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摘要

在细胞毒性治疗之前对卵巢组织进行冷冻保存，然后进行组织移植，这种做法越来越普遍，在怀孕和分娩方面的总成功率已在病例系列中进行了描述。大多数妊娠是在原位组织移植(腹膜或剩余卵巢)后实现的，但手术中移植部位的治疗存在争议。在这项观察性病例系列研究中，我们纳入了2012年至2016年期间通过腹腔镜进行卵巢组织移植的4例患者。以前，卵巢组织在化疗和/或放疗前采用慢速冷冻方案冷冻保存。肿瘤缓解后，使用正己基-2-氰基丙烯酸酯作为可吸收的粘连屏障，在腹腔镜下将冷冻保存的卵巢组织原位移植至卵巢髓质。所有患者均在移植后8 - 24周恢复卵巢功能，观察卵泡发育和雌激素分泌情况。患者1和2在移植后1年卵巢功能终止。患者3在移植2年后月经周期正常，患者4目前仍在自然妊娠。

应用n -己基-2-氰基丙烯酸酯可在腹腔镜原位移植中方便卵巢片的放置，且不影响卵巢活动的恢复和持续时间。

关键字

氰基丙烯酸酯，保存生育能力，原位移植，卵巢组织移植

介绍

在过去四十年中，患有癌症的儿童和成人的长期生存都有了实质性的改善，从而发展了在成功治疗后优化长期健康的服务。一些癌症幸存者可能丧失生育能力，这是患者以及儿童及其父母主要关心的问题。由于肿瘤治疗的进步，现在大多数年轻的癌症患者获得了延长的生存期[1]。然而，卵巢功能的丧失和生育能力的丧失是绝经前接受化疗和/或放疗的患者最常见的长期不良反应之一。近年来已经开发了许多策略，使这些患者能够使用他们的配子生育孩子。当化疗可以推迟时，可以使用卵巢刺激获得卵母细胞，卵母细胞可以在受精或未受精状态下冷冻[2,3]。

在开始肿瘤治疗前切除卵巢组织，并在治疗完成后移植该组织，已成为越来越重要的手术生育保留技术[4-6]。据报道，全世界至少有86例活产[7]。该程序已被纳入许多国家和国际网络和规划(生育联合会;FertiProtekt;根据ESHRE特别兴趣小组的“伦理与法律”标准[8]，这项技术已不再是实验性的。然而，美国生殖医学学会等一些专业学会仍然认为卵巢组织冷冻是一项实验性技术[9]。不同的手术技术可用于卵巢活检和卵巢组织移植。已经使用了许多不同的手术途径，提取的组织量、使用的器械、卵巢的治疗、移植部位、移植卵巢组织的血液供应以及同时进行手术干预的程序各不相同[10,11]。

与异位部位相比，盆腔(正位部位)为卵泡发育提供了最佳环境。两种技术被成功地用于在原位位置重新植入冷冻解冻的卵巢组织:要么在腹膜上特别创建的窗口，要么在剩余的卵巢上。在小碎片的情况下，它们可以放置在去皮髓质上，但在腹腔镜下进行时特别困难。使用组织粘接剂如氰基丙烯酸酯可以促进腹腔镜原位移植。

本研究的目的是探讨n -己基-2-氰基丙烯酸酯在腹腔镜原位卵巢移植中的作用，分析卵巢活性的恢复和患者的生殖结局。

患者及方法

病人

在这项观察性病例系列研究中，我们纳入了2012年至2016年期间通过腹腔镜进行卵巢组织移植的4例患者。医院伦理委员会批准了这项研究，所有患者都提供了书面知情同意书。表1列出了4名接受卵巢组织冷冻保存和冷冻/解冻卵巢组织移植的女性的诊断和年龄。

表1:原位移植患者特点及时间。

病人	指示	组织冷冻保存年龄(日期)	移植年龄	卵巢活动恢复(周)
1	鼻咽癌	39 (21/04/10)	41	24
2	乳腺癌	35 (21/01/02)	45	16
3.	乳腺癌	35 (09/02/11)	38	8
4	乳腺癌	32 (27/10/11)	37	8

患者1

2010年，一名39岁的患者被诊断为鼻咽癌。放化疗前进行卵巢组织冷冻保存。化疗开始后不久她就闭经了。化疗和放疗后卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和雌二醇水平分别为92.3 mIU/ml、82.5 mIU/ml和15 pg/ml，证实去势。3个月后证实卵巢功能衰竭。

2012年，这位患者表达了怀孕的愿望。她闭经，卵泡刺激素水平> 100 mIU/ml。腹腔镜下行原位卵巢组织移植，将对侧卵巢髓质解冻的8块卵巢切片置于活检处。6个月后，检测到第一个雌二醇峰值，同时FSH下降。超声检查显示每个周期有一个卵泡发育。观察连续月经出血的恢复情况，并鼓励患者定期性交。在一个周期内，当卵泡达到18 mm时，加入HCG, 36小时后进行卵泡抽吸。取出一个成熟的卵子，并在体外与丈夫的精子受精。在受精后的第2天，将一个四细胞胚胎移植到子宫。没有怀孕。 This obviously prevents exact knowledge on whether the oocyte was originated in the transplanted tissue or not, and this is a limitation which we want to acknowledge.

术后12个月超声观察患者FSH水平升高，月经不调，卵泡发育脓肿。

病人2

2002年，一位35岁的女性被诊断出患有乳腺癌。化疗前经腹腔镜切除卵巢组织冷冻保存。化疗开始3个月后出现闭经。卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和雌二醇水平分别为75.3 mIU/ml、45.5 mIU/ml和18 pg/ml，证实卵巢功能衰竭。

2012年，这位病人，现在希望怀孕。FSH水平>100mIU/ml，出现闭经。腹腔镜下将9块卵巢解冻组织置于对侧卵巢髓质内，行原位卵巢组织移植。术后4个月观察月经出血恢复，阴道超声检查证实有自发卵泡发育。卵巢活动保持正常，直到移植后一年。最终FSH水平升高，闭经。

患者3

2011年，这位35岁的患者被诊断出患有乳腺癌。在乳腺癌手术中同时切除卵巢组织。患者在第三个化疗周期闭经，外周血FSH和AMH水平分别为45.3 miU/ml和0.1 ng/ml。

2014年行卵巢组织移植。腹腔镜下将8片冷冻解冻后的卵巢髓质放置。术后2个月，超声检查观察毛囊自发发育，基础卵泡刺激素为7.9 mIU/l。正常性交后，无妊娠进行试管婴儿改良自然周期3个周期。在我们的机构中，该方案试图允许优势卵泡的自发生长，而不使用任何可能扭曲卵泡发生或改变子宫内膜容受性的额外药物。然而，如果在hCG当天发生自发性LH激增(定义为LH值超过平均基线值的180%)，则在取卵前给予0.25 mg SC注射GnRH拮抗剂以防止早排卵。如果在优势卵泡达到15mm之前发现黄体生成素激增，则每天使用GnRH拮抗剂和75 IU的SC促性腺激素/促绝经激素，直到出现触发标准。当卵泡达到18 mm时，加入HCG, 36小时后进行卵泡抽吸[12]。在每个周期中，都有一个胚胎移植失败。移植后两年维持正常的月经周期。

患者4

2011年，一名32岁的女性被诊断出患有乳腺癌。乳房手术和腹腔镜卵巢保存手术在同一环境下完成。患者在第三个化疗周期闭经，血液检查显示绝经期激素值(FSH 82mUI/ml)。

2016年5月，我们进行了原位卵巢组织移植，将15块冷冻解冻的còrtex植入左侧卵巢髓质。术后2个月患者首次月经来潮，自然怀孕，尿HCG阳性，阴道超声示宫内妊娠，孕31周。

手术技术

我们一直使用腹腔镜方法提取卵巢组织。对于卵巢皮质的切除，我们使用剪刀，避免使用凝血，以减少手术对卵巢敏感组织的创伤。双极凝固只能在卵巢组织样本被切除后进行，并且应该谨慎地进行双极凝固以保护卵巢残余。

我们选择切除卵巢皮层的1/3，切成5x5mm的碎片，用等渗盐水溶液冲洗，并按照Schmidt先前描述的方法冷冻保存[13]。简单地说，将片段转移到冷冻溶液中(0.1 mol/l蔗糖和1.5 mol/l乙二醇在磷酸盐缓冲盐水中)，并在1℃下平衡30分钟。切片保存在1.8 ml冷冻瓶(Nunc AS, Roskilde, Denmark)中，加入冷冻保护剂，并使用可编程冷冻机(Planner K10, Planner Ldt)冷冻保存。英国)。两个片段提交了组织学研究，证明了原始卵泡的存在，并排除了肿瘤细胞。

自体移植在腹腔镜下进行。在卵巢皮层对侧行纵向切口活检。碎片在37℃水浴中快速解冻，并用冷冻保护剂浓度降低的解冻液冲洗。采用剪刀切开，避免电凝。暴露髓质后，我们放置卵巢组织，并应用正己基-2-氰基丙烯酸酯作为手术粘合剂。最后，一旦碎片固定，使用相同的材料接近卵巢边缘(图1-4)。

图1:正己基氰基丙烯酸酯在去皮卵巢髓质上的放置。

图2:卵巢碎片的放置

图3:剩余卵巢上可见卵巢碎片

图4:粘接卵巢边缘

结果

所有患者均于手术当日出院。移植后8 - 24周，所有患者的FSH水平均较术前显著下降，卵巢功能得到恢复(图5)。

图5:冷冻解冻卵巢组织原位再植后的FSH vàlues

着床和卵巢活动恢复之间的时间间隔可以用冷冻保存时卵泡储备的差异来解释。年龄可以解释观察到的差异，以及患者1和2恢复卵巢活动的时间较短的事实。移植后2个月卵巢活性的早期恢复可能表明卵泡活性来自原生卵巢。最近有研究表明，移植后残留卵巢中“被困”的卵泡大量募集，可能是通过PTEN介导的机制[14-16]。

图6总结了在非刺激周期进行体外受精的周期中经回声图像验证的卵泡活性和卵母细胞恢复情况。在这些周期中，没有一个成功怀孕。毫无疑问，在冷冻解冻的移植组织中，异常卵母细胞(未成熟或退化)的百分比比在接受体外受精的普通人群中要高得多。

图6:双圆代表排卵前卵泡，单圆代表回收的卵母细胞

患者4在卵巢移植后8周出现自发卵泡发育，在卵巢移植后3个月自然怀孕，提示大多数女性不需要辅助生殖技术。

讨论

本报告描述了我们使用n -己基-2氰基丙烯酸酯作为移植部位固定手术治疗的经验。据我们所知，这是第一次使用这种合成手术粘合剂。

在肿瘤治疗开始前提取卵巢组织，并在癌症治疗结束后将其重新植入是一种创新方法，在生育手术中越来越重要。许多中心已经开始为受影响的妇女提供这种手术。文献显示，近年来，冷冻卵巢组织移植后的妊娠和分娩数量不断增加，表明这已成为一种既定的手术[7,17,18]。然而，关于这种保留生育能力方法的最佳手术技术的数据是有限的。

年龄是卵巢组织移植成功的一个重要预测因素，然而有一些已发表的病例系列，其中移植是在高龄妇女中进行的，后来又怀孕了。可以假设，个体卵巢储备和组织收获时的卵泡密度比患者收获组织时的年龄有更大的影响[7,17]。

虽然大多数中心选择腹腔镜方法进行卵巢组织移植，但确实有一些作者成功地使用了剖腹手术途径(Silber, 2016)。腹腔镜入路的好处是患者手术恢复快，甚至可以在手术当天出院，使他们能够立即开始化疗[17-19]。

对于要提取多少卵巢组织的问题，意见分歧更大。Donnez等人指出，卵巢皮层活检至少要有1mm厚，否则不能包括间皮下的原始卵泡[20]。其他中心更喜欢卵巢取样，样本量为卵巢的1/3至2/3[11,19]，甚至抽取整个卵巢。对一大块卵巢组织进行取样，为不同部位的重复移植提供了可能，这有助于更长时间地维持卵巢的生殖和内分泌功能。不同治疗方法之间可能存在的折衷方案包括在计划的积极化疗之前切除卵巢的大部分，但在毒性较低的情况下保留更多的组织[16]。

关于卵巢冷冻保存技术，绝大多数妊娠发生在卵巢皮质块缓慢冷冻后;然而，最近的研究表明，玻璃化可能有其优点。事实上，一些中心目前使用玻璃化作为唯一的方法。需要等待几年才能获得与慢速冷冻相同的经验[16]。

有3个潜在的移植部位:移植到同侧和/或对侧卵巢，移植到同侧和/或对侧腹膜袋，异体移植。卵巢作为再移植部位的潜在好处是，组织最初取自同一部位，移植样本可以很容易地定位并在必要时移除。然而，出血的风险较高，也有卵巢外伤的潜在风险，这可以通过移植到腹膜袋来避免。在报道的系列中，靠近卵巢门和卵巢髓质的腹膜窗似乎都是同样有效的再植入部位，至少对于恢复卵巢活动而言[10.16,20]，尽管一些作者认为腹膜部位的卵泡活性低于髓质的卵泡活性[19]。

手术中移植部位的治疗是有争议的。使用缝合线或纤维蛋白胶的优点是安全关闭腹膜或卵巢，确保移植组织不会脱落。然而，缝合线或其他材料可能会对周围组织造成额外的创伤，并可能产生粘连和术后疼痛的高风险[18-21]。

自体卵巢组织在剩余卵巢或对侧卵巢的移植比腹膜袋困难，但增加了自然妊娠的机会，也便于超声监测卵泡的生长。在我们的研究中，所有4例患者都在对侧卵巢进行了自体移植，使用n -己基-2-氰基丙烯酸酯作为粘接剂，其容量大于纤维蛋白胶固定，避免了缝线的使用。无术后并发症及超声监测困难。此外，我们进行了卵母细胞检索没有困难。

目前，组织粘接剂和胶粘剂在临床应用中是一种替代技术，对医疗行业和外科专业都很重要。许多新兴的组织粘接剂可以通过止血、伤口密封和在订书钉、夹子和缝线无法到达的区域固定组织来稳定组织表面，从而改善困难的外科手术[22-23]。

合成(氰基丙烯酸酯)和生物(纤维胶)组织粘接剂之间存在差异。需要明确的是，生物胶粘剂是浓缩的纤维蛋白原和XIII因子，此外，生物胶粘剂可能有污染(疾病传播的风险)，因此需要事先准备(而合成组织胶粘剂可以在打开后立即应用)，并且价格昂贵[24]。

在临床应用和研究中，合成氰基丙烯酸酯组织粘接剂作为目前常规治疗的替代方法已被广泛使用，包括在胸外科、胃肠外科、神经外科、心血管外科、眼科、泌尿外科和血管外科的应用[25,26]。

n -己基-2-氰基丙烯酸酯的根本优点是纯度高，聚合温度低，这有助于避免作为粘合剂的毒性，在配方中没有杂质的情况下，不影响其作为粘合剂的效果。这些氰基丙烯酸酯的纯度使得不需要在其他氰基丙烯酸酯中频繁使用稳定剂，并且可以在打开后立即应用[27,28]。

虽然该研究包括少数患者，但我们证明了在移植部位应用n -己基-2-氰基丙烯酸酯的有效性。所有患者卵巢功能均恢复并维持至少一年。显然，年龄是一个重要的预后因素，因为最后2例患者卵巢组织储存年龄较早，卵巢功能恢复较早。在最后一例移植患者中，实现了自然妊娠，表明卵巢原位移植可以促进这种可能性。

总之，我们总结了我们在卵巢组织原位移植中使用正己基-2-氰基丙烯酸酯作为黏附材料的经验。我们已经证明了它们潜在的粘合剂促进了卵巢髓质组织碎片的附着，而不影响卵巢活动的恢复及其在生殖方面的有效性。

作者及贡献:研究概念和设计:FF。和江铃汽车。数据采集:JF, RS,GC和SP。统计分析:FC。D.B.数据的解释和综合:FF和JP。文章写作:FF和JF。文章的关键性修改:DM,AB和MC。所有作者都同意文章的结果和结论。所有作者都已阅读并确认他们符合作者标准。

致谢

没有一个

财政支持及赞助

没有一个

利益冲突

没有利益冲突

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