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Hiroshi宫本茂
罗切斯特大学医学中心
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评论文章
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收稿日期:2018年1月12日
录用日期:2018年2月4日
发布日期:2018年2月6日
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©2018 Le w .这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放获取文章，在注明原作者和来源的情况下，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制。
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乐伟，崔忠(2018)人粒细胞的天然抗癌活性。综合癌症科学治疗。5:DOI: 10.15761/ICST.1000263
同济大学医学院上海东方医院转化纳米医学研究所
美国南佛罗里达骨髓干细胞移植研究所
同济大学医学院上海东方医院转化纳米医学研究所
美国维克森林大学医学院病理学系
DOI: 10.15761 / ICST.1000263
癌症杀伤活性(CKA)主要存在于粒细胞中，首先在耐癌小鼠(SR/CR小鼠)中发现，后来在人类中发现。的在体外CKA的测定条件不同于传统的细胞毒性测定。一种基于从健康供体收集的人粒细胞输注作为直接治疗剂的实验性治疗方法在以前是概念化的。从这个角度来看，我们总结了我们正在进行的研究的结果，希望能帮助那些对检测供体粒细胞治疗癌症的疗效感兴趣的临床医生。粒细胞CKA在人体中具有抗癌作用，受年龄、应激、季节、营养、卡介苗和辐照等因素的影响。根据我们最近的发现，到目前为止，所有测试的靶细胞表面都带负电荷，而正常细胞表面是电荷中性的，我们提出，负表面电荷是粒细胞所针对的细胞特性，而粒细胞是唯一带正电荷表面的细胞。
粒细胞是最丰富的白细胞类型，以其防御细菌感染的主要作用而闻名。虽然它们经常在癌症病变中被观察到，但它们在抗癌免疫中的作用一直存在争议。然而，关于这一主题的大多数研究都是在癌症患者中进行的，他们没有任何针对癌症的免疫保护功能。1999年，我们的实验室偶然发现了粒细胞在抗癌免疫中的决定性作用[1]。一只正常的BALB/c小鼠意外地在注射180肉瘤(S180)后存活。研究这种抗性的机会来了，因为这种对注射致命癌细胞的深刻生存能力被证明是一种种系可传播的显性表型。该群体在我们的实验室中持续了15年，目前仍保存在另一个欧洲实验室[2]。进一步的研究表明，粒细胞通过直接杀死癌细胞，完全负责整个抗癌过程，并且可以转移到其他小鼠身上治疗已建立的恶性肿瘤[3]。这种耐药性不仅局限于肉瘤细胞，也存在于其他致死性癌细胞系[4]。
基于这些在活的有机体内观察后，我们证实了癌细胞的杀伤活性在体外通过证明它只存在于抗癌小鼠中而不存在于正常小鼠中。这个简单的在体外与传统的细胞杀伤试验相比，该试验是独特的，在传统的细胞杀伤试验中，通过测量预先标记的靶细胞释放的放射性物质来确定杀死的细胞水平。但常规检测在4小时内完成。在我们的实验中，任何附着的癌细胞都可以作为靶标。在与非贴壁效应细胞孵育至少24小时后，以未添加效应细胞且所有靶细胞都存活的对照中仍附着在培养表面的活细胞的百分比来测定[3,5]。基于在活的有机体内与正常小鼠相比，在共孵育时间、共孵育温度、共培养介质和靶细胞选择等方面对实验条件进行微调，以反映小鼠的耐癌表型。换句话说，实验条件被设定为能够确定哪只小鼠具有抗癌性或非抗癌性。到目前为止，虽然能够在耐癌SR/CR小鼠中检测到显著的CKAin，但在野生型小鼠中未检测到CKA。很明显，该试验能够通过动员后从腹膜收集的白细胞反映癌症抗性表型。在耐药小鼠的其他细胞群中也检测到CKA，主要是在巨噬细胞部分，但特异性活性水平低得多。一旦实验建立起来，通过使用小鼠癌细胞作为目标来筛选耐癌小鼠，那么就到了解决人类白细胞中是否有类似的CKAin这个问题的时候了。
现在不可能用活的癌细胞挑战人类，以找出谁具有抗癌能力，谁没有。这是几十年前做的，但引起了严重的伦理问题[6-8]。然而，有可能通过血液测试来筛选人类是否有类似于抗癌小鼠的活动。我们的在体外该试验可以很容易地适应为一个简单的血液测试，以确定人白细胞中的CKA水平。首先，白细胞可以很容易地从人外周血中纯化出来，并进一步分离成粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的部分。其次，几乎所有组织/器官来源的人类癌症细胞系都可以作为靶细胞。在39°C共培养24小时后，CKA的相对水平由效应细胞在设计的效应细胞:靶细胞比例(在我们实验室的每个实验中，E:T通常为3:1,10:1和20:1)下被效应细胞杀死的靶细胞百分比来定义。例如，20%击杀比例为3:1,50%击杀比例为10:1,70%击杀比例为20:1，可以用来确保CKA水平与E:T比率成正比。此外，还可以将各E:T比值下的杀虫率与其他个体的杀虫率进行比较，以确定个体间CKA的相对水平。共培养温度设定在39°C而不是37°C，因为粒细胞在模拟发烧的高温下功能更好，更稳定。
作为常规，在粒细胞部分和含有单核细胞和淋巴细胞的单核细胞部分中测量3e:T比值的特定CKA水平。在健康个体中，粒细胞部分的特异性CKA水平几乎总是高于单核细胞部分，这与SR/CR小鼠的观察结果一致。考虑到粒细胞是外周血中最丰富的白细胞，占总循环白细胞的45-70%，它们拥有总CKA的85%以上。然而，我们注意到，在大约15%的癌症患者中，单个核细胞部分的特异性CKA水平高于粒细胞部分。这种CKA分布逆转的临床意义仍在研究中，但可能是由于化疗对粒细胞的影响大于对单核细胞的影响。很明显，自然存在的CKA主要存在于健康人的粒细胞中。
最初，我们使用人类宫颈癌细胞系Hela细胞作为靶细胞。后来我们将靶细胞扩展到其他人类癌细胞系。我们的结果表明，每个个体对不同的癌细胞系具有显著不同的CKA水平，包括乳腺癌、前列腺癌和迄今为止测试的其他类型的癌症(图1)。例如，从一个个体以10:1 E:T比收集的粒细胞对Hela细胞具有60%的CKA，但对MD231具有25%的CKA。另一个人对Hela有40%的CKA，对MD231有50%的CKA。这些结果表明，选择最有效的粒细胞来杀死特定类型的癌症的最佳策略可能需要针对同一类型癌症的一组癌细胞系。例如，一组乳腺癌细胞系可用于筛选乳腺癌患者的潜在供体，而不是使用海拉细胞或仅使用一种乳腺癌细胞系。对所有靶细胞系具有最高总CKA的受试者有望成为特定患者粒细胞的最佳潜在供体。针对Hela细胞的CKA似乎代表了许多个体(但不是全部)针对其他癌细胞作为靶细胞的平均CKA。
图1:粒细胞CKA靶细胞谱。
最终，人们希望使用直接从患者身上收集的原发癌细胞和患者活跃癌细胞群的代表作为CKA检测的目标。然而，这一希望可能面临一些技术挑战，包括如何从患者身上收集原发癌细胞，以及如何对潜在的非贴壁靶细胞进行CKA测定。
粒细胞是人体免疫系统对抗感染的第一反应者。他们可以在几分钟内到达感染部位或伤口。粒细胞对靶细胞有几种效应机制。它们是吞噬细胞，在内部杀死小病原体之前将其吞噬[9,10]。粒细胞的另一个主要效应机制是被称为脱粒的过程，在这个过程中，颗粒中的细胞毒性物质，如乳铁蛋白、抗菌肽、髓过氧化物酶、杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、防御素(也称为人中性粒细胞肽)、丝氨酸蛋白酶、中性粒细胞弹性酶、组织蛋白酶G和明胶酶[11-14]被释放出来杀死靶细胞。
人中性粒细胞肽(HNPs)是人中性粒细胞中最丰富的蛋白质。HNPs占总中性粒细胞蛋白的5%，占azurophil颗粒蛋白的50%，是主要的抗菌效应物[11,15-18]。HNPs含有20-40种氨基酸，富含精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸，导致多肽带正电荷，称为“阳离子多肽”[19]。
HNPs具有两亲性折叠棒状结构，其中一侧为疏水，另一侧为亲水性并带正电[20.，21]。有人提出，HNPs的主要目标是带负电荷的脂质双分子层膜[11]。HNPs的激活机制是带负电荷的前导肽的裂解，从而中和肽前体中的正电荷[11]。
成熟的两亲性HNPs在靶细胞上发挥两种主要的效应作用。首先，HNPs在靶细胞的质膜上形成桶状孔[11]。单体的疏水性面
在过去的13年里，自从建立了CKA检测来筛选人类血液样本以来，已经对1000多名受试者进行了评估。本文总结了人群中CKA的一些一般趋势。最重要的发现是，CKA在个体之间，甚至在同一个体中，存在很大的个体差异。目前所研究的人群中CKA呈正态分布。在10:1的E:T比值下，大多数健康人的CKA相对于Hela在40% - 60%之间。只有不到10%的人的CKA高于80%。CKA高于90%的不到1%。一个有趣的观察是，一名20岁的女性受试者有95%的CKA，而她52岁的母亲有97%的CKA。CKA在人群中的遗传模式尚未被研究。性别和种族对CKA没有明显的影响。
在小鼠中，能否在癌细胞的致命挑战中存活完全取决于是否有CKA。CKA也可能是一种保护人类不患癌症的活动。人们会认为，CKA可能首先在癌症患者中受损。我们比较了50多名健康个体和50多名年龄在45到65岁之间的癌症患者的CKA和Hela细胞。在10:1 ET比下，健康人群对Hela细胞的平均CKA为50%，癌症患者为30%。我们期待未来CKA对与患者癌症类型相似的细胞系的研究结果会更加有趣。这些结果表明，良好的CKA应该来自健康人的粒细胞，而不是来自其他细胞或癌症患者的任何白细胞。如果癌症患者的白细胞对癌细胞有效，他们一开始就不应该得这种病。通过癌症患者和健康捐献者的粒细胞来比较CKA和他们自己的癌细胞会更有趣。然而，这个实验可能要等到大量的原发癌细胞被分离出来，作为实验的靶细胞。 Such a technical ability is currently unavailable.
衰老是癌症发展的最大影响因素。一般来说，衰老对细胞免疫也有重大影响。我们还比较了100多名20 - 30岁的健康年轻受试者和40多名67-76岁的健康老年受试者(不同性别和种族)的海拉细胞。年轻受试者的平均CKA为65%，老年受试者为40%。然而，老年人的个体差异比年轻人更大。这一发现与年龄相关的癌症发病率增加与年龄相关的CKA减少的可能性是一致的。
压力是现代社会不可避免的一部分，危害人类和动物。人们普遍认为压力会促进甚至导致癌症[23]。然而，支持这种观点的科学证据很薄弱[24-32]。的human body deals with acute stress with stress response or “fight-or-flight” response, in which stress hormones are released into the blood stream [33-34]. As a result, stress hormones stimulate energy utilization in the stress response organs, such as cardiac, pulmonary, muscular and sensory systems and inhibit energy metabolism in the non-response organs, such as digestive, renal and immunological systems [35-37]. Among stress hormones, cortisol, epinephrine, and norepinephrine are the quantitatively most important molecules released into blood stream [38,39]. The inhibitory effects of these stress hormones on the immunological system have been well-established and also been utilized widely in suppressing over-reaction of the cellular immune system, such as allergic reactions[40-46].
我们在学期期末考试之前，期间和之后测量了一组学生的CKA与海拉细胞的关系。这是先前建立的一种模型，即让一组受试者同步经历短期心理压力[47]。在我们的实验中，所有科目的CKA在考试当天几乎被取消，并在考试后几天迅速恢复到以前的水平。这种对CKA的抑制伴随着血液中应激激素的升高。
在体外研究还表明，主要应激激素皮质醇对粒细胞CKA的抑制作用比其他两种主要应激激素肾上腺素和去甲肾上腺素更深刻。
在学生发生激烈的争论或公开演讲等偶然的压力事件后，也可以偶然地观察到CKA的完全废除和随后的恢复。
然而出乎意料的是，北卡罗莱纳州(北纬38°N)粒细胞中CKA的季节性是明确而深刻的(图2)。CKA在10月至3月之间完全不存在。CKA将于4月回归。我们在11月和2月在佛罗里达州迈阿密(纬度25°N)收集的一些样品中检测到CKA，并通过隔夜快递邮件运往北卡罗来纳州进行检测。我们还在北卡罗莱纳州完全没有CKA的冬季，在上海(北纬38°N)采集的一小部分样品中检测到CKA。我们怀疑环境中可能存在未知的CKA兴奋剂。
图2:粒细胞CKA的季节性
图3:癌细胞和正常细胞的表面电荷
人类细胞功能的季节性在如此深刻的层面上是出乎意料的。早期人类不得不通过多睡少吃来应对冬天食物的严重短缺。冬眠动物冬季的能量消耗可降至夏季的1/20[48]。在人类中，冬季的能量消耗可能会下降到夏季水平的一小部分。大多数现代人在冬季的几个月里体重会增加，因为如果食物摄入量保持不变，消耗会减少。
该结果的一个实际含义是，冬季可能不是寻找粒细胞CKA水平高的献血者的好时机。
在细胞培养中，人类细胞的生长需要39种必需的营养物质，可能在婴儿不得不转向固体食物之前的头4-6个月里也需要这些营养物质。可能到那时，细胞成分的内源性合成能力开始下降，体内细胞的积累越来越依赖于固体食物中的额外营养。可能没有上限，多少营养细胞在体内可能需要实现最终功能。但我们可以有把握地认为，可用的营养物质越多，细胞的功能就越好。
为了找到能够促进粒细胞CKA的营养物质，我们筛选了60种不同的水果和蔬菜。我们发现，墨西哥辣椒、甜菜根或贝拉菇的冷水提取物在高速混合后，人体粒细胞CKA至少提高了100%。的在活的有机体内这些潜在的兴奋剂对CKA的影响尚未确定。我们也不确定CKA刺激是否受到抽血前几天饮食史的影响。例如，如果供者吃了很多苹果，但在抽血前很长一段时间没有吃墨西哥胡椒，那么墨西哥胡椒可能会刺激CKA，因为它长期没有出现在饮食中，而不是因为它是一种特定的刺激物。我们想知道，如果在抽血前由于细胞对营养的渴求而不吃苹果，是否会有类似的刺激。
芽孢杆菌是一种革兰氏阳性杆状细菌属，已知可引起结核病。卡介苗是法国科学家Calmette和gusamrinin在1908年至1921年间研制的一种芽孢杆菌菌株，通过细菌培养的连续传代达到减毒的目的[49]。这种菌株被命名为卡介苗芽孢杆菌，曾被用作结核病和麻风病的疫苗。随着毒力的降低，向人体注射活细菌变得更加安全。在20世纪50年代，活卡介苗被证明可以使携带致命移植癌细胞的小鼠受益[50]。卡介苗在临床上用于治疗人类膀胱癌，疗效显著[51]。
膀胱内注射活卡介苗是治疗膀胱癌最有效的方法原位．将毒力降低的活芽孢杆菌作为治疗剂注入膀胱。在首次报道后的40年里[51]，与细胞毒性膀胱内化疗相比，卡介苗治疗的有效率高，严重副作用发生率低，仍然是首选的治疗方法。膀胱癌对卡介苗治疗的应答率可高达75%[52]，是目前针对实体癌最成功的治疗方法。然而，在过去的几十年里，经过超过1亿次的剂量，卡介苗治疗的效应机制仍然非常难以捉摸。
使用活细菌治疗癌症已有很长的历史。19世纪末th世纪以来，有许多观察表明，严重感染和严重发热反应引发的晚期癌症奇迹般的消退[53]。出于好奇，威廉·科利开始有意地用从感染部位收集的活细菌来治疗癌症患者。他在1891年首次报道，故意将活细菌注射到肿瘤中，在人类中引起了类似的感染、发热反应和肿瘤消退，但并非没有高脓毒症发生率[54]。
众所周知，粒细胞对细菌感染有高度反应。卡介苗治疗的机制可能是通过刺激粒细胞来杀死膀胱癌细胞。我们筛选了一组接受BGC治疗的膀胱CIS患者在常规6周BCG治疗前后的CKA。我们发现，在临床对卡介苗治疗反应良好的患者中，粒细胞中的CKA升高至少50%。这一结果也与卡介苗治疗的疗效是由粒细胞CKA机制介导的可能性相一致。
在输血的临床实践中，异体血细胞经常被照射以阻止供体细胞增殖，从而导致可能的移植物抗宿主病，特别是对于免疫功能低下的患者。我们的结果表明，辐照使粒细胞的CKA减少到1/3。辐射将细胞DNA分解成碎片，不仅可以阻止DNA复制用于细胞分裂，还可以阻断许多需要新生RNA和蛋白质合成的细胞功能。因此，辐照降低了粒细胞的CKA也就不足为奇了。
事实上，人类粒细胞可以在没有事先接触的情况下识别出一系列截然不同的癌细胞和细菌，这表明癌细胞和细菌表面的可能目标可能不是基于分子的。我们测试了癌细胞的表面电荷是否独一无二。
生物电是所有生命的重要组成部分。然而，对动物体细胞的电特性仍然知之甚少。早在20世纪40年代，癌细胞的一些非常微妙的行为就引起了人们的怀疑，即它们的表面可能与正常细胞的表面具有不同的电性。这些细胞行为包括与邻近细胞的黏性，失去接触抑制细胞生长和阳离子聚合物聚乙烯亚胺形成癌细胞聚集体(这些发现也导致了大量细胞表面电荷的研究，这种测量细胞表面电荷的方法是高度不敏感的。在给定细胞群中的大多数细胞，在电泳场中定向移动细胞所需的极高的表面电荷质量比是无法实现的。细胞电泳的一个主要问题是很少有细胞移动和计数;大多数细胞保持静止。如何精确测量体细胞表面电荷的技术挑战可能导致该领域停滞了几十年。一些早期声称癌细胞可能具有独特的表面电荷的说法没有得到进一步的验证或扩展，超出了对少数细胞系的评估，也没有开发出任何应用。
我们设计了两种纳米探针(NPs)，一种表面带正电，另一种表面带负电，这可能已经解决了上述两种类型的NPs具有两个额外的特性，即能够通过磁铁捕获附着的细胞并通过荧光识别。
NPs可用于测量许多细胞类型的表面电荷，包括来自已建立细胞系的癌细胞和从新鲜组织和外周血中分离的正常细胞。除粒细胞外，正常细胞不与任何一种类型的负表面电荷结合，对糖酵解抑制高度敏感，并且由于乳酸分泌而产生。
除了所有具有阴性表面的培养癌细胞外，最近我们能够通过使用新开发的基于癌细胞独特表面电荷的CTC捕获纳米技术，从转移性癌症和白血病患者的外周血样本中捕获大量癌细胞。这些发现表明，负表面电荷是所有测试的癌细胞的独特性质在体外和在活的有机体内来源。因此，我们提出癌细胞的这种独特的表面电特性可能是粒细胞识别的目标。
用同样的方法，粒细胞被发现是我们迄今为止测试的唯一具有阳性表面的细胞。这种相反的表面电荷将允许粒细胞在不需要任何其他分子机制的情况下，很容易和特异性地附着在癌细胞上，并避免正常细胞都是电荷中性的。
为了从功能上验证CKA是否需要表面电荷，我们使用带正电荷的NPs在与粒细胞混合之前屏蔽目标癌细胞的表面电荷。结果，粒细胞CKA被有效阻断。
使用相同的方法，我们还发现大肠杆菌的表面也带负电荷，这与之前许多细菌表面带负电荷的报道一致。我们认为粒细胞对细菌的识别也可能是由相反的表面电荷介导的。
2008年，我们提出了一种新的癌症治疗概念，即基于ca的异基因粒细胞输注。这种治疗理念的关键组成部分是寻找具有高水平粒细胞CKA的健康供体，动员后通过采珠术收集粒细胞，并将新收集的粒细胞输注给癌症患者。这个概念在几乎所有关键方面都与以前所有针对癌症的免疫疗法有着根本的不同。2009年，美国FDA批准了一些由调查性临床医生发起的临床试验。后来在其他几个国家也开始了类似的试验。然而，由于缺乏资金和治疗后无法收集完整、关键的随访数据，此时这些临床工作无法报告符合原始研究设计标准的有意义的进展。在该实验室已知的数百次供体粒细胞输注中，没有发生GVHD，这表明该疗法是安全的。
有一个特例，其完整的数据值得描述。一位52岁的女性患者被诊断为IV期鳞状细胞癌/腺癌，原因不明。在肺、肝、卵巢和盆腔中发现了许多转移性病变。在发生严重的肺和心脏过敏反应之前，患者接受了7轮探索性紫杉醇/碳化疗。随后进行了盆腔缩小手术和卵巢子宫切除术，以暂时缓解盆腔症状。由于鳞状细胞癌大量转移到肝脏和肺部，并且文献中有充分的证据表明鳞状细胞癌对化疗无反应，估计生存时间为3-6个月。手术后没有任何常规治疗选择，她在同情的基础上接受了供体粒细胞治疗。初步筛选20名同血型青年志愿者(大学生)，对其自身健康史和有血缘关系的家庭成员进行访谈。访谈后选择10名志愿者抽血(8cc)检测粒细胞CKA。一名20岁的志愿者的粒细胞CKA水平异常高，达到86%，对海拉细胞的E:T比为10:1，并同意捐献粒细胞。 The donor was mobilized by 300 µg G-CSF and 8 mg dexamethasone i.m. 12 hours before apheresis collection of granulocytes. The final yield of the collected leukocyte concentrate was 2.2x10e10 granulocytes with 60% purity in 300-cc volume. All the collected granulocytes were immediately infused i.v. to the patientwithin 3 hours. After the infusion, the patient had a prolonged fever between 39 and 40°C for 10 days. Such a long-lasting high fever was highly unusual for normal blood transfusion and was intentionally left untreated by medication. There has never been any symptom related to either the disease or the treatment since the treatment. It has been four years since the one-time granulocyte infusion as the last and the only treatment. She has been monitored by chest and abdominal CT scans every 6 months for first 30 months and every 12 months later. Most metastatic lesions in the lungs and liver are still visible on the CT scans but stable for the last 4 years. She has had very active daily physical exercises and had no complaints of any symptom for the last 4 years.
在临床上，供体粒细胞治疗并不比输血更困难。成功的关键可能在很大程度上依赖于找到具有高水平直接治疗活性的供体。这种治疗概念的未来完全取决于临床医生和资助机构。不管正确与否，这一概念是一个不同于其他免疫疗法的新方向，它得到了良好的常识和大量实验室努力的支持，累计价值数百万美元。如果只有少数患者从之前的所有调查努力中受益，那将是一种巨大的浪费。
Hiroshi宫本茂
罗切斯特大学医学中心
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收稿日期:2018年1月12日
录用日期:2018年2月4日
发布日期:2018年2月6日
©2018 Le w .这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放获取文章，在注明原作者和来源的情况下，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制。
乐伟，崔忠(2018)人粒细胞的天然抗癌活性。综合癌症科学治疗。5:DOI: 10.15761/ICST.1000263
威克森林大学医学院病理学系，温斯顿-塞勒姆，NC 27157，美国
图1:粒细胞CKA靶细胞谱。
图2:粒细胞CKA的季节性
图3:癌细胞和正常细胞的表面电荷
