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摘要

摘要目的:龋齿是儿童最常见的慢性疾病。它是一种社会疾病，迫切需要寻找有效的预防方法。由于它的抑制作用变形链球菌在美国，木糖醇是一种很容易使用的补充剂。本研究的目的是测定0.01%木糖醇浓度对单种植物的影响变异链球菌生物膜的形成。

设计:临床菌株来自64例儿童，年龄为4.7±0.81岁。研究组包括患有龋齿的儿童和没有龋齿病变的患者。使用MALDI-TOF质谱仪鉴定分离株。研究了0.01%木糖醇对培养8、24、48和72 h后单株生物膜形成的影响。通过测定生物膜的生物量、微生物浓度和扫描电镜结构分析来评价所制备的生物膜。

结果:在每个时间点，木糖醇处理的生物膜生物量显著低于未处理木糖醇的两组儿童(p < 0.001)。两组木糖醇在48 h后CFU/mL生物膜形成能力均有统计学意义上的下降。

结论:木糖醇在低浓度下的抗生物膜功效，证明了它用于预防儿童龋齿

关键字

生物膜，儿童龋齿，变形链球菌，木糖醇

简介

根据世界卫生组织的说法，龋齿是一种源于体外的局部病理过程，导致牙釉质脱钙，牙齿硬组织破裂，从而形成蛀洞。龋齿是一种慢性传染病，发生在脱矿过程主要超过再矿化过程。这需要4个因素的共同作用:牙菌斑的适当组成——特别是形成生物膜的致龋细菌的存在变异链球菌例如，高碳水化合物(特别是单糖)的摄入，主要是由于致龋微生物的代谢转化为有机酸，宿主的牙齿组织对这些酸的敏感性，以及唾液防御机制的功能紊乱和时间[1-3]。

目前可以观察到龋齿的增长，这在很大程度上与饮食中单糖含量的增加有关。21世纪初，龋齿成为儿童最常见的慢性疾病[3]。一种特殊类型的龋齿是影响6岁以下儿童的幼儿龋齿(ECC)。口腔中存在龋病细菌的原因是由母亲传给孩子的传播(垂直传播)[4]。由于这一问题的规模，已采取了预防措施以获得最广泛的应用，其中氟化物预防是最常用的，并有证据证明其抗龋效果[5]。

这种预防的基础是患者定期使用外源性预防(牙膏、漱口水、凝胶、泡沫、清漆)和内源性预防(如饮用水、牛奶、盐的氟化)中使用的含氟牙膏[6,7]。近几十年来观察到的牙釉质氟中毒病例数量的增加，以及一些社会群体不愿使用氟化合物，因此需要采取其他非氟基龋齿预防方法，特别是在最年轻的年龄组。

研究人员正集中精力寻找和开发无氟预防龋齿的方法，这将补充氟在再矿化和抑制脱矿化中的活性。这些技术被用于牙膏和其他含有纳米羟基磷灰石、精氨酸、乳过氧化物酶系统和木糖醇的牙膏[2,8-10]。

木糖醇是一种五碳多元醇，自然存在于许多植物中，例如在桦树皮中，从桦树皮中获得用于食品[2]。和蔗糖一样，它有甜味，但与蔗糖不同的是，它不会被微生物代谢为有机酸[11]。这一事实使它能够作为一种非龋齿糖替代品。此外，其增加唾液流量的能力促进了再矿化过程，增加了其缓冲能力，并通过破坏牙菌斑中的粘附过程减少了致龋微生物的数量[2,11]。木糖醇是碳水化合物的唯一来源，变异链球菌无法增长[2]。细菌细胞吸收的木糖醇在其内部经过磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统(PTS)的磷酸化，形成木糖醇5-磷酸。该产物在细胞内积累，导致细胞液泡化。为了减少其含量，木糖醇5-磷酸在先前的去磷酸化后从细胞中被除去(图1) 一个无效循环剥夺了细胞获得的能量，从而抑制了细胞的生长。尽管如此，长期的曝光变异链球菌对木糖醇的耐受性导致对戊糖醇抗性菌株的选择，其特点是PTS活性低[2]。

图1所示。徒劳的木糖醇循环。磷酸烯醇化丙酮酸衍生(PEP)磷酸基是糖酵解的中间产物，通过细胞质EI和HPr酶转移到磷酸烯醇化丙酮酸依赖的磷酸转移酶(PTS)系统，然后允许木糖醇在细胞内运输同时磷酸化。该产物，5-磷酸木糖醇，不能作为能量来源，并积累，导致细菌细胞的液泡化。过量的木糖醇-5-磷酸在先前的去磷酸化后可以从细胞中去除，但这一过程需要能量

目前，木糖醇已被几十个国家批准用于预防龋齿。它以含片、口香糖、甜味剂、糖浆、牙膏和漱口水的形式使用。

在本研究中，我们提出低浓度木糖醇对临床菌株的生物膜形成能力的影响变异链球菌来自患有龋齿的儿童和没有龋齿损害的儿童。

材料和方法

学习小组

在接受准备的研究计划(2017年10月26日no 1072.6120.183.2017)后，在满足《赫尔辛基宣言》(2008)要求的基础上，亚盖尔隆大学生物伦理委员会批准了该研究方案。

该研究于2017年11月至2018年5月进行，包括64名大学儿科牙科诊所的患者。纳入研究的标准为2-6岁儿童的临床诊断龋齿。排除标准为:年龄小于2岁、6岁以上、糖尿病、在过去3个月内使用过某些药物(即抗生素、非甾体类抗炎药、皮质类固醇、维生素)、牙周炎、口腔黏膜的其他炎症变化，如念珠菌病，以及参与者/法定监护人退出参与研究。从研究合格参与者的斑块样本中分离出菌株。研究组为晚期ECC患儿33例(平均年龄4.7±0.73岁)，无龋患儿31例(平均年龄4.71±0.9岁)。

使用国际龋齿检测和评估系统(ICDAS)确定儿童的牙齿状况。研究组根据ICDAS分类(龋病)，将龋病患儿分为3-6组[12-14]。对照组为牙齿无龋变(ICDAS编码0)，早期龋变仅限于牙釉质，表现为不透明，符合ICDAS 1和2编码。(ICDAS代码分别为0和1-2)。

根据简化口腔卫生指数(OHI-S指数)[15]评估牙菌斑的存在和数量。

从研究参与者身上获得牙菌斑

用安装在牙科设备的无菌对角手机上的无菌刷刷半分钟，从所有牙齿表面提取牙菌斑。对于有恐牙症症状的儿童，医生将刷子放在与本机断开的低速末端，手动取下牙板。研究参与者的法定监护人被指导如何让孩子为考试做准备，研究团队概述的研究细节在他们同意之前被传递给他们。在上午9点至10点之间空腹采集斑块样本，然后用去离子水漱口，然后评估斑块的存在和数量(OHI-S)。在超声均质器(Hielscher UP50H)中对有牙菌斑的试管进行超声处理(30 s, 25%振幅)。随后，将得到的材料混合以获得均匀的悬浮液，并在微嗜气条件(10% CO)下培养₂)．在对数生长阶段收集细胞，用40mm磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤三次。在传统的培养方法中使用体积为50 μL的均匀菌悬液，使用选择性培养基，对每个培养样品进行3次10倍稀释，如我们之前的研究[16]所述。所得材料在85% N下培养₂,10%的公司₂, 5%的人啊₂37℃培养24-48 h。阳性样品的分界点为菌落数量> 10000个细胞/mL(图2)。表型鉴定依据血琼脂培养的菌落形态特征和溶血类型。依次制备牙菌斑稀释剂，接种在HLR-S (hlritz)培养基上。培养结束后，菌落以CFU/mL(菌落形成单位/mL)计数。

图2。测试方案:从儿童斑块收集到获得纯斑块变异链球菌隔离

孤立的描述变异链球菌物种

纯粹的隔离变异链球菌从HLR-S选择培养基中接种到添加5%羊血的血琼脂(TSA)，同时在krzykjicak规定的标准条件下生长，等．[16]。菌落的形态、溶血因子和对药物的敏感性在同一种细菌中表现出特定的异质性。进行革兰氏染色进行初步鉴别诊断，以便区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌种类。

识别

孤立的变异链球菌用分离/激光电离质谱飞行时间分析仪(MALDI-TOF MS)辅助质谱法鉴定物种。使用Bruker MALDI biotype 1.0分析仪评估核糖体蛋白谱。评分≥2.0的结果被认为是变异链球菌，而小于2.0分被认为是其他变异链球菌并没有被考虑在内。将这些结果与更新的商用Bruker数据库进行比较(图3)。

图3．的鉴定样本结果变异链球菌利用激光辅助解吸/电离飞行时间(MALDI- tof)，用质谱仪(Bruker Daltonik，德国)和MALDI biotype软件(v 3.1) (MALDI)从牙菌斑中分离出细菌菌株(biotype Library v 3.4;力量Daltonik)

制备均匀变异链球菌混合物

只有均匀悬浮液的临床菌株变异链球菌在研究中使用。个人变异链球菌菌落培养于微嗜气条件下(6 h, 37℃，10% CO)₂)加入5 mL BHI肉汤(心脏灌注肉汤，默克，达姆施塔特，德国)，最终浓度为0.01%木糖醇(来源:芬兰桦树)。变异链球菌在对数相生长期收集菌株，用PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，40 mM, pH 7.0)冲洗2次。用流式细胞术(LSRII, BD Immunoassay Systems, San Jose, CA, USA)每5分钟测定一次微生物生长过程。使用宽扩散(FSC)和横向光散射(SSC)门控丢弃细胞聚集体和团聚体。将对数生长期的细胞用于研究，在5 mL PBS中进行细菌培养过夜标准化，使细菌细胞浓度达到10⁶CFU /毫升。在上述规定的条件下，在BHI血液培养基上生长24小时后，使用MicroSpeak密度计测量得到的接种物的密度，并通过单菌落计数确认。

生物膜的传播

生物膜的传播是基于普遍接受的微滴度板模型来确定的，在该模型中，生物膜生长在井的底部和壁上，或生长在微滴度板[17]的井底部的载玻片上。变形链球菌选择临床菌株作为ECC的公认病原。生物膜的传播是在聚苯乙烯载玻片上进行的，垂直放置在24孔微量滴定板的底部，与我们之前研究[18]的协议一致。在0.01%木糖醇(培养基中0.66 mM)的存在下，评估生物膜中细菌的生长速率。结晶紫(CV)染色法测定生物膜[19]的生物量。

Monospecies生物膜

标准化的暂停变异链球菌细菌(密度为1×10⁶CFU变异链球菌以100 μL的量转入含有0.01%木糖醇的BHI肉汤的微量滴定板孔中。接种的细菌培养物在微嗜氧条件下(85% N₂,10%的公司₂, 5%的人啊₂)在37°C下浸泡90分钟，使微生物开始附着。随后，用PBS溶液洗了两次井。下阶段加入100 μL胎牛血清(FBS)诱导生物膜增殖。然后，在上述条件下孵育微板2小时。PBS冲洗2次，加入含0.01%木糖醇的BHI肉汤100 μL。阴性对照为100 μL BHI + 0.01%木糖醇无菌(中对照)。添加200 μL含0.01%木糖醇的BHI肉汤可保证生物膜的持续生长变异链球菌井。随后，将细菌板在37°C的微嗜氧条件下孵育8、24、48和72 h(图4)。

图4。研究设计流程图

生物膜中细菌计数的计算(CFU/mL)

在固定时间点用无菌R-PBS洗涤三次(孵育8、24、48、72小时后)后，使用超声波均质器(德国Teltow Hielscher UP50H 20秒，25%振幅)去除微量滴度板底部和壁上获得的生物膜。将得到的悬浮液配制成连续稀释液，用含有MSBS蔗糖的唾液酸杆菌肽琼脂接种100 μL变异链球菌．培养皿在嗜微空气条件下再培养48小时。计算培养菌落数(CFU/mL)。实验分三次重复进行。

生物膜biomass-determination

用CV染色(在生长8、24、48和72小时后)来测定产生的结构的生物量。在99%甲醇(Sigma-Aldrich, pozna华沙，波兰)中固定所得到的细菌膜结构，时间超过20分钟。除去上清液，在空气中干燥微量滴定板。用100 μL 0.1%结晶紫(CV)对干燥后的生物膜结构进行10分钟的染色。之后，用无菌PBS冲洗板孔三次除去CV。使用体积为200 μL的95%乙醇(Sigma-Aldrich, pozna华沙，波兰)释放生物膜结构中的染色剂。将125 μL的微量滴定板孔转入空白板孔。生产的生物膜的质量是根据540 nm处的吸光度测定的。实验在室温下的两个独立时间点进行。的生物膜曲线变异链球菌被绘制。

扫描电子显微镜(SEM)对生物膜形成的评价

根据我们之前的研究结果，将直径为13毫米的圆形初级载玻片(Scientific Agar, Stansted, UK)放置在24孔板的孔中，在8、24、48和72小时[16]后用于生物膜评估。

根据之前预定的生物膜开发时间表，将载片在1 mL 2.5%戊二醛中调节1小时，并在乙醇的连续稀释(50,70,80,90,95,100%)中脱水:每次稀释20分钟。最后，将载玻片在100%乙醇中干燥1小时，然后储存在CO中₂保温箱保存到第二天。将这种干燥的制剂放在铜盘上，用直径为0.2 μm (160 s, 40 mA)的AU 4N金线喷洒金。样品在20-25 kV的扫描电子显微镜(JEOL JSM-35CF, SEM, JEOL, Japan)下在Kraków大学医院耳鼻喉科临床实验室扫描电子显微镜实验室进行分析。

统计方法

在3.5.1版本的R环境中进行了统计分析(R Development Core Team, 2009)。用夏皮罗-威尔克检验检验变量分布的正态性。分析采用0.05的显著性水平。因此，所有低于0.05的p值均被解释为显著关系。两组定性变量值比较采用卡方检验。两组定量变量值的比较采用“学生t检验”(当变量在这些组中具有正态分布时)或“曼-惠特尼检验”(否则)。定量变量(CFU(对数转换)与光密度测量生物膜生物量的比较，OD)之间的相关性使用皮尔逊(当两者均为正态分布时)或斯皮尔曼相关系数(否则)进行分析。根据Hinkle提出的以下方案来解释关系强度:et al。[20]: |r|≥0.9 -极弱关系，0.7≤|r| <0.9 -强关系，0.5≤|r| <0.7 -中强关系，0.3≤|r| <0.5 -弱关系，|r| < 0.3 -极弱(可忽略)关系。

结果

研究设计

临床变形链球菌分离自64例龋病(早期牙釉质龋损及蛀牙)患儿和健康儿童的牙菌斑中。

将患者分为两组，研究组为晚期龋患儿(根据ICDAS分类编码3-6,n = 33)，对照组为牙齿未受龋损及牙釉质变色患儿(根据ICDAS分类编码0、1、2,n = 31)。

研究组中有27名女孩和37名男孩。研究组33例(女12例，男21例)，对照组31例(女15例，男16例)。研究组间无显著年龄相关差异，见表1。

表1。研究人群的特征

功能		腔(N = 33)	没有空腔(N = 31)	总计(N = 64)	p *
年龄	平均数±标准差	4.7±0.73	4.71±0.9	4.7±0.81	0.868
	中位数	5	5	5	NP
	四分位数	4 - 5	4 - 5	4 - 5
性	女孩	12 (36.36%)	15 (48.39%)	27 (42.19%)	0.471
	男孩	21 (63.64%)	16 (51.61%)	37 (57.81%)	chi2

* chi2 =卡方检验，NP =分布无正态性，非参数分析，Kruskal-Wallis检验

变异链球菌分离种的描述

变形链球菌菌株形成了如图5-1、5 - 2. a - d所示的生物膜。使用质谱仪(Bruker Daltonik, Germany)和MALDI Biotyper软件(v 3.1) (MALDI Biotyper库v 3.4, Bruker Daltonik)在示例图上展示鉴定结果(图3)。

图5 - 1。扫描电镜的图像。(A-D)单物种生物膜繁殖24 (A-D)和48小时(E-F)。在微嗜气条件下培养的单物种生物膜的结构₂10%， 37°C, pH 7.0)在含有所有必要生长因子的FBS中;在木糖醇底物(0.01%)中和不存在木糖醇底物(G-H)。原装放大倍数:400 ×， 2000 ×， 4000 ×， 6000 ×

图5 - 2。扫描电镜的图像。(A-D)变形链球菌培养48小时后的单种生物膜。在微嗜气条件下培养的单物种生物膜的结构₂10%， 37°C, pH 7.0)在含有所有必要生长因子的FBS中;在木糖醇底物(0.01%)中和不存在木糖醇底物(G-H)。原放大倍数:400 ×， 2000 ×

0.01%木糖醇对变形链球菌生物膜形成效果的评价

变异链球菌在8、24、48小时的CFU/mL数量差异有统计学意义，见表2和图6-7。在木糖醇的影响下，来自龋齿儿童的变形链球菌在培养24小时后形成了更大的生物膜(CFU/mL)，而与未使用木糖醇的菌株相比，这些菌株在培养48小时后生物膜的形成有统计学意义的减少(表2，图6)。在生物膜形成72小时后，这一趋势仍然存在，尽管这些差异不具有统计学意义。

表2。木糖醇通过测定变异链球菌菌落数量(CFU/mL)对生物膜形成能力的影响

研究小组
日志(CFU /毫升)				腔(N = 33)		空洞+木糖醇(N=33)		p *
8 h		平均数±标准差		6.26±0.04		6.27±0.05		0.315
		中位数		6.26		6.26		NP
		四分位数		6.23 - 6.28		6.26 - 6.3
24小时		平均数±标准差		6.43±0.04		6.45±0.04		0.001
		中位数		6.43		6.45		NP
		四分位数		6.41 - 6.45		6.41 - -6.48
48小时		平均数±标准差		7.54±0.06		7.52±0.07		0.001
		中位数		7.56		7.53		NP
		四分位数		7.53 - 7.58		7.51 - 7.57
72 h		平均数±标准差		8.64±0.04		8.63±0.05		0.617
		中位数		8.64		8.63		NP
		四分位数		8.61 - 8.66		8.6 - 8.67
对照组
日志(CFU /毫升)			没有空腔(N = 31)		无蛀牙+木糖醇(N=31)		p *
8 h	平均数±标准差		5.14±0.05		5.18±0.05		< 0.001
	中位数		5.15		5.2		NP
	四分位数		5.13 - 5.18		5.15 - 5.22
24小时	平均数±标准差		5.29±0.05		5.3±0.05		< 0.001
	中位数		5.28		5.28		NP
	四分位数		5.26 - 5.31		5.28 - 5.32
48小时	平均数±标准差		6.4±0.04		6.39±0.06		< 0.001
	中位数		6.4		6.4		NP
	四分位数		6.38 - 6.43		6.36 - 6.43
72 h	平均数±标准差		7.54±0.02		7.54±0.03		< 0.001
	中位数		7.53		7.54		NP
	四分位数		7.52 - 7.56		7.51 - 7.57

* P =组内正态分布，'学生t检验;组内分布无正态性，Mann-Whitney检验

图6。0.01%木糖醇对儿童龋病变异链球菌形成生物膜能力的影响

在木糖醇的作用下，从没有龋齿的儿童中分离出的变形链球菌在培养8和24小时后形成了更大的生物膜(CFU/mL)，而与没有木糖醇的菌株相比，这些菌株在48小时后形成的生物膜有统计学意义的减少(表2，图7)。

图7。0.01%木糖醇对从无龋儿童分离的变形链球菌形成生物膜能力的影响

实验组和对照组在8、24、48和72 h后变形链球菌生物膜总生物量的差异均有统计学意义(表3)。在龋齿儿童分离株(图8)和无龋齿儿童分离株(表3、图9)中，木糖醇影响的生物膜的生物量(OD)在所有时间点都低于不含木糖醇的生物膜。

表3。0.01%木糖醇对变形链球菌生物膜(OD)生物量的影响

研究小组
OD				腔(N = 33)	空洞+木糖醇(N=33)	p *
8 h		平均数±标准差		0.08±0.006	0.078±0.006	< 0.001
		中位数		0.079	0.077	NP
		四分位数		0.076 - 0.084	0.074 - 0.083
24小时		平均数±标准差		0.133±0.008	0.131±0.009	< 0.001
		中位数		0.135	0.133	NP
		四分位数		0.129 - 0.137	0.124 - 0.136
48小时		平均数±标准差		0.188±0.005	0.186±0.006	< 0.001
		中位数		0.187	0.184	NP
		四分位数		0.185 - 0.194	0.182 - 0.192
72 h		平均数±标准差		0.252±0.015	0.251±0.008	< 0.001
		中位数		0.254	0.249	NP
		四分位数		0.248 - 0.258	0.245 - 0.255
对照组
OD			没有空腔(N = 31)		无蛀牙+木糖醇(N=31)		p *
8 h	平均数±标准差		0.05±0.007		0.049±0.007		< 0.001
	中位数		0.048		0.047		NP
	四分位数		0.046 - 0.052		0.045 - 0.05
24小时	平均数±标准差		0.093±0.005		0.092±0.005		< 0.001
	中位数		0.093		0.092		P
	四分位数		0.091 - 0.095		0.09 - 0.094
48小时	平均数±标准差		0.142±0.009		0.14±0.009		< 0.001
	中位数		0.138		0.136		NP
	四分位数		0.136 - 0.147		0.134 - 0.144
72 h	平均数±标准差		0.195±0.014		0.19±0.01		< 0.001
	中位数		0.195		0.19		NP
	四分位数		0.186 - 0.2		0.184 - 0.198

* P =组内正态分布，Student’s t检验;组间分布无正态性，Mann Whitney检验

图8。0.01%木糖醇对儿童龋病变形链球菌形成生物膜能力的影响

图9。0.01%木糖醇对健康儿童变异链球菌形成生物膜能力的影响

木糖醇对变形链球菌单种生物膜形成的抑制作用如图6-8和图5所示。培养24小时后G-H扫描电镜图像。照片显示，在木糖醇处理和未处理的单物种生物膜中，数量和结构不同的细菌细胞。

讨论

研究表明，木糖醇本身的效果是不同的，取决于接触时间和浓度。牙齿脱矿形成的先决条件是牙菌斑中龋齿菌株的存在，而不仅仅是龋齿浮游菌株[21]。菌斑形成的抑制作用及致龋作用的评价变异链球菌定量分析木糖醇本身的抗膜活性是木糖醇在日常实践中作为抗龋保护的替代手段应用的前提。收集的数据表明，作为甜味剂出售的芬兰木糖醇即使在极低的浓度0.01%也显示出良好的抗生物膜活性。它是在在体外研究低浓度木糖醇对链球菌生长的影响，0.01%的木糖醇浓度可能有抑制作用，表明0.1%和1%的木糖醇浓度作用更明显[22,23]。在临床研究中，木糖醇主要作为口香糖或包衣片给患者服用，它显示出了减少计数的能力变异链球菌从患者中分离并减少牙菌斑质量[24-27]。我们的研究结果证实了使用木糖醇产品的合法性，由于其给药方法和甜味，木糖醇产品可能在最年轻的年龄组中特别有吸引力。事实上，如果菌斑形成的抑制依赖于菌株(它们的低或高敏感性)，与斑块数量极高的木糖醇未处理菌株相比，所有测试的菌株都显著支持预先形成的生物膜的减少。提出的结果证实了以前的发现，关于木糖醇使用的合法性和它在工业上作为一种防止食品中龋齿的手段在更大范围内应用的可能性。然而，还需要更多的研究来确定木糖醇对儿童的最低有效抑制浓度。

现有数据库中越来越多的研究试图确定木糖醇的潜在抗生物膜机制，这意味着这一主题尚未得到充分的探索。在大量已发表的研究中，作者解释了木糖醇的抑制作用，因为木糖醇能够减少致病的细胞外基质(EPS)的产生变异链球菌[28]。然而，据我们所知，我们的研究是为数不多的评估木糖醇抗生物膜效果的研究之一体外模型，从传染源分离的临床菌株。研究野生菌株，而不是像木糖醇那样的市售分离株是重要的，因为它允许对其效果进行实际评估，还考虑到文献中描述的木糖醇耐药效应的发生可能性，并在木糖醇消费者的情况下观察到。研究表明，木糖醇敏感菌株(XS)在木糖醇存在下形成的生物膜厚度和细菌密度均低于木糖醇耐药菌株(XR)。此外，两种菌株对链球菌的共聚集存在差异，链球菌是口腔中存在蔗糖的早期殖民者。这是由于XR变异链球菌不形成持久的生物膜，更容易滤出这些细菌，这就解释了为什么在这种结构中XR菌株的数量比XS的数量少变异链球菌以及为什么它更常出现在木糖醇习惯性消费者的唾液中[21,28]。我们的研究结果与其他研究团队的研究结果一致，证实了木糖醇的抗生物膜作用。还应该强调的是，其他多元醇或戊糖的抗生物膜效应也被描述过，如赤藓糖醇或核糖，这是许多其他研究的主题[21,22,29,30]。

在有关这一主题的文献中，有许多研究评估了补充木糖醇在预防儿童龋齿疾病方面的有效性。结果各不相同:从缺乏效果到显著减少龋齿。

米格罗姆et al。研究含木糖醇糖浆或木糖醇和山梨醇的混合物对年龄为15.0±2.7月龄为10.5±2.2月龄的儿童[31]的疗效。他表明，在乳牙长出期间，每天两次服用总剂量为8克的木糖醇，结果与对照组相比龋齿减少了70%。同样,詹et al。发现，6 - 35个月大的儿童清洁牙齿和牙龈一年，每天3次使用特殊木糖醇湿纸巾(每日剂量- 4.2 g木糖醇)除使用普通牙刷每天两次外，显示出与对照组[32]相比，新龋损的发展明显下降。Makinenet al。对6 - 36个月[33]的儿童，用棉签浸泡45%木糖醇溶液，每天1 - 2次，评估局部木糖醇给药的效果。每天涂抹在牙齿表面的木糖醇剂量约为13.5 g。与对照组相比，7岁儿童龋齿的发病率显著降低:龋齿风险降低约2倍(分别为2.1和4.0)。反过来,汉诺et al。同时给母亲(以口香糖的形式)和孩子(以药片的形式)每天3次，持续3个月，与对照组[34]相比，没有发现任何龋齿水平的差异。

在一项关于木糖醇在牙膏中对4-5岁儿童的心血管抑制作用的研究中，Chiet al。在使用含1400ppm氟化物和31%木糖醇的牙膏和使用含1450ppm氟化物和山梨醇[35]的牙膏的儿童中，也没有发现龋齿患病率有任何显著差异。Marghalani进行的五项随机对照试验分析et al。木糖醇对儿童[36]龋齿的减少有轻微作用。高剂量木糖醇(每天超过4克)的研究显示龋齿的适度减少，所有这些研究都具有显著的异质性和极低的证据质量[35]。

许多这样的研究证明，使用木糖醇作为初级龋齿预防方案的一部分，可以降低口腔中已经存在的龋齿细菌的水平，而没有龋齿症状。然而，还需要更多的研究来评估木糖醇在市售口腔护理产品中不同浓度氟的作用，以确定其抑制牙菌斑发展的临界浓度。

与我们早期观察到的蔗糖作为致龋糖相比，木糖醇没有发酵，所以它不能用于变异链球菌用于能源生产，但它也可以用作其他反应的营养底物，决定细菌在生物膜中的生存。抑制随后形成的生物膜年代(18岁,35岁,37岁,38)．变形链球菌受木糖醇使用浓度低的影响，如本研究中所观察到的。

通过将我们的结果与其他研究人员的结果进行比较，可以注意到在一些研究中，木糖醇在低浓度使用时也支持生物膜的形成能力。这一现象可能是由木糖醇成分中其他替代甜味剂的存在引起的，这些甜味剂会导致牙菌斑生长[39,40]。有人认为，食品中添加的一些成分，如玉米或纤维素粉-中国木糖醇成分，可能是造成这种效果的原因。

链球菌对木糖醇的使用需要进一步的研究，特别是在混合生物膜模型中反映口腔中普遍存在的情况。与传统食用糖相比，这种多元醇对致龋微生物的适应能力似乎不太可能，这给扩大潜在抗龋剂的名单带来了希望，特别是对最年轻的年龄组。

本研究提出的临床菌株检测项目有一些局限性，如缺乏对与之相互作用的所有口腔微生物的唾液效应变异链球菌这可能对牙釉质表面既有侵蚀作用又有保护作用。此外，为了更好地评估木糖醇对牙釉质表面的作用，我们计划进一步研究菌斑菌群、木糖醇和牙科广泛使用的各种填充材料之间的相互作用。

结论

作为传统糖的替代品出售的木糖醇已证实在低浓度下具有良好的抗生物膜性能，这表明其作为限制促进脱矿因素(龋齿疾病的细菌因素)的影响和支持再矿化过程的手段具有巨大潜力。本研究证实了木糖醇作为预防龋齿替代手段的有效性。

作者的贡献

w.k.， D.K.文章设计，测试设计，执行所有测试，统计分析，稿件撰写。a.j.， d.k.， m.s.， igg - m。， i.k, m.j - k。患者研究资格，临床资料收集，稿件撰写。部分测试的执行。流式细胞术分析的M.P.性能。m.m.， K.K.对选定文献和手稿写作的回顾。W.K.编辑修改。所有作者已阅读并认可最终文章。

确认

作者要感谢波兰克拉科夫雅盖尔隆大学医学院医学诊断学系主任Ryszard drowd耶扎教授提供了生化实验室来进行该研究的生化部分。我们要感谢波兰克拉科夫雅格伦大学医学院药物微生物学系主任eltbbieta Karczewska教授提供了微生物实验室来进行研究的微生物部分。作者要感谢波兰克拉科夫雅盖尔尼安大学医学院耳鼻咽喉科主任Jacek skadzieska教授和克拉科夫雅盖尔尼安大学医学院耳鼻咽喉科Katarzyna Zagórska-Świeży女士，感谢他们提供扫描电子显微镜来进行扫描电子显微镜部分的研究。

资金

本研究得到了雅盖尔尼安大学[项目编号K/ZDS/007071, K/ZDS/007911, K/ZDS/007912, K/ZDS/007910]的支持。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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