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抽象的

研究人员比较了在春季放牧、添加和不添加饲粮(ERME) 6周前后马和小马粪便中挥发性有机化合物(VOCs)的变化。该补品来自麦芽，含有降解复杂碳水化合物的酶，包括淀粉酶、麦芽糖酶、葡聚糖酶和果糖酶。采用离子流管质谱(SIFT-MS)对粪便样品进行挥发性有机化合物(VOCs)分析，结果表明，春季牧草饲喂和饲粮添加对粪便微生物群落有不同程度的影响。因此，马肠道微生物组(EGM)的组成可能反映了膳食成分，包括牧草和补充剂;任何代谢组学方法都应该考虑到这一点，因为EGM可能对糖尿病和肥胖等生理参数有调节作用。

介绍

代谢组学是一项强大的技术，它允许对生物流体或组织中检测到的多种代谢物的相对重要性进行复杂的评估。挥发性粪便代谢物组是指在粪便样品上方的顶空中发现的低分子量挥发性代谢物，可以使用气相色谱或液相色谱或核磁共振(NMR)结合质谱等技术进行分析。代谢谱从内在(遗传学，蛋白质表达)和环境输入(饮食，肠道微生物群)两方面获取信息，提供对可能作用于有机体的多种因素的影响的概述。这项技术已经被证明在揭示哺乳动物宿主及其肠道微生物群之间复杂的代谢相互作用方面非常有效[1-4]。

体液中的挥发性有机化合物(VOCs)已被证明在人类疾病中是不同的，粪便中VOCs的变化被用作肠道微生物组变化的替代标记物。在人类中，这可能因饮食而异，但对等效马肠道微生物群(EGM)的了解相对较少。马的口粮通常是固定的，加上不同数量的商业可用的营养物质。本研究旨在研究放牧马/小马粪便代谢组中发现的VOCs，并确定其是否可以通过牧草变化或添加富含酶的膳食补充剂来调节。因此，一项干预研究在春天对45只在英格兰东部一个保护区放牧的动物进行了研究。众所周知，随着新草的出现，放牧的性质会发生变化。研究人员还研究了一种商业化的麦芽基富酶补充剂(ERME)，以确定其对EGM的影响。

方法

研究方案

在添加ERME前和添加6周后以非侵入方式采集粪便样本，同时在春季让马/小马在牧场上饲养6周。挥发性粪便代谢组的特征是使用选择离子流动管-质谱(筛-质谱)结合多元数据分析。

研究总体和抽样

在红翼保护区，诺福克的兽医官选择了45匹马和矮种马作为研究对象。这是在春天从5月初到6月中旬进行的，选择的时间是为了确定吃新草的效果。利用ERME作为膳食补充剂[4]，根据先前的数据进行了功率计算。根据p<0.05的显著性和0.8的乘数，所需样本量为18，每组随机抽取至少20匹马。研究人群的选择是基于以下的纳入和排除标准。纳入标准包括:>2岁，根据兽医官的临床检查，没有疾病的物理证据，>在避难所居住1年。排除标准包括服用任何药物，怀孕和没有完整的男性。马被随机分配到治疗组或对照组。共有36匹骟马和9匹母马，年龄在4到23岁之间。品种代表的范围很广，包括设得兰矮种马，威尔士矮种马，Cob类型和纯种马/纯种马杂交类型。 Horses remained under the care of the sanctuary throughout the study. All were allowed free access to grazing twenty-four hours a day. They were moved to a new pasture 7 days prior to starting the study and remained on this pasture throughout the entire study. There was no specific difference between pastures before and after commencement of the study. All horses were free from concurrent medical treatment for the duration of the study. All horses in the study population were assessed for body condition score and cresty neck score prior to supplementation and after six weeks supplementation. A 30 g faecal sample was collected once before supplementation and once after six weeks of twice-daily supplementation in feed. Sampling commenced approximately three hours after morning feeding and took approximately 3 hours on each occasion for all horses to pass faeces. Freshly voided faeces were collected into polyethylene sample containers and kept refrigerated before transport and transfer into a freezer at a temperature of -80°C. Horses were excluded from the study if they received any medication during the study or if they were unavailable for sampling. Sampling and metadata collection were carried out under University of Cambridge ethics approval CR83 with the informed consent of the sanctuary. The horses were randomly divided into two groups: 21 controls (group C) and 24 test animals (group D). All horses were fed a standard diet of 200 grams of a high fibre ration, Dengie Hi-Fi Lite^b， (DE 7.5 MJ/kg)，添加维生素和矿物质，每天两次。试验组(D)给予300毫升ERME，每天两次，持续6周，由24匹5 - 23岁(中位年龄8岁)的马和小马组成(22匹骟马，2匹母马)。C组(对照组)由21匹马和小马组成(阉马15匹，母马6匹)，年龄4 ~ 18岁(中位年龄7.5岁)。

样品制备

采用选择性离子流动管-质谱联用技术(SIFT-MS)测定马粪顶空中挥发性有机化合物(VOCs)。粪便样本从-80°C冰箱中取出并彻底解冻。确切地说，每个样品称重出来5克，并放入由纳洛芬管构建的样品袋^c．袋子中充满零级(无烃)空气，然后用Swagelok配件密封，然后放在40°C的培养箱中45分钟，以增加化合物挥发。孵育后，样品通过加热的取样毛细管附在筛-质谱上。前驱体离子通过微波放电在空气/水混合物中生成，然后通过上游四极质量过滤器进行选择。选定前体离子(H_3.O⁺,没有⁺或O.₂⁺)，然后注入氦气载气，并通过一个流动管，通过加热的毛细管将样品引入其中。前驱体离子/样品反应产生的产物离子在被检测和计数之前被下游的四极质量过滤器分离。装好样品袋后，SIFT-MS依次用三种前体离子对样品进行检测:H_3.O⁺,没有⁺和O₂⁺．从质量对电荷比（M / Z）10至140分析光谱，每个扫描持续为每个离子为5秒的6个循环设定的时间。用每个测试的样品重复该过程。然后将数据转移到计算机上以分析每个样品中存在的可能化合物的范围。

多元数据分析

使用Matlab R2011a (Mathworks Inc, USA)对获取的数据进行预处理和分析，并结合PLS Toolbox v3.5 (Eigenvector Research Inc.， USA)中的函数。使用主成分分析(PCA)的探索性数据分析也被用来观察任何趋势和在各自的数据集中的分组，并识别任何孤立的样本。这些都是通过视觉识别和霍特林T²测试(对学生t测试的多元扩展)。一旦识别出来，它们就会被移除。特征选择的效果也通过扫描显著不同的峰(m/z峰为SIFT-MS)的数据来评估。比较如下:

• 第0周，C组和D组
• 第6周，C组和D组
• C组在第0周和第6周
• D组在第0周和第6周

采用的统计方法为参数Student T检验和非参数Wilcoxon T检验。

通过多变量分类来执行模式识别。评估不同的建模算法，例如使用径向基函数（RBF）和线性内核和人工神经网络（ANNS）的局部最小二乘判别分析（PLS-DA）[5]，支持向量机（SVM）和通过概率神经网络[6]。通过跨模型验证进行评估和优化模型，该横跨模型验证通过休假 - 单交叉验证（LOO-CV）并入优化。在所有情况下，进行了150个评估，导致准确性的手段（总体正确分类：％CC），特异性（％规格），灵敏度（％SENS）和接收器操作特征（AUROC）曲线下的区域。还进行排列测试以确保报告的准确性确实有统计学意义，而不是由于机会。通过统计Z-TEST来观察两个过程的分布，并通过统计Z-TEST评估显着性，其比较了两个分布的手段（假设是正常的）。更接近50％的精度（％CC）显示出2组之间的区别较差，而更接近100％的精度（％CC）显示出2组之间的区别。

结果

喂养ERME的牧马和矮马24匹，对照组21匹。在对照组(C)中，使用Henneke量表的身体状况评分(BCS)在测试期开始和结束时的中位数分别为6/9和6/9。冠状颈评分(CNS)中位数为测试前2.5/5，测试后3/5。在试验组(D)中，BCS的中位数为7/9，补充前和补充后分别为7/9。中枢神经系统在补充前和补充后的中位数分别为3/5和3/5。一匹马由于治疗角膜溃疡而被从对照组中移除。保护区的工作人员每天对所有动物进行两次评估，他们接受过识别常见疾病迹象的培训。在研究过程中，没有动物出现蹄叶炎或肠绞痛。挥发性粪便代谢组以有机酸、醇类和酮类为主，在研究开始时两组之间没有显著差异(60.5%)。但在6周后，两组的挥发性粪便代谢组均有显著变化，表明春牧和ERME均对挥发性粪便代谢组有影响，但方式不同。 After 6 weeks on Spring pasture, group C (controls) had a markedly altered volatile metabolome (95.0%) from that at week 0. Group D (test group fed ERME) also had a markedly altered volatile metabolome from that at week 0 (78.7%). The two groups were significantly different from each other, suggesting the two groups were affected differently (80.4%); the means of the two distributions were significantly different and thus not due to chance at the 95% confidence interval (p<0.05). Table 1 shows the respective specificities, sensitivities and AUROC (area under the receiver operating characteristic) curve. Table 2 shows the influential m/z ions identified from the PLS-DA loadings as likely to be contributing to the percent correctly classified along with the suggested compounds. Ions can arise from more than one compound (isotopologues); in this table, only the most likely tentative identifications of compounds are given. Both control and test groups show agreement in the form of propanol at m/z 43 (either 1-or 2-propanol which SIFT-MS currently cannot distinguish), methanol at m/z 51, acetone at m/z 77 and butyric acid at m/z 107. However, distinctive compounds are also suggested such as isoprene at m/z 69 (which may be present alongside methanol also at m/z 69–yet other compounds may also produce an ion at m/z 69), and the ion m/z 93 (which may be identified as toluene or propionic acid) in the Control group, and acetic acid at m/z 61), pentanoic acid or methyl butyrate both at m/z 103 in the Test group. The analysis has identified VOCs (e.g. propanol and methanol), which differentiate between horses and ponies pre- and post-supplementation. The median abundance for methanol, isoprene and acetone is significantly reduced after six weeks on Spring pasture, which indicates a potential change in fermentation processes in the gut. Abundances of methanol and acetone are also reduced post supplementation with ERME but the difference is not statistically significant.

讨论

本研究表明，春季牧场的六周和两次与ERME的补充既有明显改变牧草/小马的粪便的概况，每种情况都不同。在牧草和小马的马粪粪便顶部检测到的VOC由酸和醇主导，以及酯的表观存在，可能来自碳水化合物的细菌消化，包括膳食纤维[4]。鉴定为重要的化合物是粪便顶部空间中的预期，并包括酸，醇和酯，但它们在试验样品中以统计学上显着不同的浓度存在。因此，肠道中存在的化合物存在差异，并且由于这些最有可能从细菌活性产生，这反映了肠细菌的相对量或比例的变化。对照组和试验组的整体分类准确性（％CC）分别为95.0％和78.7％。这种差异强烈表明，春季牧场和ERME的应用都改变了粪便代谢物。这是通过在第0周和第6周的第0周的比较进一步支持这一点。在第0周（60.5％）之前，在任何饮食变化之前，任何差异都可能归因于马中的运动间变异，例如性别，年龄，之前的年龄牧场差异，天气和其他因素。在第6周，ERME似乎改变了粪便代谢物（80.4％），现在是马匹之间更加一致。雄伟et al。[4]使用了相同的ERME补充剂(其中含有多种水解复杂碳水化合物的酶)，同样在纯种马的粪便挥发性VOCs中发现了变化。富含易水解碳水化合物(通常以谷物形式存在)的饮食通常用于提供快速体力活动所需的能量，但广泛认为与肠道疾病风险增加有关，因为已知马的胰腺和小肠淀粉酶产量较低，与其他物种[7]相比。外源膳食淀粉酶已被证明可以增强马的碳水化合物消化[8]。雄伟et al。[4]提示，与ERME相关的粪便代谢组的变化可能是对饲粮碳水化合物盲肠前消化增强的反应。这将减少和改变可用于盲肠发酵的底物，从而改变微生物群。有趣的是，醋酸盐在接受ERME的实验组中显著下降，而在对照组中则没有。同样，这与纯种赛马[4]的效果相似，表明ERME可能通过延长肠道转运时间，使SCFAs的结肠吸收更好。随着放牧质量的变化，粪便代谢组也发生了变化。牧草非结构性碳水化合物(non-structural carbohydrate, NSC)的日变化和季节变化均为[9]，且在春季晚些时候最高，与本研究同期进行[10]。这可能解释了对照组在6周期间检测到的VOCs的显著变化，并与蹄叶炎的发展有关，已知蹄叶炎至少部分是由于放牧春草。

粪便中的VOCs和VOC与人和马的几种肠道疾病有关[11-14]。马特异性代谢组学研究包括使用早期时间点蹄叶炎[13]低聚果糖超载模型的血浆核磁共振波谱研究，以及对[15]绞痛马挥发性粪便代谢组的研究。然而，关于标准牧草中健康非纯种马EGM影响因素的研究还很少。目前的人类研究表明，肠道微生物组参与了糖尿病和肥胖症等临床疾病的调节[16,17];试图将EGM与马[18]的类似情况联系起来，将需要仔细控制饮食和饮食成分，以获得有意义的结果。

制造商的地址

^一个Muntons, Stowmarket，萨福克，英国。

^b邓迪Hi-Fi，埃塞克斯，英国。

^cKalle,德国。

参考文献

1. Jacobs DM, Deltimple N, van Velzen E, van Dorsten FA, Bingham M, et al.(2008)(1)粪便H NMR代谢物谱作为评估营养对人类微生物组影响的工具。核磁共振生物医学21日:615 - 626。(Crossref)
2. Turnbaugh PJ，Gordon Ji（2008）邀请偏见的偏见和代谢组学。细胞134: 708 - 713。(Crossref)
3. 基于1h -核磁共振波谱分析的纯种马代谢组的主要成分:常见生物体液的代谢图谱。马兽医J47: 721 - 730。(Crossref)
4. Proudman CJ, Hunter JO, Darby AC, Escalona E, Batty C, et al.(2015)纯种马粪便代谢组和微生物组特征。马兽医J47: 580 - 586。(Crossref)
5. Barker M, Rayens W(2003)偏最小二乘鉴别方法。J Chemom.17: 166 - 173。
6. Hagan MT, Demuth HB, Beale M(1996)神经网络设计。波士顿国际汤普森出版公司。
7. Kienzle E, Radicke E, Landes E, Kleffken D, Illenseer M, et al.(1994)马胃肠道淀粉酶活性。J动物生理学动物营养72: 234 - 241。
8. Richards N, Choct T, Hinch GN, Rowe JB(2004)外源淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶对提高马小肠淀粉消化的检验。畜牧饲料科技114: 295 - 305。
9. (1999)黑麦草果聚糖浓度的季节和日变化对蹄叶炎易感马放牧管理的影响。第16届马营养与生理学会研讨会论文集，6月2-5日，北卡罗来纳州罗利。页:258 - 259。
10. 牧场非结构性碳水化合物与马蹄叶炎。J减轻136: 2099 - 2102年代。(Crossref)
11. Cauchi M，Fowler DP，Walton C，Turner C，Jia W等人。（2014）将气相色谱质谱（GC-MS）与多变量分类相结合施用胃肠道疾病的多元分类。代谢组学10: 1113 - 1120。
12. Walton C, Fowler DP, Turner C, Jia W, Whitehead RN, et al.(2013)慢性胃肠道疾病细菌源性挥发性有机物分析。充气肠道19日:2069 - 2078。(Crossref)
13. Keller MD, Pollitt CC, Marx UC(2011)基于核磁共振的代谢组学研究早期时间点蹄叶炎的低聚果糖超载模型。马兽医J43: 737 - 743。(Crossref)
14. Probert CS, Reade S, Ahmed I(2014)粪便挥发性有机物:诊断IBD的一种新颖、廉价的方法?专家Rev Clin Immunol10: 1129 - 1131。(Crossref)
15. Turner C, Batty C, Escalona E, Hunter JO, Proudman C(2013)使用SIFT-MS分析马的肠绞痛粪便挥发性代谢组:初步研究。咕咕叫肛门化学9: 614 - 621。
16. CANI PD（2018）人体肠道微生物组：希望，威胁和承诺。胆量67: 1716 - 1725。(Crossref)
17. mejnikman AS, Gerdes VE, Nieuwdorp M, Herrema H(2018)评估人类肥胖和糖尿病中肠道微生物群的因果关系。endocr rev.39：133-153。(Crossref)
18. Mshelia ES, Adamu L, Wakil Y, Turaki UA, Gulani IA, et al.(2018)迈杜古里及其周围地区马的肠道微生物群、性别、年龄和身体状况得分之间的关联。活细胞Pathog118: 81 - 86。(Crossref)