这项研究是基于细胞、分子和原子水平的综合方法进行的。因此,我们的目标是开发两种DNA传感器来检测阿尔茨海默病相关的β-淀粉样蛋白在血液中的合成及分子生物学研究。DNA传感器是用大肠杆菌或酿酒酵母使用基因序列,并在与人血浆混合时使用荧光检测器进行荧光表达单位(FSU)测试。利用光子拉曼技术对该淀粉样蛋白传感器进行了验证,并利用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化蛋白进行了分析,并利用不同尺寸的Macrosep Advance离心装置对该产品进行了验证。通过标记荧光染料偶联的荧光靶分子,增强了检测强度。
荧光结果与临床和MRI结果相当。DNA传感器能够检测不同类型患者的β-淀粉样蛋白。结果还与患者的血糖水平相关。金属对淀粉样蛋白表达的影响也通过ELISA和Western Blot检测得到证实。由于荧光强度与β-淀粉样蛋白水平高度相关,这些结果被用于根据阿尔茨海默氏症的严重程度对患者进行分类(即组1:阿尔茨海默氏症诊断;Group2: Pre-Alzheimer的;组3:正常)、临床医学症状(如记忆丧失、认知障碍,如精神定向障碍和/或精神混乱)和MRI结果。统计分析表明,根据所选择的三个参数,可以很好地进行分组。第1组荧光总平均值最高,第2组次之,第3组荧光总平均值最低。性别似乎是疾病发病时的一个相关因素。
这些结果表明使用这种方法早期检测阿尔茨海默病的优势以及金属对触发β-淀粉样蛋白表达的重要性。
老年痴呆症,淀粉样蛋白,糖尿病,DNA传感器,血糖,合成生物学,光子学,拉曼。
淀粉样蛋白等蛋白质是通过SDS-PAGE凝胶电泳等常规分子量方法鉴定的[1]。蛋白质主要通过分子量来识别,可以通过常规方法以及使用Macrosep离心装置进行鉴定和定量[2]。除了凝胶电泳,Western Blot和ELISA技术是可靠的分子方法来分析蛋白质,如淀粉样蛋白或光子性拉曼光谱。其他作者已经证明了活细胞的光学行为与光子发射之间的关系,表明活生物体和/或细胞受到宽光谱光子强度的激发[3]。基于光子性的拉曼等技术已被用于检测淀粉样蛋白。拉曼散射是一种双光子过程,以激光束为光源,分子与光相互作用,以发射光子与振动分子交换能量[4]。因此,增强强度可以更好地检测靶分子,如β-淀粉样蛋白。
其他光子学技术如zetasizer也被用于淀粉样蛋白的鉴定[5][6]。此外,先前的研究也报道了金属在大脑中的影响与阿尔茨海默病有关[7]。
DNA传感器的构建
采用标准实验实验室方案,将CloneTex Systems, Inc (Austin, TX)合成的DNA序列组装在pBSKII或pYES2质粒中[8-10]。细菌或酵母的DNA传感器都是通过特定引物的定点克隆构建的,如下所述。然而,只有酵母DNA传感器被用于检测与阿尔茨海默氏症相关的患者血液中的β-淀粉样蛋白(图1)在体外ELISA法测定β-淀粉样蛋白。
图1。β -淀粉样蛋白传感器结构示意图。图中显示了β -淀粉样蛋白传感器DNA结构的方向、位置和大小,从构建质粒中的T7启动子、淀粉样蛋白前体蛋白、核糖体开关TC适体、TonB和黄色报告蛋白序列开始
DNA结构的制备
DNA结构由本文描述的遗传成分组成,并组装在质粒载体(即pBSKII或pYES2)中。在GenBank中鉴定出具有所需特性的基因和/或蛋白质序列。构建的DNA具有相似的基因部分,序列大小从747到1300 bp不等。这些包括不同的基因序列,具有各自的加入号:淀粉样蛋白前体蛋白基因(编号:NM_201414.2)和一个TonB基因(no。ACB93044.1)。在DNA构建体中插入其他遗传部分包括T7启动子基因、铁启动子基因(no.;CP015495.1),黄色荧光报告蛋白(no.;JQ394803.1)和核糖开关TC适配体(编号:JQ394803.1)。D26134.1)。 However, the transferrin protein was added to the yeast DNA construct. These genetic parts included restriction sites for ease of insertion into plasmid.
该过程结合分子生物学和合成生物学的标准实验实验室方法进行[11]。每个基因用基因特异性引物进行PCR扩增,并在需要的地方添加限制性位点。
将基因部分克隆到细菌或酵母装置中
将遗传部分克隆到细菌和酵母装置中进行如下操作。利用基因特异性引物,通过PCR扩增单个基因序列。按照Promega (Madison, WI)提供的方案从质粒中切除基因。切除的片段在结扎前用琼脂糖凝胶电泳纯化。
结扎过程
然后根据说明书和酶供应商(Promega, Madison, WI)提供的试剂,用HindIII限制性内切酶消化已经含有淀粉样蛋白前体蛋白基因的pBSKII或pYES2质粒。按照Promega (Madison, WI)的方案,将每端含有HindIII限制性位点的完整插入物连接到质粒上。将反应混合物放入电磁室进行结扎和/或转化[1]并承受强度为0.35高斯的小电流(900 mA)磁场。凝胶电泳证实了插入物的成功构建和插入物与质粒的连接[10]。
宿主细胞的纯化和转化
主管大肠杆菌细胞(One Shot, Top 10, Invitrogen)或酵母细胞(INVSc1酵母宿主菌株,Invitrogen)使用供应商提供的修改版本的方案,用本文描述的DNA结构进行转化,[11]。一个完全组装的酿酒酵母将设备亚克隆到pYES2载体中。
使用20/20发光计(Promega)通过存在的菌落数量来确定DNA表达和转化效果。质粒DNA提取纯化、PCR和凝胶电泳也证实了转化。
合成淀粉样蛋白标准品的构建
合成淀粉样蛋白标准品的构建由Clonetex Systems, Inc, Austin, TX, USA进行。可溶性淀粉样蛋白前体蛋白由Clonetex Systems Inc, Austin, Tx, USA提供。对人淀粉样蛋白前体304-612氨基酸对应的cDNA进行密码子优化合成,以6xHis-tag分泌的人sAPPα重组蛋白的形式表达大肠杆菌。简单地将合成基因克隆到pET28A表达载体上,并在BL21 (DE3)菌株中表达重组sAPPα蛋白大肠杆菌。用Ni-Sepharose柱亲和纯化表达蛋白。
金属离子对β-淀粉样蛋白表达的影响
金属离子对DNA β-淀粉样蛋白细菌传感器生长和细菌传感器产生β-淀粉样蛋白的影响如下所示。
ELISA法测定β-淀粉样蛋白
一种文化大肠杆菌用DNA β-淀粉样蛋白装置在pBSK II中转化,提取β-淀粉样蛋白。在提取蛋白质之前,按照标准程序[8]和Open Biotechnology蛋白质提取试剂盒(ThermoFisher, Waltham, MA)提供的方案进行细胞颗粒的生产。DNA细菌装置细胞在不同浓度的LB +氨苄西林液体培养基中37℃培养7小时和4小时。550-600 nm吸光度测定细胞生长情况。接下来,将培养的细胞离心以获得最终的颗粒,使用Open Biotechnology蛋白提取试剂盒(ThermoFisher, Waltham, MA)分离β-淀粉样蛋白。最后,用溶菌酶对颗粒进行裂解,并对均质液进行不同温度的处理。
采用Alpha Diagnostic International β-淀粉样蛋白1-42 ELISA试剂盒(San Antonio, TX)测定β-淀粉样蛋白产生板,并与不同浓度的β-淀粉样蛋白标准品进行比较。在不同的酶联免疫吸附孔中测定了有金属或不含金属的DNA β-淀粉样蛋白装置培养中提取的β-淀粉样蛋白的浓度。样品的颜色强度也用来测定淀粉样蛋白的浓度,颜色强度越高,蛋白质的浓度越高。图2提供了有或没有金属离子的β-淀粉样蛋白的ELISA检测结果。
图2。含或不含金属离子的β-淀粉样蛋白ELISA检测。ELISA法显示β-淀粉样蛋白在不同金属离子(Cu2 +、铁2 +、锌2 +和艾尔2 +)与控件(未转换)相比大肠杆菌细胞)
western blot法测定患者血液中β-淀粉样蛋白含量
采用标准方法从患者中鉴定β-淀粉样蛋白[8]。在两份人血浆样品中定量蛋白质,并调整体积,使每个样品的蛋白质产量为2 mg/mL,其中等量的缓冲液作为对照。另一份人血浆样品也进行了分析,但由于该样品在初始制备过程中缺乏均匀性,体积小,稠度低,因此此结果未在此显示。在Laemmle样品缓冲液中分别取15µg/mL和30µg/mL的等量蛋白质,然后在8-16%梯度的sds -聚丙烯酰胺凝胶上电泳。本文仅给出30µg/mL蛋白质样品的结果。将蛋白转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上,用抗小鼠β-淀粉样蛋白单克隆抗体(AMY-33)进行印迹。印迹膜在TBST缓冲液中进行一系列洗涤步骤。抗原-抗体复合物使用增强化学发光(ECL-2, Thermo Scientific, Rockford, CA)进行可视化。图3为患者血浆β-淀粉样蛋白的Western Blot检测结果。对健康患者和确诊阿尔茨海默病患者血浆混合提取的DNA淀粉样酵母传感器进行了类似的Western Blot分析。
图3。一个。western blot法检测患者血浆中-淀粉样蛋白。该图显示了与具有低β -淀粉样蛋白荧光的健康患者相比,具有高-淀粉样蛋白荧光并临床诊断为阿尔茨海默病症状的患者样品中-淀粉样蛋白特异性带。缓冲(控制)。2.-淀粉样蛋白荧光和阿尔茨海默病临床症状较高的患者;患者-淀粉样蛋白荧光低,无临床诊断为阿尔茨海默病。患者样本(车道2和车道3)为30µg/车道的血浆样本。一抗(小鼠-淀粉样蛋白单克隆抗体(AMY-33) Cat# 13-0100Z Thermofisher) 2µg/mL, 2hr RTP。次级:山羊抗Mm - hrp - 1:5K稀释。B。为DNA淀粉样酵母提取物与健康患者(第一车道)和诊断为阿尔茨海默氏症的患者(第二车道)血浆的混合物中-淀粉样蛋白的Western Blot检测,与标准STD(第三车道)进行比较。该图显示了诊断为阿尔茨海默氏症的患者样本(第2条)的深色带,而来自健康患者的样本显示了较亮的带。因此,DNA淀粉样蛋白传感器提取物与血浆的混合物在诊断为阿尔茨海默氏症的患者中显示出比健康人更高的蛋白质表达
从酵母淀粉样细胞提取DNA的装置
从培养3天的酵母细胞装置中提取/裂解/重组蛋白,经过超声、过滤(< 3微米)和冻干处理。该提取物与血浆按3:1比例混合。
采用拉曼光谱(RENISHAW INVIA共聚焦拉曼光谱仪,英国)检测各组患者血浆中淀粉样蛋白的存在。对每个血浆样品及其相应的DNA淀粉样蛋白传感器加血浆的混合物进行分析。拉曼光谱分析每组非共轭样品2个重复。血浆样品100 ~ 200 mL用于拉曼分析,并与淀粉样蛋白标准进行比较。激光波长为532 nm ~ 785nm,激光强度为10%。测量参数为样品强度和拉曼位移(1/cm)。根据上述参数得到结果。拉曼强度受光源强度、光源波长的1/ lamb ^4、样品的浓度或分子数以及样品的散射特性的影响。所有光谱都是用785 nm激发激光器收集的,曝光时间为10秒,使用1 mm石英试管在25下进行4次采集oC.使用Bio-Rad KNOWITALL INFORMATICS SYSTEMS 2018对光谱进行处理和分析。
测定DNA淀粉样蛋白传感器的粒径
用500 mmol Tris稀释DNA淀粉样蛋白培养物中纯化的淀粉样蛋白提取物。浓度是通过在55度的烤箱中干燥溶液来测量的oC 24小时。测定上清液浓度为76.25mg/mL,分别配制1x、2x和5x溶液,加入500 mMol Tris进行测定。接下来,将700µL的溶液样品转移到石英试管中,放置在英国Malvern Zetasizer Nano中,以测定蛋白质的分子量。Zetasizer仪器能够使用动态光散射测量从小于一纳米到几微米的颗粒和分子尺寸;利用电泳光散射研究Zeta电位和电泳迁移率用静态光散射计算分子质量。
离心装置和凝胶电泳法测定分子量
从DNA淀粉样蛋白转化酵母培养物中提取的提取物用于测定淀粉样蛋白的分子量。在细菌中产生的淀粉样前体蛋白片段(45 kDa)(见上文)被用作对照参考。DNA淀粉样酵母培养物的提取经过不同的步骤,包括在9000 rpm下离心190分钟,在无核酸酶的去离子水中重悬球,然后在不同的周期超声和离心。将离心后的上清液分别过滤0.2µm或0.45µm,用于DNA淀粉样菌培养或DNA淀粉样酵母培养。这种含有淀粉样蛋白的提取物经过了纯化。
亲和层析纯化阿尔茨海默氏装置蛋白
蛋白纯度采用12% SDS-PAGE凝胶电泳法测定。按照标准方法(Sambrook and Russel, 2001)制备SDS-PAGE凝胶。丙烯酰胺12% / Bis溶液(Plus One GE)与Tris-HCl、0.1% SDS、过硫酸铵(APS)、四亚甲基乙二胺(TEMED)混合。堆叠凝胶采用5%丙烯酰胺/ Bis溶液(Plus One GE), 125 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 0.05% APS, 0.1% TEMED。电泳在含有1x Tris-甘氨酸(25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM甘氨酸)和0.1% SDS的流动缓冲液中进行。运行工况为70 ~ 80 V, 400 mA, 30W。
根据供应商的说明,用comasassie Brilliant Blue R-250 (Amresco)染料对凝胶染色后,蛋白质可见。观察凝胶上表达的蛋白条带,并以分子量阶梯作为标准参比测定分子量。洗脱的部分使用Macrosep Advance离心30 kDa MWCO和100 kDa Omega (Pall Corporation)在2300 rpm下在4◦C下浓缩2小时。
荧光增强,利用非放射性标记通过分子偶联
该方法采用标记试剂盒方案(NHS标记方案,使用氨基生物分子Lumiprobe USA的酯),其中包括Cy3染料来标记淀粉样蛋白的特定侧。进行以下四个步骤:1)偶联样品的制备,2)DNA淀粉样蛋白培养液与患者血浆和荧光基团混合,3)用柱纯化标记的偶联样品,并在3800 rpm下离心,4)使用GloMax®-Multi+检测系统对样品进行光子学检测,使用Instinct™软件:震动基础仪器(PROMEGA, Madison, Wisconsin USA)在不同的荧光模块(绿色,蓝色,紫外线,AFC,红色)
使用像Cy3染料这样的标记物的优点是,它可以自然结合,而不需要对淀粉样蛋白等目标蛋白进行无线电标记。因此,每当光源接触到这种复合物(Cy3染料+ DNA提取装置)时,它就会发出更多的荧光,特异于与染料结合的淀粉样蛋白。
患者血浆中β-淀粉样蛋白的体内荧光测定
本研究使用酵母细胞传感器提取液对50例不同患者的血浆样本进行了评价。DNA β-淀粉样蛋白传感器的荧光(FSU)在GloMax Bioanalyzer Detector GloMax®-Multi+检测系统中测量,该检测系统采用Instinct™软件(Promega, Madison, WI),波长范围为400-550 nm,作为激发源。荧光与患者血浆样品中β-淀粉样蛋白的浓度相关,并与阿尔茨海默病的医学诊断标准进行了比较。光子激发-发射源与混合了金属中DNA β-淀粉样蛋白的血浆样品和酵母细胞传感器提取物相互作用的荧光机制如图4所示,其基于生物物理发射和生化原理耦合的激发作用[12]。
图4。该图说明了光子探测的机理,包括一个显示探测时间的图形
阿尔茨海默病患者分为三组(1=阿尔茨海默病诊断;2 = Pre-Alzheimer;3 =正常/健康)。根据三组患者的荧光范围和医学诊断标准采集血浆样本。本研究的所有患者年龄在57 - 89岁之间。
将酵母细胞传感器提取液与血浆按3:1的体积比(提取液:血浆)混合,对样品进行分析。然后根据荧光强度与阿尔茨海默病医学诊断标准的关系将结果分为三组:1组/阿尔茨海默病诊断= 12,800-16,300 FSU;第2组/阿尔茨海默病前期= 11,800-12,800 FSU;第3组/健康/无症状= 7,700-11,800 FSU。从每个样品的最终荧光中减去酵母传感器提取物(4000 FSU)的固有荧光(FSU)。
患者血浆样本的体内临床血糖测定
从患者血液样本中测定血糖水平,并将其与荧光(FSU)和临床医学标准相关联。血糖分析也在哥伦比亚加州Alvarez-Medina临床实验室和哥伦比亚manizales诊断医学中心进行。根据美国糖尿病协会方案[20],根据葡萄糖氧化酶/过氧化物酶-己糖激酶试验对患者血浆样本进行血糖分析[13]。。
DNA β-淀粉样蛋白传感器荧光与MRI及医学诊断的比较分析
核磁共振分析虽然对患者进行了CT扫描和MRI分析,但MRI结果仅显示在标注的论文中。CT扫描结果(未显示)产生了部分比较结果,因为它主要是特定的阿尔茨海默病诊断患者,与MRI相比,在患者之间显示出更多的特异性。因此,在哥伦比亚Manizales诊断中心按照标准MRI方案[14]进行MRI分析。使用GE设备(Boston, MA),使用射频脉冲类型Spin-eco和涡轮Spin-eco与1.5特斯拉磁铁进行分析。成像是基于解剖分化(即T1和T2)使用三维相位对比。
使用Statgraphics Centurion Software version 16.1 (2017 Statgraphics Technologies, Inc., the Plains, Virginia)进行统计分析,将患者分为三组(诊断为阿尔茨海默氏症,阿尔茨海默氏症前期和正常)。因此,进行方差分析(ANOVA)以确定组间的平均值、标准差、方差、相关性(r),以及每组内的性别类型、年龄的影响以及这些相关性的p值或显著性水平。
DNA传感器的构建
细菌DNA β-淀粉样蛋白传感器在LB培养基中生长时,与未转化的受体相比,其荧光强度高(即1,700 FSU),证实了DNA β-淀粉样蛋白传感器的有效组装(图1)大肠杆菌细胞(对照),当它们暴露在20/20发光计中时,荧光表达非常低。
ELISA法测定金属离子对细菌b-淀粉样蛋白装置中β-淀粉样蛋白生成的影响
ELISA结果显示,与未转化的β-淀粉样蛋白相比,在金属离子存在下生长的β-淀粉样蛋白样品中β-淀粉样蛋白浓度更高,细胞体积更大大肠杆菌细胞。与未转化的对照相比,在金属离子存在下生长的β-淀粉样蛋白装置表现出更淡黄色的强度(图2)。
金属离子的影响与DNA β-淀粉样蛋白装置传感器产生β-淀粉样蛋白之间存在直接关联。金属离子的影响与DNA β-淀粉样蛋白装置传感器产生β-淀粉样蛋白之间存在直接关联。例如,当DNA淀粉样蛋白传感器在铝、铁或铜中生长时,与对照组(即没有DNA淀粉样蛋白传感器的细胞)相比,传感器显示出更高的淀粉样蛋白浓度(分别为200、100和100 pg/ml),后者显示出可以忽略不计的淀粉样蛋白产生。
western blot法测定患者血浆中β-淀粉样蛋白含量
Western blot分析结果显示,与健康患者(900 FSU)的样品相比,具有高β-淀粉样蛋白荧光(> 158,000 FSU)且临床报告患有阿尔茨海默病症状的患者样品中的条带强度更强(图4)。混合DNA淀粉样酵母传感器提取物的血浆样品也获得了类似的结果。其中,与荧光较低(10500 FSU)的健康患者相比,荧光较高(12800 FSU)的诊断阿尔茨海默病患者的样本显示出更高的蛋白质表达(图4)。
DNA β-淀粉样蛋白器件传感器荧光的体外检测
结果表明,DNA β-淀粉样蛋白传感器在不同稀释度下的荧光均高于对照(未转化)大肠杆菌或从酵母细胞中提取传感器)。控制传感器显示出类似的相关性,但荧光(FSU)较低。(数据未显示)
体内临床阿尔茨海默氏症测定与患者血浆荧光测定的比较
测定β-淀粉样蛋白的存在在活的有机体内使用人类血浆样本。结果显示β-淀粉样蛋白的高荧光与医学报告有直接的相关性,这是基于以下标准:2.记忆丧失;与健康患者相比,认知障碍(如精神定向障碍和/或精神混乱)。因此,诊断为阿尔茨海默病的第1组与上述两个标准直接相关,而阿尔茨海默病前期的第2组与上述其中一个标准相关,在某些情况下,与无症状的对照组第1组相比,可能是无症状的。与酵母提取物混合的血浆样品显示出较高的荧光强度。结合后,当血浆和DNA淀粉样蛋白传感器提取物的混合物用非放射性Cy3染料标记时(表1),与未标记的混合物样品相比,这种强度增强了10倍以上。因此,与未标记组(平均= 13,800 FSU)相比,1组或诊断为阿尔茨海默病的组显示出最高的荧光强度(平均= 158,100 FSU);第2组或阿尔茨海默病前期,与未标记组(平均= 10,500 FSU)相比,其荧光强度第二高(平均= 127,700 FSU);其次是第3组或对照组/健康/无症状组,与未标记组(平均= 10,500 FSU)相比,荧光强度最低(平均= 82,200 FSU)。 The pre-Alzheimer’s Group 2 exhibited a mean of 127,700 FSU that was between the diagnosed Alzheimer’s Group 1 and the healthy Group 3. Samples from women showed the highest β-amyloid fluorescence in Group 1 (140,000 – 183,600 FSU) (Table 1). In Group 2 (pre-Alzheimer’s) the level of fluorescence was equally distributed amongst both genders. The β-amyloid sensor produced higher β-amyloid fluorescence in plasma samples in both genders. Group 1 showed higher β-amyloid fluorescence with patients between the age range of 70-89 years-old as compared to Group 2 patients, which showed lower amyloid fluorescence between the age range between 57-78 years-old. The variability of the level of fluorescence intensity was noticeable within the range of the Alzheimer’s diagnosed Group 1 as compared to the pre-Alzheimer’s Group 2 and healthy Group 1, which showed less variability within their narrower range. Although glycemic expression was used as a parameter to correlate the expression of β-amyloid device fluorescence, there was no direct correlation between β-amyloid samples from Alzheimer’s’ patient’s glycemic levels with the yeast extract.
表1。DNA细菌细胞的荧光-淀粉样蛋白传感器与患者血浆、MRI和医学诊断分析的比较结果。与MRI等有创的常规诊断方法相比,本表证实了血浆荧光诊断阿尔茨海默病症状的有效性
病人 |
性别 |
年龄 |
共轭荧光(FSU) |
医学诊断 |
核磁共振成像 |
血糖(mg / dL) |
第一组:诊断为阿尔茨海默病 |
12 |
女 |
77 |
151200 |
认知障碍(定向障碍,精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
84 |
68 |
女 |
63 |
143000 |
认知障碍(定向障碍,精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
102 |
59 |
女 |
85 |
140000 |
认知障碍(定向障碍,精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
101 |
67 |
女 |
75 |
152300 |
认知障碍(定向障碍,精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
96 |
3. |
男性 |
76 |
161000 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱) |
心室系统突出。沟扩大 |
87 |
9 |
女 |
72 |
143800 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱)和记忆丧失 |
心室系统突出。沟扩大 |
91 |
69 |
男性 |
80 |
143200 |
认知障碍(定向障碍,精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
110 |
38 |
男性 |
75 |
164000 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
75 |
8 |
女 |
89 |
139300 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱)和记忆丧失 |
脑沟增宽和海马萎缩 |
86 |
34 |
男性 |
80 |
186000 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱) |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
91 |
61 |
男性 |
80 |
146300 |
迷失方向和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
80 |
41 |
男性 |
84 |
199500 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
93 |
40 |
男性 |
78 |
140000 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
89 |
10 |
男性 |
67 |
156700 |
认知障碍(定向障碍,精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
87 |
48 |
女 |
76 |
149500 |
精神混乱和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
86 |
4 |
女 |
78 |
163400 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
88 |
63 |
女 |
75 |
140000 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
98 |
2 |
女 |
77 |
141200 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱) |
脑沟扩大,脑室系统扩张,海马萎缩 |
87 |
6 |
女 |
86 |
183600 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱)和记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
89 |
总平均值+/- SD |
158100 +/- 18700 |
|
第二组:阿尔茨海默病前期 |
13 (2) |
男性 |
57 |
124300 |
无症状的 |
海马萎缩 |
81 |
7 (2) |
女 |
78 |
137500 |
记忆丧失 |
沟扩大 |
82 |
5 (2) |
女 |
75 |
117100 |
认知障碍 |
脑沟增宽和海马萎缩 |
75 |
47 |
男性 |
66 |
139500 |
记忆丧失 |
心室系统扩张和海马萎缩 |
95 |
53 |
女 |
69 |
136600 |
定向障碍和记忆丧失 |
心室系统扩张和海马萎缩 |
83 |
32 (2) |
女 |
62 |
139000 |
认知障碍 |
双侧额叶萎缩。 |
85 |
54 |
女 |
77 |
125300 |
记忆丧失 |
脑沟增宽,海马轻度萎缩 |
93 |
56 |
男性 |
67 |
116800 |
定向障碍和记忆丧失 |
脑沟增宽和海马萎缩 |
95 |
53 |
女 |
75 |
114200 |
记忆丧失 |
心室系统的扩张 |
87 |
55 |
男性 |
71 |
128000 |
记忆丧失 |
裂缝扩大。心室系统扩张,海马萎缩 |
105 |
33 |
男性 |
66 |
123500 |
认知障碍(定向障碍和精神混乱) |
裂缝扩大。心室系统扩张和轻度海马萎缩 |
123 |
50 |
女 |
70 |
117300 |
无症状的 |
心室系统扩张,海马萎缩 |
80 |
总平均值+/- SD |
127700 +/- 9036 |
|
第三组:健康 |
37 |
男性 |
80 |
103800 |
健康的 |
不是阿尔茨海默病的征兆 |
84 |
46 |
男性 |
71 |
74600 |
健康的 |
没有改变 |
94 |
62 |
女 |
74 |
105400 |
健康的 |
没有改变 |
87 |
66 |
男性 |
68 |
89390 |
健康的 |
没有改变 |
One hundred. |
42 |
女 |
74 |
105800 |
记忆丧失 |
没有改变 |
88 |
1 (2) |
女 |
61 |
31000 |
健康的 |
没有改变 |
97 |
64 |
男性 |
72 |
59670 |
健康的 |
没有改变 |
90 |
36 |
男性 |
63 |
104200 |
健康的 |
没有改变 |
87 |
44 |
女 |
80 |
109300 |
定向障碍 |
没有改变 |
86 |
60 |
女 |
59 |
78000 |
健康的 |
没有改变 |
87 |
58 |
女 |
66 |
44900 |
健康的 |
没有改变 |
95 |
35 |
女 |
65 |
65820 |
健康的 |
没有改变 |
92 |
57 |
女 |
62 |
60950 |
健康的 |
没有改变 |
84 |
43 |
女 |
75 |
106700 |
健康的 |
没有改变 |
87 |
49 |
女 |
71 |
60300 |
健康的 |
没有改变 |
89 |
51 |
男性 |
79 |
72800 |
健康的 |
没有改变 |
105 |
45 |
女 |
74 |
98000 |
健康的 |
没有改变 |
103 |
39 |
女 |
75 |
110000 |
健康的 |
没有改变 |
91 |
65 |
男性 |
77 |
80028 |
健康的 |
没有改变 |
115 |
总平均值+/- SD |
82200 +/- 23970 |
|
注1:FSU =荧光单位,MRI =磁共振成像
注2:从每个样品荧光中减去单独提取液(4000 FSU)的荧光
注3:MRI检查标准为:1)脑沟增宽,2)脑室系统扩张,3)海马萎缩。然而,在一些病例中,其他相关的MRI标准被用于“双侧额叶萎缩”。这是应用在前阿尔茨海默病患者。
注4:使用的医学诊断标准是:A)认知障碍(精神震荡和/或定向障碍)B)记忆丧失
注5:无症状=无症状
拉曼分析结果表明,淀粉样蛋白的强度和位移值与样品的峰相关,但范围大小取决于患者组的类型和样品的类型(即单独的血浆,或血浆+ DNA淀粉样蛋白传感器的提取物)。因此,标准淀粉样蛋白的范围在600到1800厘米之间1,这对应于不同的分子,包括酪氨酸(800厘米1),苯丙氨酸(1000厘米1),酪氨酸-苯基(1100cm1),酰胺I (1500cm)1),酰胺II (1600 cm)1),酰胺III (1200-1300 cm)1).例如,对于血浆加DNA淀粉样蛋白传感器提取物,指纹的范围与血浆单独的范围相似。血浆加提取物的峰数以组1最多(10个峰),其次为组2(8个峰)和组3(6个峰)。强度根据组的不同而不同,其中组2的强度最高(图5);单独血浆时,组1显示7-8个与标准淀粉样蛋白相似的峰,强度最高(> 2000 cm)1).组2有8个低强度峰(约1000 cm)1组3出现5 ~ 6个峰,强度最低(600 cm)1)(由于图的尺寸太大,没有显示数据),但它只显示了淀粉样蛋白的一个峰,其他3个峰与酰胺化合物有关(即1200-1600 cm)1),与拉曼光谱分析的任何蛋白质一样。
图5。一个。诊断为老年痴呆症血浆+DNA淀粉样蛋白传感器。B。老年痴呆症前血浆+DNA淀粉样蛋白传感器。C。健康血浆+ DNA淀粉样蛋白传感器
图5样品拉曼光谱分析。该图显示了基于血浆加DNA淀粉样蛋白传感器与标准淀粉样蛋白的不同患者组样品的拉曼光谱分析结果
测定DNA淀粉样蛋白传感器的粒径
DNA淀粉样蛋白传感器和合成的淀粉样蛋白对照均显示出与淀粉样蛋白全长(即110 KDa)相近的粒径,分别为124 nm和95 nm(图6)。
图6。一个。DNA淀粉样蛋白传感器粒子的光子强度大小分布示意图。强度的峰值出现在124 nm处。B。对照合成淀粉样蛋白的粒子的光子强度的大小分布示意图。强度的峰值出现在95 nm处
测定DNA淀粉样蛋白传感器的分子量
DNA的提取淀粉样蛋白酵母文化生产的淀粉样蛋白在离心过滤后的设备范围内的30至100 kDa以及凝胶电泳(图7)。然而,从DNA样本提取淀粉样蛋白酵母表现出最高的和最强的分子量如图所示的厚度和亮度乐队在凝胶电泳(图7),而控制引用片段显示亮度和轻弱的乐队(图7)。
图7。SDS-PAGE蛋白纯化阿尔茨海默氏症器械提取物。1.阿尔茨海默氏症设备提取液经过滤浓缩30K。2.阿尔茨海默氏症设备过滤浓缩提取液100K。3.标准β-淀粉样蛋白蛋白质。纯化后的蛋白含量大于100 KDa
DNA β-淀粉样蛋白传感器的荧光与患者血浆、MRI和医学诊断的比较结果
三组患者MRI检测的β-淀粉样蛋白传感器产生的荧光与医学诊断的对比结果均显示出良好的相关性(表1)(图8),证实了β-淀粉样蛋白传感器检测β-淀粉样蛋白的有效性。这些结果也证实了我们根据荧光强度对三组(即阿尔茨海默病诊断、阿尔茨海默病前期和正常)进行分类的可靠性。荧光与两种医学诊断标准(1)相关性很强。2.记忆丧失;认知障碍(如精神定向障碍和/或精神混乱)。这种强相关性随后是常规MRI分析的比较结果。本文描述的两种常规诊断方法(即MRI和医学诊断)在用于健康和/或非阿尔茨海默病患者时,都与我们基于构建的β-淀粉样蛋白传感器的荧光结果具有良好的相关性。
图8。一个。图示使用酵母DNA β-淀粉样蛋白传感器提取的临床诊断为阿尔茨海默氏症的患者与健康患者的MRI对比结果。B。利用酵母DNA β -淀粉样蛋白传感器提取的阿尔茨海默病患者(5)的MRI。C。使用酵母DNA β-淀粉样蛋白传感器提取的健康患者的MRI,无颅内改变[24]
统计分析
结果表明,根据选取的三个参数对三组进行了很好的分类。第1组的荧光总平均值最高(158,100 +/- 18,780 FSU),其次是第2组(127,700 +/- 9036),而第3组的总平均值最低(82,200 +/- 23,970)(表1)。这些组的鉴定具有良好的显著性水平(α = 0.05)和相关方差(P=1.519*E-7)(表1)。此外,组间和组内性别的影响显示出很强的正相关Pearson系数(R)和显著的P值。但与年龄呈微弱正相关。
我们的方法是分子传感的一个例子,其中β-淀粉样蛋白传感器的分子产物作为淀粉样蛋白重组蛋白/抗原,与血液中循环的APP抗体结合[15]。
β-淀粉样蛋白传感器产生的荧光与测试时β-淀粉样蛋白的浓度有直接的相关性在体外和在活的有机体内。用DNA构建体转化的酵母细胞产生的提取物与血浆混合后的荧光证实了提取物/重组蛋白检测人血浆中淀粉样蛋白的适用性,因为酵母细胞和人细胞都是真核细胞。与阿尔茨海默病前2组和对照组/健康组3组相比,阿尔茨海默病诊断组1中荧光的高变异性可能是由于影响阿尔茨海默病发病的遗传和/或环境(例如金属离子)等相关因素。然而,第1组女性的荧光高于男性,而第2组和第3组没有差异。这可能是由于与女性生理相关的疾病发病期间表达的其他未知相关因素。年龄在组1 (r=0.096)和组2 (r= 0.155)呈弱正相关,组3呈弱负相关(r=-0.0687)。也许,这是因为这三组人的年龄都很接近;随着疾病的发展,年龄仍然是重要的,第3组(健康)的负值证实了组的分类良好。
荧光机理是基于光子在分子水平上的激发和发射[12],如图4所示。当β-淀粉样蛋白传感器装置细胞在含有不同金属的培养基中生长时,在细胞水平上进一步证实了这一点2 +、铜2 +,艾尔。2 +、Zn2 +)与未转化细胞的对照相比。先前的一篇报道也使用荧光检测葡萄糖用于糖尿病的早期诊断,提出了类似的假设机制[10]。
基于光子学的拉曼光谱分析不仅证实了血浆样品中淀粉样蛋白的存在,而且还证实了DNA淀粉样蛋白传感器在发病前根据其水平(阿尔茨海默氏症诊断,阿尔茨海默氏症前期和健康)诊断阿尔茨海默氏症的功效。通过拉曼光谱分析来分析淀粉样蛋白,根据蛋白质的指纹范围已经有其他作者报道(30,31)。此外,DNA淀粉样蛋白传感器显示出与对照合成的淀粉样蛋白相似的粒径,这证实了两个分子之间的原子相似性。SDS-PAGE电泳分析的结果也证实了这一点。淀粉样蛋白传感器(124nm)和对照合成淀粉样蛋白(95nm)之间的颗粒大小数量略有不同,这可能是由于化学合成的淀粉样蛋白的纯度,而与自然完全合成的DNA淀粉样酵母装置相比,后者可能含有少量的相关氨基酸或蛋白质或其他化合物,这是由于一些修饰,如糖基化、磷酸化、还有一些发生在酵母细胞中淀粉样蛋白的表达过程中,这可能会干扰光子性或光谱移位,因为这总是发生在生物分子中[16]。
此外,铁等金属对β-淀粉样蛋白表达的影响通过灵敏的ELISA试验得到证实。其他作者先前使用ELISA方法在脑脊液中证实了β-淀粉样蛋白的表达[17]。这些结果证实了金属对β-淀粉样蛋白表达的影响,提示金属可能在分子水平上诱发阿尔茨海默病[18]。也许这种相关性是由β-淀粉样蛋白传感器中核糖体开关和铁离子通道(TonB)的存在促进的。另一篇报道也证实了铁离子通道和核糖开关在DNA金属传感器中的有效功能[19]。
本文的结果表明,上述医学标准不足以在对患者进行检查时确定疾病的症状。在这种情况下,医学诊断是使用基于观察和询问的主观方法进行的,而不是基于物理测试和/或分子(生物标志物)鉴定。然而,我们的β-淀粉样蛋白传感器可以为诊断阿尔茨海默病提供更具体和/或更强的标准,因为它基于更通用的分子或生物标志物,如蛋白质[20]。因此,基于β-淀粉样蛋白等靶向分子的存在,可以更加客观地诊断阿尔茨海默病[21]。
我们的β-淀粉样蛋白传感器用于检测与阿尔茨海默病相关的β-淀粉样蛋白的灵敏度和准确性是由于传感器产生的荧光,这是基于分子和原子水平的光子发射,最终提供更具体的检测。光子检测为该病的检测提供了一定的优势。然而,光子效应可能会受到一些变化,因为淀粉样蛋白的光子检测是基于一摩尔分子所吸收的量子能量,这被称为爱因斯坦。[16]
然而,当底物的摩尔浓度较高时,荧光强度会发生变化,从而引起光子干涉。因此,为了获得完整的光子效应,可以确定光子量子的产率[16]。
用特定波长诱导β-淀粉样蛋白传感器与血浆样品混合产生荧光,测定β-淀粉样蛋白的浓度。光子是任何类型的电磁相互作用的介质。光子没有质量和电荷,它负责产生所有的电场和磁场。光子与分子化学键形成的电子云相互作用,产生振动效应,用于生物分子的检测、鉴定和表征[22]。
因此,光子学效应是通过荧光的发射来显示的,荧光的强度代表了淀粉样蛋白等生物分子的存在。使用我们的β-淀粉样蛋白传感器,我们能够识别三组明显症状和/或无症状的患者。
Western blot实验也证实了β-淀粉样蛋白传感器的高灵敏度,血浆样品中β-淀粉样蛋白浓度与荧光之间存在较高的相关性。
最后,在使用血浆β-淀粉样蛋白传感器检测β-淀粉样蛋白时,血糖水平与荧光单位(FSU)之间不一致的相关性可以解释为两种分析之间测量参数单位缺乏亲和力。因此,血糖水平的测量是基于葡萄糖的质量,而荧光是基于能量(光子单位)。
利用传感器和提取液产生的荧光定量是一种可靠的、更实用的诊断方法,其他敏感的常规技术如MRI和医学诊断参数也证实了这一点。虽然MRI是一种有用的阿尔茨海默氏症的解剖表达,它并不总是能够完全预测疾病。此外,断层扫描并不总是能捕捉到细胞水平上的小损伤。例如,磁共振成像的强度不均匀性和分割并不总是准确的[23]。此外,疾病的进展状态可能影响细胞的状况,正如我们在指示调查中注意到的那样。因此,早期发现疾病的敏感性可能会降低。
我们的β-淀粉样蛋白传感器的可靠性可能是由于DNA β-淀粉样蛋白传感器固有的生物发光,在分子水平上与血浆兼容,而不管淀粉样蛋白同种异构体的类型。尽管其他作者已经证明血浆中存在淀粉样蛋白,但他们的结果可能取决于淀粉样蛋白异构体的类型[17]。
本文描述的β-淀粉样蛋白传感器可以检测淀粉样蛋白,而不考虑通过血脑屏障(BBB)运输的同种异构体的类型。传感器固有的生物发光/荧光特性提供了更广泛的灵敏度范围。这可以从血脑屏障的主动转运来解释。在跨膜运输过程中,会形成具有相似化学结构的不同淀粉样蛋白异构体[24]。我们的β-淀粉样蛋白传感器将能够检测到不同的同种异构体。利用合成生物学构建β-淀粉样蛋白传感器用于血液中阿尔茨海默病的早期检测的主要优势之一是外显子的组合,这些外显子是针对特定蛋白质的特定序列。因此,淀粉样蛋白的产生和表达可以更具特异性[25]。目前,我们正在改进传感器在分子和原子水平上的检测方法和灵敏度。
这项工作代表了生物医学科学的进步,因为它显示了DNA β-淀粉样蛋白传感器产生的特定荧光强度与血浆中β-淀粉样蛋白浓度之间的相关性,可以预测阿尔茨海默病的发病,并允许将患者分为三组,阿尔茨海默病患者,阿尔茨海默病患者前期和健康人。此外,通过光子学分析证实,DNA淀粉样蛋白传感器具有纳米颗粒特性。研究结果有助于更好地理解阿尔茨海默病和糖尿病之间的关系。这些结果提示进一步的研究,以建立明确的阿尔茨海默病和糖尿病之间的因果关系。
这项工作得到了哥伦比亚马尼萨莱斯国际创意园中心的支持。我们感谢已故的Pablo Medina博士,他为我们提供了患者的血液样本和相应的血糖分析,并允许我们在加州-哥伦比亚的alvarez -Medina临床医学微生物实验室对血液样本进行荧光分析。我们也感谢放射学家Vladimir Cardenas博士,他的医学建议和对断层摄影和成像技术的解释。我们感谢Clonetex Systems Inc, Austin, TX, USA提供合成序列并在本工作实施过程中提供技术支持。我们也感谢Imagenes Medicas诊断中心和哥伦比亚马尼萨莱斯诊断中心提供患者和临床医学分析。我们感谢来自美国休斯敦bioccapital Holdings的化学家Dalia Zelko对样品进行拉曼分析。同时,我们也要感谢医学博士Cecilia Arturo,她为我们提供了医疗建议并为我们的病人提供了帮助。我们也感谢Lawrence Villanueva博士审阅了我们的手稿。
所有作者都对本文所介绍的工作作出了广泛的贡献。
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