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收稿日期：2017年10月02日，
接受日期:2017年10月16日
发布日期：2017年10月18日
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©2017花王LP。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。
引文
Kao LP, Wolvetang EJ(2017)多能干细胞与线粒体功能障碍。医学临床弓1:DOI: 10.15761/MCA.1000113
美国印第安纳州西拉斐特普渡大学基础医学系
美国印第安纳州西拉斐特普渡大学癌症研究中心
澳大利亚生物工程和纳米技术研究所，昆士兰大学，布里斯班，QLD，澳大利亚
澳大利亚生物工程和纳米技术研究所，昆士兰大学，布里斯班，QLD，澳大利亚
DOI：10.15761 / MCA.1000113
胚胎干细胞（ESC）来自胚泡的内部细胞质量（ICM）。ESC和诱导多能干细胞（IPSC）线是不朽的，这意味着它们具有无限增殖潜力。它们也是多能的;也就是说，它们可以分化为衍生自胚胎的所有3个主要胚层的谱系。因此，在再生医学疗法的发展中已被广泛研究这些细胞。人类的ESC被视为调查人类胚胎早期发展的重要研究工具。
线粒体是细胞内提供大部分能量和执行重要代谢功能的能量库，如克雷布斯循环。著名的内共生理论[1]的研究表明，线粒体最初来自原核细胞，原核细胞入侵较大的有核宿主细胞。线粒体确实以圆形的形式包含自己的线粒体DNA (mtDNA)，类似于细菌基因组。线粒体基因组编码真核生物呼吸机制的几个基本基因。然而，呼吸机制的大部分组成部分和控制线粒体生物发生的因素是在细胞核中编码的。线粒体和细胞核之间的合作和交流是通过逆行信号进行的，如能量供应和氧化还原信号，而这种目前尚不清楚的交流对于平衡细胞内能量的生产和需求至关重要。利用多能干细胞靶向线粒体代谢治疗遗传性疾病仍是细胞治疗的主要方向。
多能干细胞，人类胚胎干细胞
干细胞具有独特的自我更新能力[2］．在哺乳动物的发育过程中，受精卵细胞能够分化成各种类型的细胞，因此被称为全能细胞。“Totipotent”源自拉丁语totus，意思是“完整的”。全能干细胞有能力产生胚胎和胚胎外组织中发现的所有类型的细胞。受精卵母细胞分裂并发育成8个细胞的胚胎，然后形成囊胚。胚泡由外层细胞(滋养层细胞)和内层细胞组成，内层细胞构成内层细胞团(ICM)。ICM可以发育成成人身体的所有类型的细胞，因此被称为“多能性”，这个术语来自于拉丁词plures，意思是“几个”或“许多”。多能干细胞，如小鼠胚胎干细胞(mESCs)、人类胚胎干细胞(hESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)，可以分化为外胚层、中胚层、内胚层和生殖细胞[3.］．
一旦胚泡来源的细胞完全分化成组织或器官，驻留在各种组织和器官中的干细胞就会留下来，以便生成新的组织或修复受损的组织。这些干细胞，被称为多能干细胞或成体干细胞(ASCs)，包括间充质干细胞(或基质)细胞(MSCs)和造血干细胞(造血干细胞)。与全能细胞和多能细胞相比，它们的分化能力是有限的。例如，在骨髓中发现的造血干细胞可以分化为红细胞和白细胞(包括巨噬细胞)。这些类型的细胞对体内平衡很重要，因为它们能使组织稳定地自我更新。
多能干细胞有不同的类型:胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)、胚胎生殖细胞(EGCs)和胚胎癌细胞(ECCs)。胚胎干细胞从囊胚的ICM中分离出来(图1)[4.]，而iPSC中被人为地通过重新编程使用定义的一组转录因子的体细胞生成的。的iPSC类似于在人类胚胎干细胞形态，基因表达和分化能力[5.］．人胚胎生殖细胞（hEGCs）从原始生殖细胞（PGC的）衍生的，并且多能干细胞[6.］．胚胎癌细胞(ecc)是从畸胎瘤中提取的干细胞，畸胎瘤是由胚胎组织(如睾丸或卵巢)或外植细胞培养产生的肿瘤[7.］．ECCs被认为是hESCs的恶性对等物。
图1。HESC隔离和文化程序。HESC来自胚泡（左）的内部细胞质量。对于长期培养，HESC在用作饲养层的灭活小鼠胚胎成纤维细胞上生长[13］．
Evans和Kaufman(1981)是第一个从早期小鼠胚胎中获得ESCs的[8.］．1998年，汤姆逊和他的同事报告的人类胚胎干细胞系的第一个成功的推导[9.];这些台词至今仍被广泛使用。它们能够在体外未分化状态下广泛增殖，并有能力分化为所有三个胚层[6.那10］．胚胎来源的胚胎干细胞是从体外受精(IVF)过程中丢弃的囊胚中建立的。
IPSCS是人工产生的多能干细胞类型。IPSCS将从成年体细胞重新编程，通过转录因子的强制表达，例如OCT4，SOX2，纳米，C-MYC，KLF4和LIN28来从成年细胞中重新编程干细胞样性能。Takahashi和Yamanaka引入了四种多能基因-OTT4，SOX2，C-MYC和KRUPPEL样系列转录因子4（KLF4） - 可以将小鼠成纤维细胞重新编程成小鼠诱导的多能干细胞（MIESC）或人的成纤维细胞进入人诱导的多能干细胞（HIPSC）[11］．Thomson和他的同事使用Oct4和Sox2与Nanog和Lin-28同源物(Lin28)结合，而不是c-myc和Klf4，将人类成纤维细胞重新编程成hiPSCs [12］．这些诱导多能干细胞表达干细胞标记物，并能在体内畸胎瘤中分化为三个胚层。
iPS细胞具有的优点是它们不需要胚胎的破坏。此外，考虑到他们的出身，他们提供了一个完美的匹配到细胞供体（完全同基因），因此可能会避免捐赠者的免疫系统排斥。
未分化的hESCs表达高水平的细胞表面抗原，可作为干细胞特异性多能性标记物。这些抗原包括:(1)糖脂类，如阶段特异性胚胎抗原SSEA-3和SSEA-4 [14];(2)糖蛋白，如tra1 -1-60、tra1 -81 [15];(3)碱性磷酸酶[4.那16那17］．多能性标记包括转录因子八克-4，POU结构域，5，转录因子1（OCT4或POU5F1）[18 - 20];性别决定区Y-box 2 (SOX2) [21];和Nanog同源框（NANOG）22那23]这些分子标记提供了一种鉴定多能干细胞的方法，其表达的降低可用于监测分化的开始。封闭症的自我更新的分子机制尚未完全阐明。
研究不同干细胞系中的基因表达可以为干细胞如何控制多能性和分化提供重要的见解。许多研究已经通过检测hESC基因表达来研究相关的分子机制，并报道了不同hESC系中基因表达的差异。Rao和Stic(2004)报道了两种细胞系的微阵列谱有75%的相似性;在另一项研究中，48%的表达基因局限于一个或两个株系[24］．然而，在同一实验室衍生的hESC系中，已经观察到基因表达的变化[25]甚至在不同媒体三次通道后的相同的HESC线（38％）[26］．基因表达在自发分化过程中也会发生变化[27］．例如，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)及其受体在未分化的hESCs中表达较低，但在分化过程中表达增加。多能性相关启动子如NANOG和OCT4/POU5F1在多能性和分化细胞中观察到差异DNA甲基化。了解hESCs中的基因表达将有助于阐明人类发育障碍的正常分化和异常过程的分子基础。
已经表征了维持干细胞多能性的几个外部信号。外部信号也被认为在ESC自我更新和分化的调节中发挥重要作用。例如，HESC的多能程度由几种信号通路保持[28];
外源性bFGF的是在用于维持在体外未分化的hESC和hiPSCs的的限定的人类胚胎干细胞培养基中的重要因素。bFGF的撤回诱导多能性标志物的下调和人类胚胎干细胞的分化。这表明，FGF信号传导在人类胚胎干细胞和iPS细胞[中自我更新和多能性调节中起重要作用29那30.]
TGF-β/激活素/结节分支在未分化的hESCs中高度活跃。该通路通过激活SMAD2/3和诱导多能性标记Oct4和Nanog的表达来支持未分化hESCs的自我更新[31那32］．TGF-β/ Activin / Nodal-Smad2 / 3信号通路对于维持HESC的自我更新和多能性是重要的[33］．
PI3K蛋白在未分化细胞中高表达，在分化的ESCs中下调[34.那35.］．通过PI3K抑制剂Ly294002阻断PI3K信号通路导致多能性标记的丧失并引发细胞分化[36.］．此外，PI3K信号通路的激活可诱导PI3K依赖的PKB/Akt和GSK-3α/β蛋白磷酸化。
最初，人类胚胎干细胞培养在照射小鼠饲养或人包皮成纤维细胞[37.］．然而，暴露于动物衍生的培养成分是饲料依赖性系统的缺点[38.］．由于人类胚胎干细胞和人iPS细胞是未来人类细胞移植有吸引力的候选人，是细胞的优化良好生产规范（GMP）的推导兼容系统，规模化，以及银行和其相应的质量保证控制[重要39.那40］．因此无饲养系统在组合越来越多地用于与专为人类胚胎干细胞的生长设计的不含异源定义的培养基中，并符合GMP的涂布基材[41.，包括层粘连蛋白和纤维连接蛋白。
在体外和体内，hES和iPS细胞可以从三个原始胚层分化为细胞类型:外胚层、中胚层和内胚层[4.那6.那16(图2)。这些细胞的分化能力通常是通过评估它们在细胞培养中的自发分化(即在体外形成胚胎体或EBs)来测试的。在去除生长因子(如bFGF)或饲养层和/或转移到悬浮条件下，hESCs进行自发的无引导分化成不同胚层的各种细胞。在二维(2D)自发分化的hESCs中，不同的形态表现为上皮细胞、具有轴突和树突的神经细胞以及具有间充质特征的细胞[42.］．在悬浮液中，该胚胎干细胞形成分化和称为未分化细胞的胚状体（EB），其类似于早期植入后胚胎并通过一系列分化阶段的[频繁进步的多细胞聚集体37.那43.那44.］．通常情况下，EBs被允许生长数天或数周，每隔一段时间采集样本，通过流式细胞术或免疫细胞化学染色进行分析。在体外和体内的分化评估包括确定衍生细胞是否获得了各种外胚层、中胚层和内胚层样特性(以及多能性标记物的缺失)。体内多能性的评估是由异种移植为,则严重联合免疫缺损(SCID)小鼠,观察畸胎瘤与衍生品的所有三个生殖形成的层,这表明注射干细胞有能力分化以及三种细胞系(4.那16］．
图2。未分化的hES细胞(A)可分化为三个原始胚层的细胞类型:(B)外胚层分化的神经元细胞，(C)内胚层分化的胰腺细胞，(D)中胚层分化的心肌细胞。这个数字改编自霍夫曼和卡朋特2005年[13］．
直接ESC的朝向特定细胞类型，分化如神经元细胞类型或心肌细胞的细胞类型，在单层培养人类胚胎干细胞是通过饲养细胞暴露于某些生长因子或刺激物和细胞外基质组分，无论是直接或间接[45.］．
维甲酸(RA)诱导人类胚胎干细胞向外胚层分化[46.］．RA及其受体通过启动神经元前体的细胞分化在中枢神经系统的发育中发挥重要作用[47.］．一些论文报道RA诱导神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y人多巴胺能神经母细胞瘤细胞)的神经分化[48.那49.]人类幼幼细胞白血病HL-60细胞[50.］．此外，RA还诱导胚胎干细胞分化为神经元细胞[46.那51.那52.]，包括神经元和神经胶质细胞。为了提高神经细胞的分化的效率和可重复性，一些研究已经尝试添加小分子。例如，艾德尔森男，et al。研究表明，烟酰胺促进hESCs分化为神经细胞，随后分化为视网膜色素上皮细胞[53.］．此外,卢SJ.那et al。已经描述了一种稳健的系统，该系统有效地产生大量来自多个hESC细胞系的成血管细胞，并产生大规模与携氧能力官能均一红细胞[54.］．早期外胚层分化的标记有配对盒基因6 (PAX6)、SRY(性别决定区Y)-box 1 (SOX1)、巢状和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。布里格斯杰,et al。已经成功地证明了神经元分化通过一个复杂的协议[55.］．
中胚层分化已经被广泛研究，特别是控制心肌细胞中胚层形成早期阶段的蛋白质生长因子家族[56.］．哈德逊J,et al。已经使用小分子靶向无翅/ INT（Wnt信号）信号通路，以诱导胚胎干细胞分化成搏动心肌细胞[57.］．早期中胚层分化的生物标志物包括T-box因子Brachyury (BRY或T)、同源结构域蛋白MIXL1和肌凝蛋白[57.]
内胚层分化形成多种组织，包括肝、肺、甲状腺和前肠内胚层。调控内胚层向前肠内胚层前-腹区分化的早期蛋白生长因子家族通过转化生长因子- b (TGF-B)超家族成员和SMAD信号通路中的Nodal进行信号定位[58.］．早期内胚层分化的生物标志物是胰岛素样生长因子2 (IGF2)和gata结合因子(GATA4);SRY(性别决定区Y)-box 17 (SOX17)也是明确的前肠内胚层(Kanai- azuma, Kanai，et al。2002年,录像,Kurisaki,et al。2009）。关于在HESC谱系特异性分化过程中，关于线粒体生物发生相关基因的表达很少。
线粒体基因组突变或缺失或线粒体缺失引起的线粒体功能障碍症状可在全动物和细胞模型中观察到。一些研究已经描述了由于线粒体基因组突变或缺失而导致线粒体异常的小鼠。为了证明线粒体形态和功能在细胞特异性功能中的重要性，我们建立了线粒体耗尽细胞，称为ρ零细胞(ρ零˚)，该细胞的mtDNA被耗尽，通过应用不同的药物，如溴化乙啶、抗生素等在体外生成[59.或核苷类似物逆转录酶抑制剂(NARTI，一种抗艾滋病病毒药物)。ρ˚细胞具有以下几个共同特征:(1)它们成为自养细胞，依靠嘧啶(尿嘧啶)和丙酮酸的补充来生长[60.那61.];（2）它们具有低MTDNA拷贝数和低表达线粒体编码基因，但不具有核编码基因;（3）它们具有低线粒体呼吸链复杂的活动，除了复杂的II外;（4）它们具有低ATP浓度，呼吸率（氧气消耗）和线粒体膜电位;（5）如果给予补充丙酮酸，它们会从有氧运动转移到厌氧代谢;（6）它们具有未成熟的线粒体结构，具有减少的嵴膜，圆形形态和管状结构的损失。
一些研究发现，当氧消耗降低时，抗氧化剂可以逆转ρ˚细胞中增加的ROS生成。此外，ρ˚细胞的细胞增殖、有丝分裂细胞周期蛋白基因表达、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、视网膜母细胞瘤1磷酸化和端粒酶活性均降低[62.那63.］．在ρ˚细胞中，相对于对照组细胞，线粒体生物发生相关基因表达上调[64.那65.］．
有趣的是，研究表明，ρ˚细胞对细胞凋亡的抗性增强。然而，在staurosporine诱导的细胞凋亡过程中，细胞色素c在线粒体内呈正态分布(尽管mtDNA水平低和呼吸功能缺陷)。同样地，在ρ˚细胞中，caspase 3的活化和DNA片段不受影响。然而，NF-κB的定位发生了改变(即NF-κB在细胞核中的位置多于在细胞质中的位置)，这可能与观察到的抗凋亡有关。此外，在ρ˚细胞中，更大的质量与溶酶体和过氧化产物有关[65 - 67］．值得注意的是，SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞向神经元样细胞的分化不受缺陷线粒体的影响，可见长神经突和分泌颗粒的存在，这是神经母细胞瘤细胞分化的典型特征[68.］．因此，通过使用多能干细胞靶向线粒体代谢或突变线粒体相关基因用于遗传性疾病仍然是细胞疗法的重大的治疗方向。
作者表示没有潜在的利益冲突。
这项工作得到了作者贡献的支持。写或贡献了手稿的写作:花王和狼vetang。
作者想感谢澳大利亚研究生奖的财政支持，以及澳大利亚干细胞中心的核心hESC实验室(Stem Core)提供的细胞培养和支持服务的支持，普渡大学以工资的形式为KLP提供支持，但在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿的准备中没有任何额外的作用。
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Kao LP, Wolvetang EJ(2017)多能干细胞与线粒体功能障碍。医学临床弓1:DOI: 10.15761/MCA.1000113
美国印第安纳州西拉斐特普渡大学基础医学系;普渡大学癌症研究中心，西拉法叶，印第安纳州，美国;澳大利亚生物工程和纳米技术研究所，昆士兰大学，布里斯班，QLD，澳大利亚
