的)随肿瘤级别增加(图1E)。关于Ki67扩散指数,这是最强的负面腔的肿瘤的预后因素[10],平均48.75%和28.77%的肿瘤细胞染色阳性Ltel和Ntel组,分别为(图1),这意味着更高的增殖率患者长端粒(p = 0.016;表1)。另一方面，纳入Ltel组的患者的平均诊断年龄(45.84岁)低于Ntel组(50.03岁)(p=0.060)，尽管这一差异具有边缘性显著性。

最后，使用列联表计算不同渐近意义(双侧)，以评估her2阴性序列中临床比较的独立性(表1)。长端粒和极短端粒(小于3Kb)数量的减少(小于10%)正相关(p<0.001)。这表明长端粒的存在是由于体细胞缺乏正常的缩短。同样，肿瘤亚型、组织学分级和Ki67也呈正相关(p<0.001)。最后，TL测量值(长端粒和短端粒数量的减少)和临床特征(分子亚型、分级和增殖)在序列中呈正相关(p<0.01)，表明侵袭性和长端粒之间存在相关性。诊断年龄与TL或临床特征无关(表1)。

三重阴性和管腔亚型的端粒差异：在三阴性（TN）和管腔（Lum）患者之间，端粒缩短率（回归线斜率）没有观察到差异（图2A）。同样，组内比较显示，与Lum组的Ntel患者相比，Ltel患者的端粒缩短率正常（图2B）。然而，与TN组内的Ntel患者相比，Ltel患者的端粒缩短率降低（图2C）。在TN组中，Ltel患者的发病年龄（47.74岁）早于Ntel患者（52.00岁）。关于Ki67增殖指数，Ltel组和Ntel组分别有67.30%和49.27%的肿瘤细胞呈阳性染色。这些结果表明，在TN亚型中具有长端粒的患者中，早期诊断与高度增殖性肿瘤之间存在正相关（表S2）。

图2。端粒长度(TL)与Ntel患者的临床特征比较．(A)三阴性(TN)的TL (Kb)与年龄(年)的关系;红点)和腔内(蓝点)患者。TN(红色)和Lum(蓝色)亚型的回归线无显著差异。(B)腔内长端粒(Ltel)患者的TL (Kb)与年龄(年)的关系;红点)和正常端粒(Ntel;蓝色的点)。回归线为Ltel(红色)和Ntel(蓝色)患者。(C)三阴性(TN)长端粒(Ltel)患者的TL (Kb)与年龄(年)的关系;红点)和正常端粒(Ntel; blue dots). Regression lines are shown for the Ltel (red) and Ntel (blue) patients. (D) Age at diagnosis of the patients from the complete HER2-negative series as a function of treatment response (NS: not significant; ** p<0.01; *** p<0.001). (E) Percentage of cells in tumour stained with Ki67 for the patients of the complete HER2-negative series as a function of treatment response (NS: not significant; ** p<0.01; *** p<0.001). (F) Representative anti-PS6 antibody staining of tumour tissue of a HER2-positive breast cancer patient (control), an Ltel patient (HER2-negative, grade 2, 50% Ki67) and an Ntel patient (HER2-negative, grade 2, 70% Ki67)

队列患者在新辅助治疗中接受单药紫杉醇治疗，病理完全缓解根据Symmans和Pusztai方法[11]确定。评分为0或1(>长期治愈率为90%)的患者被归类为良好反应，评分较高(>长期复发率为30%)的患者被归类为不良反应。两亚组(TN_Ltel和TN_Ntel)中约80%的患者对所使用的治疗反应不良。然而，端粒长(Bad_Ltel)的不良反应者发病年龄更早(图2D)，他们的肿瘤Ki67增殖率(图2E)高于端粒正常(Bad_Ntel)的不良反应者。

因为有10-15%的TN患者存在基因突变乳腺癌易感基因1或BRCA2使用来自Sistemas Genómicos的Onco4基因面板，对10例LTel组患者进行靶向下一代测序(tNGS)研究。仅有1例(10%)BRCA1突变(BRCA1p.Pro968LeufsTer33;rs398122670)，提示长端粒TN亚群与BRCA1/2突变无关。

长端粒致病性的分子验证:长端粒和减少端粒缩短已被描述在癌症患者的突变POT1基因，端粒维持基因[3]。最近，我们描述了肿瘤来自POT1突变携带者表现出PS6免疫组化染色增强，PS6是PI3K/Akt通路的下游分子[13]。因此，为了将我们系列中的长端粒与端粒维持功能的改变相关联，我们用抗PS6染色评估了HER2阴性系列患者。我们从我们的系列中选择了4个Ltel和4个Ntel福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）2级肿瘤组织，具有高Ki67染色。来自端粒正常的HER2阳性乳腺癌患者的其他四个FFPE肿瘤组织作为对照纳入研究。与Ntel组和HER2阳性乳腺癌对照组相比，Ltel患者的抗PS6染色增加（图2F）。由于Ltel和Ntel HER2阴性肿瘤均为高Ki67染色的2级肿瘤，因此观察到的抗pS6染色差异增加与端粒长度差异相关。Ltel患者中增加的抗PS6染色与我们之前对端粒较长患者的观察结果一致，端粒较长的患者是由基因突变驱动的POT1基因[13]。为了测试可能的作用POT1在长端粒TN亚群中，通过tNGS数据评估POT1突变。没有突变POT1基因被发现。

讨论

综上所述，我们描述了一组新的TN患者，端粒较长，端粒缩短率降低，与更强的侵袭性特征(更高的分级和增殖率，以及更早的发病年龄)显著相关。这一亚组约占TN病例的40%。此前，短而不长的端粒被认为与更具侵袭性的乳腺癌亚型[5]有关。此外，我们的研究结果表明，端粒缩短的减少可能与治疗反应的恶化有关。

此外，在本研究系列长端粒患者的肿瘤中，anti-PS6染色增加，这与之前在其他POT1功能和长端粒改变的肿瘤类型中观察到的结果一致[3,13]。然而，在POT1在我们的一系列患者中发现了基因，这表明与端粒维持有关的其他基因可能解释了端粒长度改变和乳腺癌风险。

最后，只有一个突变在乳腺癌易感基因1TN-Ltel组中的基因，这似乎表明长端粒与细胞凋亡之间没有关联BRCA基因。因此，有必要对具有长端粒的TN乳腺癌患者进行更大规模的研究，以破译与这一具有更强病理侵袭性的亚群相关的病因、临床和遗传特征以及治疗反应。

金融支持

OC获得了H2020 BRIDGES项目的资助(编号:634935)。JB的实验室部分由Salud Carlos III研究所(ISCIII)的PI16/00440基金资助，该基金由欧洲区域发展基金(ERDF)共同资助。MQF获得了以下拨款:由ISCIII资助并由ERDF共同资助的PI16/00354，以及B2017/BMD3733 (Immunothercan-CM) -马德里地区协调研究小组呼吁-马德里地区政府- ERDF基金。布拉斯科实验室的研究由西班牙经济部经济和竞争力项目(SAF2013-45111-R和SAF2015-72455-EXP)、马德里共同体项目(S2017/BMD-3770)、世界癌症研究(WCR)项目(16-1177)和Fundación Botín(西班牙)资助。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

补充数据

参考文献

1. 朱晓霞，韩伟，薛伟，邹勇，谢超，等。(2016)端粒长度与癌症风险的相关性研究。Sci代表3: 636 - 651。(Crossref)
2. Haycock PC, Burgess S, Nounu A, Zheng J, Okoli GN, et al.(2017)一项孟德尔随机化研究显示端粒长度与癌症和非肿瘤性疾病风险之间的关系。JAMA杂志3: 636 - 651。(Crossref)
3. Calvete O, Garcia-Pavia P, Domínguez F, Bougeard G, Kunze K, et al.(2017)广泛的POT1基因变异与多种癌症类型相关。欧洲人类遗传学杂志4: 1 - 4。(Crossref)
4. ennouri - idrissi K, Maunsell E, Diorio C(2017)端粒长度与乳腺癌预后:系统综述。癌症的论文生物标记:4: 3 - 10。(Crossref)
5. Heaphy CM, Subhawong AP, Gross AL, Konishi Y, Kouprina N, et AL .(2011)腔B、HER-2和三阴性乳腺癌亚型的短端粒。国防部分册24: 194 - 200。
6. Luu HN，Long J，Wen W，Zheng Y，Cai Q，et al.（2016）端粒长度遗传风险评分与乳腺癌风险之间的关联。癌症导致控制27日:1219 - 1228。
7. Pavanello S, Varesco L, Gismondi V, Bruzzi P, Bolognesi C, et al.(2018)白细胞端粒长度与乳腺癌风险/易感性:病例对照研究。《公共科学图书馆•综合》13:e0197522(Crossref)
8. Benitez Buelga C、Sanchez Barroso L、Gallardo M、Apellaániz Ruiz M、Inglada-Pérez L等（2015）化疗对散发性和家族性乳腺癌患者端粒长度的影响。乳腺癌Res治疗49: 385 - 394。
9. Quintela-Fandino M, Soberon N, Lluch A, Manso L, Calvo I, et al.(2017)早期乳腺癌中端粒严重短和化疗毒性。Oncotarget8: 21472 - 21482。(Crossref)
10. (2009)腔内B型乳腺癌患者的Ki67指数、HER2状态及预后。美国国家癌症研究所101: 736 - 750。(Crossref)
11. Symmans WF, Peintinger F, Hatzis C, Rajan R, Kuerer H，等(2007)测量残余乳腺癌负担预测新辅助化疗后的生存。临床肿瘤学杂志25日:4414 - 4422。(Crossref)
12. Easton DF, Pharoah PDP, Antoniou AC, Tischkowitz M, Tavtigian SV, et al.(2015)基因面板测序与乳腺癌风险预测。英国医学杂志372: 2243 - 2257。
13. Calvete O，Garcia Pavia P，Domínguez F，Mosteiro L，Pérez Cabornero L，et al.（2019）POT1和损伤反应故障触发心脏血管肉瘤中VEGF通路的体细胞激活突变。美国心脏协会8: e012875。(Crossref)