日本大阪牙科大学牙科学院药理学研究室
日本长崎大学生物医学研究生院前沿生命科学系
日本国立癌症中心研究所合作研究实验室细胞信号部
DOI: 10.15761 / RRI.1000137
包括3-氨基苯酰胺(3-AB)在内的聚(adp -核糖)聚合酶(PARP)抑制剂可抑制γ辐照后DNA损伤后的G1阻滞，这表明PARP家族的主要蛋白PARP1参与了G1阻滞的诱导。此外，γ辐照后p53的稳定不受抑制，但p53反应性的短暂增加WAF1 p21 / CIP1 /和MDM2mRNA被3-AB抑制。因此，我们认为PARP1作为p53依赖的信号转导通路的下游介质，通过调控WAF1 p21 / CIP1 /和MDM2信使rna表达。在这篇综述中，我们讨论了DNA损伤后p53细胞周期检查点及其与PARP1的相关性。此外，还将提出PARP1作为DNA损伤传感器的作用。p53和PARP1活性的调控是开发特定疾病临床治疗的一个有吸引力和前景的靶点。因此，预计在不久的将来，特异性调节PARP1活性的药物的临床应用将得到发展。
PARP1, p53，信号转导通路，G1阻滞
在癌症的发展过程中，与细胞周期进程的调控直接相关的基因会出现多种异常[1]。视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, RB)蛋白是一种具有肿瘤抑制功能的细胞周期调节蛋白，据报道其突变发生在多种类型的癌症中[2]。此外，在许多癌症中，细胞周期蛋白D被染色体易位和/或扩增激活[3]。此外，抑制cyclin D依赖性激酶活性的p16/MTS1被发现是一种新的肿瘤抑制基因，在黑色素瘤、结肠癌、乳腺癌等中失活[4,5]。大约50%的人类癌症与p53肿瘤抑制基因突变有关[6,7]。在75%的这些癌症中，检测到氨基酸取代的错义突变[8]。据土田说等．大约90%的人口腔鳞状细胞癌细胞培养物中存在P53突变[9]。
p53诱导p53靶基因的转录，表现出多种功能，涉及DNA损伤、衰老、癌症、基因激活、缺氧应激等调控。由于p53靶基因存在多样性，除了具有细胞凋亡、细胞周期阻滞、DNA修复、p53活性抑制等常规功能外，还有细胞发育、免疫、表观遗传调控、未分化细胞状态维持等功能被报道[10]。在细胞周期阻滞(DNA损伤后p53稳定)过程中，p53的一个重要功能是诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (WAF1/CIP1/p21)。WAF1/CIP1/p21是一种转录调节因子，可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase, CDK)，并在G1期延迟或终止细胞周期[9,11-13]。G1期阻滞检查点机制调节正常细胞周期，并被认为与DNA损伤后的癌变密切相关。在细胞中p53突变或缺乏时，G1期阻滞不会发生，即使在DNA损伤后，由于p53的异常转录调控，也会进展到S期[11,14]。因此，假设DNA损伤积累导致突变细胞进展为癌症。
对于癌症放疗或化疗的耐药，DNA损伤后细胞周期阻滞在G1和G2期被认为是一个重要因素。据了解，癌症基因如大鼠肉瘤癌基因同源基因(拉)、骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(MYC)和快速加速的纤维肉瘤(英国皇家空军)随细胞的辐射敏感性而变化[15-17]，因此，DNA损伤后细胞对细胞周期阻滞的反应被认为是决定辐射敏感性的重要因素和机制之一。伽马射线在细胞中产生受激分子和离子分子。虽然所有细胞内分子都是靶向的，但DNA损伤大致分为直接效应和间接效应[18]。直接效应是由电离辐射能量与DNA直接接触引起的。这种间接效应是由自由基与DNA的相互作用引起的。水分子(H2O)是细胞内最常见的分子，自由基-包括羟基自由基(HO·)，氢原子(H·)和水合电子(e-aq) -由H产生2因此，H。2O被认为是间接效应最强的分子。由于这些直接和间接电离辐射效应造成的损害发生在构成DNA的碱基或糖-磷酸二酯框架上。虽然检测细胞中存在的碱基的实际损伤是困难的，因为它们不稳定，糖-磷酸二酯框架的损伤是可检测的，因为它主要以DNA链断裂(DSBs)的形式出现。DSBs主要发生在磷酸二酯键的断裂，在一定程度上也发生在脱氧核糖环的分解。
伽玛射线损伤DNA后，细胞周期阻滞主要发生在G1期和G2期。DNA修复被认为发生在细胞周期进入S期或M期之前。Kastan等人提出上述事实，即p53基因产物是G1期阻滞的关键分子[19]。他们研究了各种细胞对伽马射线的反应，并报道了p53缺陷细胞在伽马辐射后表现出G2期阻滞，而不是G1期阻滞。此外，在接受紫外线(UV)、4-硝基、4-亚硝基喹啉-1-氧化物或DNA损伤因子(包括伽马射线和放线菌素d)处理的细胞中，由于翻译后机制延长了p53的半衰期，p53水平升高[20,21]。先前的报道表明，p53识别DNA链断裂的末端，并结合到这些链上[22,23]。认为半衰期延长的p53在细胞内积累，激活或抑制含有p53结合序列的靶基因的转录，诱导G1期阻滞。
p53形成四聚体，通过p53共识结合序列(由RRRCWWGYYY [R: a /G, Y: T/C, W: a /T]组成的10个mer序列串联重复两次，间隔0-13 bp分隔)结合靶基因发挥转录因子的功能[24,25]。p53激活基因的转录，如生长阻滞和dna损伤诱导蛋白(GADD45)、小鼠双分2同源物(MDM2)，WAF1 p21 / CIP1 /、表皮生长因子受体(表皮生长因子受体)、肌酸激酶(CK)(途径)。此外，p53被认为与大T抗原结合，而大T抗原是dna型癌病毒SV40[2,29]、腺病毒E1B[30]和乳头瘤病毒E6的致癌基因产物。这些病毒衍生的癌蛋白抑制p53的转录活性并导致细胞转化[31]。此外，据报道，致癌基因产物MDM2可直接与p53结合[32,33]。在自然转化的细胞中，MDM2异常扩增的MDM2[34]，这种异常MDM2分别发生在大约30%和15%的人骨肉瘤和乳腺癌中。据认为，MDM2泛素化、降解并与p53结合，参与p53的负反馈调控，抑制其转录调控活性[35,36]。一种与MDM2/MDMX结合，通过抑制MDM2与p53的相互作用来抑制野生型p53降解的低分子量化合物作为分子靶标药物受到关注，并进行了临床试验[37]。
本节将介绍DNA损伤后G1期阻滞机制的相关信息。DNA损伤后，p53发生稳定化和细胞内积累，因此其转录激活能力增强。作为一种转录调节因子，p53诱导一种抑制G1 cyclin和CDK复合物酶活性的蛋白的表达[38]。该蛋白被鉴定为WAF1/CIP1/p21，与衰老细胞来源的抑制剂1 (SDI1)基因产物，其表达随细胞衰老而增加[39]。此外，人们认为，通过CDK复合物抑制RB磷酸化和转录调节因子(如受RB调控的E2F)的活性，WAF1/CIP1/p21阻碍G1/S过渡所需基因的转录，从而导致G1期阻滞。从DNA损伤到p53水平升高的过程在后面的句子中被阐明。有报道称，在失调性毛细血管扩张患者的B淋巴细胞培养物中，未观察到DNA损伤后p53水平升高[19]。此外，有报道称共济失调的致病基因产物参与了从DNA损伤到p53升高的信号通路。
已知DNA损伤后G1期阻滞与细胞凋亡密切相关。例如，在γ照射下的B淋巴细胞中，生长因子存在和不存在时分别诱导G1期阻滞和凋亡[38]。与G1期阻滞类似，凋亡可能伴随着p53的稳定[38]。因此，DNA损伤的定量信息可能是伽马辐照后细胞选择G1期阻滞或凋亡的决定因素。换句话说，当DNA损伤程度较低时，细胞可能会选择G1期阻滞，而当DNA损伤程度较高时，细胞可能会选择凋亡。重要的问题是，DNA损伤的定量信息是由什么传感器感知的，这些定量信息是通过什么信号传递给关键分子p53的?
与G1期阻滞机制不同的是，G2期阻滞发生在有p53突变。长期以来，人们一直在芽殖酵母中进行遗传分析，其中有六个基因(RAD9、RAD17、RAD24、MEC3、MEC1、MEC2)已被确定为G2相阻滞所必需的[40,41]。此外，在上述基因中，MEC1和MEC2在完成DNA复制的步骤中是不可缺少的。芽殖酵母菌芽殖酵母菌的人类同源物RAD24被鉴定并发现与一种促进细菌单核苷酸(adp -核糖)转移酶adp -核糖基化反应的哺乳动物细胞因子相同，称为14-3-3蛋白[42]。由于14-3-3蛋白与多瘤病毒的中间T抗原结合[43]，被认为参与了细胞膜与细胞核之间的DNA损伤信号传导。然而，如前所述，哺乳动物细胞中G2期阻滞机制的分析进展不如酵母细胞。因此，G2期阻滞的DNA损伤传感器是否与G1期阻滞的DNA损伤传感器不同，以及DNA损伤定量信息传递的机制尚不清楚。
Poly(adp -核糖)合成酶1 (PARP1)参与了高进化真核生物(如哺乳动物)细胞核对DSBs的生理反应。PARP1特异性识别dsb，并以β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD)为底物迅速合成聚(adp -核糖)链。已知PARP1组成性地存在于特定细胞的细胞核中，其比例约为1 / 10kb DNA[44]。PARP1活性存在于大多数真核生物细胞核中，包括黏菌、动物和植物[45,46]。作为一个例外，在哺乳动物的成熟粒细胞(细胞核呈棒状或分节状的白细胞)中未观察到PARP1的活性[47]。大多数PARP1存在于细胞核的染色质中[48,49]。免疫组织学观察表明，在某些类型的细胞中，它存在于细胞核外围(异染色质区)[47]。蛋白质和基因水平的分析表明，PARP1具有三个功能域，这些功能域在不同物种中都很保守[50]。PARP1通过其锌指与DNA缺口结合，锌指在缺口部分的外围分布超过30个碱基[51,52]。此外，PARP1的初始激活发生在其与单链或双链DNA断裂末端的结合上[53]。 PARP1 catalyzes the poly ADP-ribosylation of proteins containing glutamic and aspartic acid residues. Histone H1 and H2B, high-mobility group (HMG) proteins, DNA polymerase α and β, and topoisomerase I and II are well-known acceptor proteins of poly (ADP-ribose). It was reported that poly ADP-ribosylation inhibits the enzyme activity of acceptor proteins and causes histones to lose affinity toward the DNA. Moreover, when PARP1 loses its affinity toward the DNA, its ability to synthesize poly (ADP-ribose) is suppressed owing to the auto-poly-ADP-ribosylation reaction [54-56]. Studies regarding the physiological functions of PARP1 were performed in the presence of a PARP inhibitor, and the involvement of PARP1 in DNA repair was identified by enhancing cytotoxicity through various DNA damaging treatments such as exposure to gamma rays [57,58]. Since PARP1 specifically recognizes DNA broken ends, it is believed to participate in DNA repair, by removing the damaged DNA portion after breakage. It was reported that DNA repair against alkylating agents is inhibited exclusively in mutant cells with low PARP1 expression or dominant negative mutants that contain a high number of DNA binding sites [59]. Furthermore, in an experiment, the DNA repair was delayed when PARP1 anti-sense RNA was ectopically expressed in cells to inhibit PARP1 function [60]. Moreover, in the cell-free DNA repair system, DNA repair is temporarily interrupted depending on the PARP1 efficiency in the presence of NAD [61]. Additionally, other reports have indicated that PARP1 highly promotes DNA ligase activity on the chromatin DNA [62]. The previously proposed histone-shuttling model indicates that the loss of affinity of poly-ADP-ribosylated histones for DNA causes the structure surrounding DNA broken ends to further loosen, and thereby promotes DNA repair [63]. PARP1 is necessary for DNA replication as approximately 10 Kb DNA replication intermediates were accumulated in cells upon treatment with a PARP1 inhibitor [64]. Additionally, owing to the facts such as an increase in the sister chromosome conversion frequency [65], loss of amplified原癌基因在HL-60细胞中[66]，NIH 3T3细胞中外源癌基因的缺失[67]表明PARP1参与了DNA重组。在基因转录方面，利用PARP1反义RNA表达质粒进行的实验表明，γ干扰素(γ-IFN)诱导主要组织相容性复合体(MHC) II类基因表达反过来是由PARP1抑制诱导的[68]。此外，有报道称，紫外线对DNA损伤过程中HIV长末端重复序列的转录可以被PARP抑制剂抑制[69]。因此，PARP1参与引起dsb的各种生理条件是已经确定的。我们发现PARP抑制剂，包括3-氨基苯甲酰胺(3-AB)，抑制γ辐照后dNA损伤后的G1阻滞，这表明PARP1对诱导G1阻滞至关重要。此外，我们发现p53的稳定不受γ辐照的抑制，p53的响应性短暂增加WAF1 p21 / CIP1 /和MDM2mRNA被3-AB抑制。因此，我们认为PARP1参与p53依赖的G1阻滞信号转导通路是通过WAF1 p21 / CIP1 /和MDM2mRNA表达[70,71]。
由于PARP1在细胞核中组成性表达，它特异性识别dsb，并以NAD为底物合成与dsb数量相对应的聚(adp -核糖)链。因此，它被认为是一种很有前途的监测DNA损伤的传感器。dsb的及时信号和关于dsb的大量信息的准确传输被认为是传感器分子的必要能力。γ辐照后，PARP1以大约每几Kb DNA中一个的比例存在，通过消耗NAD以剂量依赖的方式快速合成poly (adp -核糖)。例如，2gy γ辐射在细胞中产生大约1000条单链断裂。考虑到3 × 10-18年每个细胞在2 Gy辐照后30分钟内消耗NAD分子的摩尔数，计算出约为105每个细胞通过DNA链断裂产生平均链长为20分子的聚腺苷核糖分子。类似地，大约是5 × 106在100 Gy辐照下可合成聚adp核糖分子。相反，当p53识别dsb时，另一种理论认为p53可能是dsb的直接信号[23]。然而，免疫沉淀实验表明，大约有104正常情况下每个细胞都存在P53分子，因此P53不太可能直接有效地传递≥10的大量信息4双边带。因此，我们认为poly (adp -核糖)可能是传递dsb上大量信息的更有效的信号候选者。由于能够结合DNA断裂端，p53和PARP1被认为是G1期dsb检测的潜在信号分子。几种p53亚型和家族成员已被确定，多个报告表明，一些亚型与p53相互作用，并反激活特定的靶基因群[72-74]。此外，野生型p53与某些p53亚型之间的合作是否可能传递有关dsb的大量信息还有待探索。如果PARP1传递了关于dsb的定量信息，那么选择是直接进行poly- adp核糖基化还是PARP1与其他信息传递因子相互作用，需要对信息传递因子进行研究，才能完全了解其机制。之前，我们使用western blot方法发现了与PARP1非共价相互作用的细胞内蛋白的存在[75]。在未来，广泛的研究对于理解感知和传输关于dsb的大量信息的传感器分子是必不可少的。
由于突变型p53在癌细胞中稳定积累，癌症患者常表现为p53抗体阳性;因此，p53抗体被用作肿瘤诊断的标志物[76]。能够将这种突变型p53转化为野生型的药物可能有助于癌症的治疗[77,78]。目前正在开发能够激活p53通路而不造成DNA损伤的抗癌药物[79,80]。通过调节细胞死亡来提高正常组织抗辐射能力的保护剂的开发目前正在进行中。由于p53调节因子选择性地保护表现出正常p53功能的正常组织免受DNA损伤引起的细胞死亡，而不保护表现出异常p53的癌细胞，因此它可能被用于克服放射治疗的剂量限制和减少抗癌药物的副作用[81,82]。已知p53的变性和失活是由于p53中配合锌离子结合位点的锌离子的解离和锌以外的金属离子的替代[83]。此外，已经研究了靶向p53中锌结合位点的化合物。然而，抑制p53功能的药物会增加促进癌变的风险。因此，人们正在努力通过诱导WAF1/CIP1/p21的表达和抑制p53上调的促进细胞死亡的凋亡调节剂的表达来防止p53依赖性细胞死亡[84]。 It is anticipated that these p53 target drug discoveries will encourage the development of novel radiation protection agents. Similarly, because PARP1 participates not only in DNA repair but also in the p53-dependent cell-cycle check-point after DNA damage, we believe that cell death control via the regulation of PARP1 activity might be useful for future applications in cancer therapy. Although PARP inhibitors that block PARP family proteins have started to be employed in clinical settings, we predict the development and clinical application of drugs that will specifically regulate PARP1 activity.
作者已声明不存在利益冲突。
评论文章
收稿日期:2018年6月21日
接受日期:2018年7月9日
发布日期:2018年7月11日
©2018 Nozaki T.这是一篇根据知识共享署名许可条款发布的开放获取文章，该许可允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。
Nozaki T, Masutani M (2017) DNA损伤后p53依赖性细胞周期检查点及其与PARP1的相关性。Res Rev Insights 2: DOI: 10.15761/RRI.1000137
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