美国马里兰州巴尔的摩市约翰·霍普金斯医疗机构索尔·戈德曼胰腺癌研究中心病理科
印度，昌迪加尔，医学教育和研究研究生院，实验医学和生物技术系
印度，昌迪加尔，旁遮普大学生物物理系
印度，昌迪加尔，医学教育和研究研究生院，实验医学和生物技术系
印度，昌迪加尔，旁遮普大学生物化学系
美国弗吉尼亚州里士满弗吉尼亚联邦大学医学院药理学和毒理学学系
印度，昌迪加尔，旁遮普大学生物物理系
DOI: 10.15761 / JTS.1000236
橄榄油是丰富的抗氧化剂来源，具有抗炎和抗肿瘤的特性;然而，橄榄油在结肠癌临床前模型中的作用尚未得到系统评估。在本研究中，我们通过研究橄榄油的凋亡机制来研究其对结肠癌发生的化学预防作用。本实验采用DMH诱导大鼠结肠癌;两组大鼠分别给予橄榄油和DMH治疗。采用流式细胞仪和共聚焦显微镜检测橄榄油的凋亡活性。通过Annexin V染色观察到，橄榄油给药直接控制坏死，正调控凋亡。透射电镜超微结构观察表明，橄榄油处理可改善DMH处理后大鼠结肠的线粒体损伤。因此，这些发现表明橄榄油在结肠癌发生中具有保护作用，并强调了通过靶向线粒体/固有细胞死亡途径进行化学预防的新见解。
化学预防，结肠癌，橄榄油，细胞凋亡，在体内
结直肠癌(CRC)是世界第三大常见癌症，也是发病率和死亡率的主要原因。每年约有120万例结肠直肠癌新诊断病例，6万多例死亡[1,2]。结肠癌的持续巨大表明控制这种恶性肿瘤疾病的新方法是必要的。化学预防是一种更好的方法来控制早期恶性肿瘤调节众多的细胞内信号级联。流行病学研究将地中海饮食与癌症化学预防联系起来，表明饮食因素显著影响人类的癌症风险[3,4]。
橄榄油是地中海饮食的重要组成部分，由于其抗氧化特性，被认为有许多有益的影响。橄榄油是一种化学预防植物化学物质，可以阻止起始过程或逆转多步骤癌变的促进阶段。几个体外研究表明，橄榄油酚除了具有抗氧化能力外，还对癌细胞具有抗炎、抗肿瘤作用[5]。相比之下，关于橄榄油预防癌症的作用及其潜在机制的文献报道较少，尤其是在结肠癌发生的动物模型中。因此，需要额外的调查来评估橄榄油在结肠癌预防中的作用，特别是在在活的有机体内条件。
因此，本研究旨在探讨橄榄油对dmh诱导的大鼠结肠癌的潜在化学预防作用。观察发现，橄榄油可以防止结肠肿瘤的形成;其预防与细胞凋亡的增强和坏死的减少有关。本研究还探索了固有的/线粒体介导的凋亡细胞死亡途径，通过检测线粒体的超微结构完整性来证实橄榄油在结肠癌发生中的潜在化学预防作用。
橄榄油购自Figarro公司，Deoleo s.a.，西班牙。每100g橄榄油的营养成分为:能量900Kcal，蛋白质0g，总碳水化合物0g，总脂肪100g(饱和脂肪13g，单饱和脂肪79g，多不饱和脂肪8g，反式脂肪0g)，胆固醇0mg，钠0mg。
所有的动物研究都是按照昌迪加尔pimer机构动物伦理委员会批准的协议进行的。体重在180至200克之间的健康雄性Sprague Dawley大鼠被分为三组，每组24只。第1组为正常对照组，每周皮下注射生理盐水。ⅱ组大鼠皮下注射新鲜制备的1,2二甲基肼(DMH)，生理盐水，每周30mg/kg体重，连续注射10、20周。ⅲ组大鼠在ⅱ组大鼠给予DMH治疗的基础上，每周口服三次橄榄油，剂量为1g/kg体重(图1)。
图1所示。橄榄油处理可诱导细胞凋亡，减少坏死。共聚焦显微镜检测对照组和治疗组大鼠的细胞凋亡/坏死。Annexin V-FITC/PI染色观察细胞凋亡诱导情况。Annexin V染色凋亡细胞膜(绿色荧光)，碘化丙啶(PI)染色坏死或死亡细胞核仁(红色荧光)，Annexin V- fitc /PI合并染色晚期凋亡细胞(双通道荧光)。放大×200。
大鼠取出组织后，立即用sorenson磷酸盐缓冲液制备的3%戊二醛固定24小时，随后用miellings缓冲液洗涤，再用1%四氧化锇固定。将样品分别以100%、90%、70%、50%的乙醇浓度在室温下分别保存3分钟和3次，然后进行过滤。随后切片包埋在1:1环氧丙烷/Epon树脂中，置于烘箱中，在60°C下聚合至少48小时。切取1µm厚的半薄切片，用1%硼砂溶液中制备的0.5%甲苯胺蓝染色。使用超微切片机切割所需区域的超薄切片，并装载在100-300目细铜网格上。切片用醋酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。这些染色切片最终在40-120 kV[6]的透射电子显微镜(日立(H-7500)千代田，东京，日本)下观察。
共焦显微镜：用冷冻器将结肠组织切成10µm切片。PBS缓冲液洗涤，AnxV-FITC孵育15分钟，Annexin结合缓冲液洗涤，再用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(Calbiochem)与碘化丙啶孵育。切片用抗褪色剂安装，使用标准设置的FITC荧光检测[7]在共聚焦显微镜(Olympus 1x81)下检查。
流式细胞仪:对于流式细胞术，分离结肠组织并切碎成小块，然后在37℃下用0.5mg胶原酶IV（Sigma）在PBS中酶解25分钟0C在摇瓶上，以500xg离心10分钟。丢弃含有碎片的上清液；用PBS洗涤颗粒细胞两次，并通过100µm细胞过滤器过滤以获得单细胞悬浮液。分离的结肠细胞最终在PBS中再悬浮。此外，使用膜联蛋白V对细胞进行凋亡分析-FITC凋亡检测试剂盒（Calbiochem）符合制造商的说明。在流式细胞仪中的BD FACS Aria II仪器上进行细胞分选[7]。
为了检测橄榄油是否调节凋亡途径，我们使用膜联蛋白V染色检测结肠细胞的凋亡率。结果通过共聚焦显微镜得到证实，并通过FACS进一步验证。有趣的是，与正常动物相比，DMH处理的结肠细胞坏死更多，凋亡更少活油治疗导致DMH治疗大鼠的坏死明显减少，早期和晚期细胞凋亡增加。
基于该技术原理，正常细胞未被Annexin V FITC−/PI−两种染料染色;早期凋亡细胞仅用Annexin V-FITC染色(Annexin V-FITC+/PI−);坏死细胞仅用PI染色(Annexin V-FITC−/PI+);晚期凋亡细胞Annexin V-FITC和PI染色均阳性(Annexin V-FITC+/PI+)。应用AnxV-FITC(绿色)和PI(红色)染色于所有治疗组和正常对照组大鼠结肠组织冷冻切片。如图2所示，对照组细胞中AnxV-FITC染色较多，说明正常对照组细胞凋亡率较高。在单独使用DMH治疗10或20周的结肠切片中，我们观察到Annexin染色较少
图2。流式细胞术检测细胞凋亡/坏死。采用Annexin V-FITC流式细胞术和pi染色法检测细胞凋亡的诱导程度。右下象限(Q4)示Annexin v阳性(早期凋亡)，右上象限(Q2)示Annexin v阳性/ pi阳性(晚期凋亡)，左上象限(Q1)示pi阳性(坏死/死亡)，左下象限(Q3)示活细胞。
V-FITC(绿色)，表明单用DMH处理的大鼠结肠组织中凋亡率明显降低。此外，我们观察到更多的PI染色(红色)，这证实了更多的细胞在坏死阶段，单独DMH处理。而DMH+橄榄油处理大鼠10周或20周结肠切片显示，大部分细胞被Annexin V-FITC(绿色)染色，而PI染色较少，说明大部分橄榄油处理的细胞处于早期凋亡阶段。另外，用这两种染料对部分细胞进行染色，表明这些细胞在这些组织中处于凋亡晚期(图2)。
同样，这些结果也显示对照细胞的Annexin-V阳性率较高（7.4%），Annexin-V/PI阳性率较高（18.1%），PI阳性率较低（14.4%），表明正常对照组的凋亡率较高。然而，Annexin-V阳性率很低（3.1%），AnnexinV/PI阳性率很低（7.45%）和更多PI阳性细胞（22.8%）在DMH处理组中，在10周时，橄榄油处理组中观察到少于20%的PI阳性细胞。而在橄榄油处理组中，Annexin V-FITC/PI染色的阳性细胞在10周时均超过25%。在DMH单独处理组和DMH+橄榄油处理组中，Annexin V-FITC/PI染色也完成。0.4%和21.55%的annexinV阳性细胞；单独DMH和DMH+橄榄油处理的细胞在20周时分别观察到48.4%和9.9%的PI阳性细胞。而与单独DMH处理相比，橄榄油处理的细胞在20周时Annexin V-FITC/PI染色的阳性细胞超过40%（图3）。
图3．橄榄油对线粒体超微结构的透射电镜影响。正常对照结肠和处理结肠的电镜图，标尺500nm。
线粒体是控制细胞死亡的中心角色，触发caspase级联反应，导致固有/线粒体介导的凋亡途径。因此，在本研究中，我们也在透射电镜下检测了治疗组和正常对照组大鼠结肠组织线粒体的活力和形态变化。正常对照组结肠切片超微结构检查显示线粒体形态和完整性保存良好，而单用dmh治疗10周或20周大鼠线粒体损伤，线粒体大小改变，基质消失，嵴紊乱，部分线粒体仅保留外膜。然而，在10周或20周时，橄榄油通过减少线粒体损伤和恢复其完整性来保护线粒体(图4)。
图。4橄榄油保护线粒体通过减少线粒体损伤和恢复其完整性
尽管一直注重癌症的早期发现和治疗，但许多人由于不重视预防而发展成疾病。因此，本研究以预防为主，成功阐明了橄榄油在结直肠癌发病机制中的作用及其潜力，重点研究了其异质性的分子基础。现在很明显，膳食制剂通过靶向不同的癌变机制抑制肿瘤生长，进而诱导凋亡[8]。同样，我们也证实了橄榄油对细胞凋亡/坏死率的直接影响，通过膜联蛋白V染色显示，与DMH处理相比，橄榄油的坏死减少，早期/晚期凋亡增加。坏死可能被认为是结直肠癌的预后因素之一，但其机制尚不清楚[9-11]。由于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)由炎症细胞分泌，可能参与诱导坏死并促进肿瘤的发展，因此，可能的原因是TNF-α诱导的NF-κB活化导致炎症介导的癌变[12-14]。然而，在癌症中，TNF是一把双刃剑，它可能是促肿瘤或抗肿瘤的。一方面，TNF可能是内源性肿瘤启动子，因为TNF通过其分子靶点NF-κB、VEGF和MMPs刺激肿瘤促进、血管生成、侵袭和转移[15-18]。另一方面，TNF可能通过JNK激活而成为一种癌症杀手，JNK是通过抑制NF-κB激活而导致死亡反应的重要因素，而NF-κB的激活进一步增加了对TNF诱导的死亡[19]的敏感性。细胞色素c的释放和caspase级联的进一步激活需要JNK的激活来诱导凋亡[20]。 Pham et al., (2004) demonstrated that activation of NF-κB inhibits TNF-α-induced apoptosis by controlling the activation of JNK cascade. Thus, the present results clearly demonstrated that olive oil may regulates apoptosis/necrosis by activation of caspase cascade and inhibition of TNF-α-induced NF-κB pathway. Our findings gain strength from the study of [21], who elucidated two mechanisms of apoptosis either by p53 mediated mitochondrial pathway that leads to the activation of caspase-9 which in turn activates caspase-3 [22] or by NF-κB-mediated pathway. This supports the present findings involving the chemopreventive role of olive oil in this process.
在观察到橄榄油对凋亡和坏死率的显著影响后，我们假设橄榄油诱导的凋亡是由于线粒体/固有凋亡途径的激活。因此，我们希望观察橄榄油对线粒体形态学的影响，以证实上述假设用透射电镜观察结肠组织线粒体的活力和形态变化。
线粒体动力学的作用不仅仅是维持形态，还影响细胞死亡，它的改变对炎症性肠病、结肠炎和结肠癌患者很重要[23-25]观察了dmh诱导的大鼠模型中结肠组织肿瘤腺体中线粒体的增生和杯状细胞的缺失。其他研究表明，与对照组相比，在dmh处理过的动物和人类结肠癌活检中，线粒体数量是不同的[26,27]。同样，我们也观察到了DMH处理大鼠结肠线粒体的改变，而已经证明橄榄油处理可以改善DMH处理后退化的大鼠结肠线粒体损伤[28-30]。目前尚无DMH损伤后结肠组织超微结构检查及橄榄油联合治疗的资料。由于[24]表明线粒体是一个动态结构，在细胞的整个生命周期中不断进行融合和裂变过程，可能在本研究中，橄榄油保持了线粒体的分裂-融合过程之间的平衡，以维持其功能水平。然而，还需要进一步研究橄榄油治疗后线粒体的动态结构，这可能进一步解释橄榄油在结肠癌发生中的化学预防作用。
本研究揭示了橄榄油在实验动物中预防结肠癌发生和发展的潜在作用。橄榄油的作用方式可能是激活线粒体/固有凋亡通路，其特征是改变线粒体结构和凋亡率，这可能与抑制炎症通路有关。因此，目前的研究结果可能为橄榄油在结肠癌发生的不同阶段的化学预防作用建立一个有说服力的案例，并为未来研究转化为人类受试者控制早期恶性肿瘤开辟了新的前景。
我们感谢Sunil Kumar先生帮助开展动物工作，并感谢Rekha verli女士提供的技术援助。
我们感谢印度新德里的印度医学研究理事会(ICMR)为研究工作提供的财政支持。所有作者都没有利益冲突。
研究文章
收到日期：2018年3月28日
录用日期:2018年4月13日
出版日期:2018年4月17日
©2018 Dhawan DK。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
Nanda N，Mahmood S，Mahmood A，Bhat M Owais，Dhawan DK（2018）橄榄油通过触发线粒体凋亡途径抑制DMH诱导的结肠肿瘤生长：一项体内研究。J翻译Sci 4:DOI:10.15761/JTS.1000236
图1所示。橄榄油处理可诱导细胞凋亡，减少坏死。共聚焦显微镜检测对照组和治疗组大鼠的细胞凋亡/坏死。Annexin V-FITC/PI染色观察细胞凋亡诱导情况。Annexin V染色凋亡细胞膜(绿色荧光)，碘化丙啶(PI)染色坏死或死亡细胞核仁(红色荧光)，Annexin V- fitc /PI合并染色晚期凋亡细胞(双通道荧光)。放大×200。
图2。流式细胞术检测细胞凋亡/坏死。采用Annexin V-FITC流式细胞术和pi染色法检测细胞凋亡的诱导程度。右下象限(Q4)示Annexin v阳性(早期凋亡)，右上象限(Q2)示Annexin v阳性/ pi阳性(晚期凋亡)，左上象限(Q1)示pi阳性(坏死/死亡)，左下象限(Q3)示活细胞。
图3．橄榄油对线粒体超微结构的透射电镜影响。正常对照结肠和处理结肠的电镜图，标尺500nm。
图。4橄榄油保护线粒体通过减少线粒体损伤和恢复其完整性
