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摘要

本研究的目的是通过建立ISO协议确定草莓样品中单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7的流行程度。此外，还评估和比较了用于该目的的底物的性能，即针对单核增生乳杆菌的ALOA和RAPID L.mono，以及针对大肠杆菌O157:H7的Fluorocult大肠杆菌O157:H7和CT-SMAC。此外，在富集菌培养后，通过特异性PCR进行直接检测。两种病原体的患病率估计为3.8%。ALOA与RAPID L.mono结果相同，因此其性能指标相同。而对于Fluorocult E. coli O157:H7和CT-SMAC则不是这样，两种底物的敏感性和阴性预测值都是最优的，但Fluorocult E. coli O157:H7在特异性、阳性预测值和阳性似然比方面表现更好。最后，富集菌培养后进行的特异性PCR不推荐作为这些病原体存在的指标。

关键字

单核细胞增生李斯特菌，大肠杆菌O157:H7，流行，草莓

介绍

单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7被认为是主要的食源性病原体，因为它们与大量与动物和植物来源的食物有关的暴发有关[1-7]。据报道，在生水果和蔬菜中，单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7的流行率分别为0.7%至36.8%[8-10]和3%至18%[7,11]。

在希腊，2004-2014年十年间报告了84例人类李斯特菌病确诊病例[12-15]。2004 - 2013年，年平均病例数为7.30例，年平均通报率为0.65例/ 100万人[16]。与单核增生乳杆菌病例相反，2004-2015年期间肠出血性大肠杆菌感染的平均年通报率明显较低，为每100万人0.08例。同期共报告10例[15,17,18]。在希腊的水果和蔬菜中，据估计单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7在黄瓜中的患病率分别为6%和3%，在火箭中这两种病原体的患病率分别为7%[19]。

依赖培养物检测食源性病原体，尽管耗时，仍是参考方法。在单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7的情况下，最常用的显色培养基是根据Ottaviani和Agosti (ALOA)的琼脂李斯特菌和含有头孢克肟和tellrite (CT-SMAC)的山梨醇MacConkey培养基[20,21]。然而，它们在常规微生物分析中的表现并不总是完美的，导致对患病率的高估或低估。事实上，用于检测单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7的培养基的性能差异经常被报道[19,22,23]。因此，为了提高分析的准确性，结合显色介质似乎很重要。分析的耗时性质通常是通过在富集液孵育后通过特异性PCR检测病原体来管理的[24]，并将该分析结果作为指示，特别是在保质期短的产品的情况下。

本研究的目的是通过ISO协议确定草莓样品中单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7的流行程度，评估和比较用于单核增生乳杆菌的显色培养基ALOA和RAPID L.mono和用于大肠杆菌O157:H7恢复的Fluorocult E. coli O157:H7和CT-SMAC，并将这些结果与富集肉汁孵育后进行的特异性PCR结果进行比较。

材料与方法

样品收集

在2012年5月的一次调查中，从希腊雅典大都会区的超市购买了来自希腊不同地理区域的草莓样品(Fragaria ananassa, n = 26)。样品于4点送到实验室^°C，当天分析。

单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7的检测、枚举与确证

采用经典微生物学方法对单增乳杆菌和大肠杆菌O157:H7进行检测和计数。富集液孵育后也进行了特异性PCR检测。在第一个病例中，分别按照ISO 11290- 1:20 96和ISO 11290- 2:20 98在选择性显色培养基琼脂李斯特菌上进行检测和计数，分别采用Ottaviani和Agosti [21] (ALOA) (Biolife，米兰，意大利)和RAPID’L.mono (Bio-Rad，巴黎，法国)。同样，根据ISO 16654:2001，用Fluorocult大肠杆菌O157:H7 (Merck, Darmstadt, Germany)和山梨糖醇MacConkey培养基(CT-SMAC) (Lab M, Bury, UK)进行O157:H7的检测和计数。

通过生化和分子检测，证实了单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7的同源性。随机选择至少5个典型的假定单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7菌落，从每个底物的培养皿中分离出来。按ISO 11290- 1:20 96进行单核增生乳杆菌的生化试验(流动性、溶血、鼠李糖和木糖发酵)。对于大肠杆菌O157:H7，大肠杆菌O157:H7乳胶测试(Remel, Lenexa, KS, USA)按照制造商的说明使用。分别按照D 'Agostino等[25]和Gordillo等[26]对单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7进行PCR分子鉴定。假定为单核增生乳杆菌或大肠杆菌O157:H7菌落，经生化和分子检测证实为阳性。

特异性PCR方法如下:孵育后各取10 mL浓缩肉液(即单核增生乳杆菌的一半Fraser和全部Fraser，大肠杆菌O157:H7的mTSB)离心(12.000 x g, 4^oC, 10 min)，用无菌生理盐水洗涤2次，并按照Hadjilouka等[27]提取DNA。病原菌检测采用D 'Agostino等[25]和Gordillo等[26]分别对单核增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的PCR检测方案。

性能指标的计算

当确认从任何培养基中发现至少一个假定的单核增生乳杆菌或大肠杆菌O157:H7菌落时，即认为样本呈阳性。两种选择性介质的平行使用导致每个底物的2 × 2列联表具有真阳性(tp)，假阳性(fp)，真阴性(tn)和假阴性(fn)样品的特征。

根据2 × 2列联表计算真实患病率(TrP)、表观患病率(ApP)、敏感性(se)、特异性(sp)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)。计算这些参数的方程及其术语在Thrusfield[28]中有描述。

结果

l .人口。所有样品中单核细胞增生和大肠杆菌O157:H7均低于计数限制。然而，经过选择性富集和验证试验，在一个草莓样品中检测到两种病原体，每种病原体的患病率为3.8%。表1显示了验证测试后使用的每种基板的结果。对于L单核细胞，两种底物的检测结果相同，均检测到阳性样品，均未产生假阳性或阴性结果。然而，就O157:H7大肠杆菌的检测而言，情况并非如此。在这种情况下，两种底物都检测到真阳性样品，但也检测到一些假阳性样品。表2给出了所用基板的性能指标。在ALOA和RAPID 'L的情况下。莫诺all indices were identical since both substrates provided with the same results. In the case of E. coli O157:H7 detection, sensitivity and negative prediction value were optimal for both substrates but Fluorocult E. coli O157:H7 performed better in terms of specificity, positive prediction value and positive likelihood ratio.

表1。2x2列联表显示用于检测的每种选择性培养基的真阳性(tp)、假阳性(fp)、真阴性(tn)和假阴性(fn)结果l . monocytogenes或大肠杆菌结合微生物、生化和分子检测结果，对草莓样品中的O157:H7进行分析。

	tp	《外交政策》	tn	fn
l . monocytogenes
ALOA	1	0	25	0
快速的l。莫诺	1	0	25	0
大肠杆菌O157: H7
Fluorocult	1	13	12	0
CT-SMAC	1	18	7	0

表2。用于检测的选择性介质的性能指标l . monocytogenes和大肠杆菌草莓样品中的H7。

	l . monocytogenes		大肠杆菌O157: H7
	ALOA	快速的l。莫诺	Fluorocult	CT-SMAC
TrP (%)	3.8		3.8
应用程序(%)	3.8	3.8	3.8	3.8
Se (%)	One hundred.	One hundred.	One hundred.	One hundred.
Sp (%)	One hundred.	One hundred.	48	4
PPV (%)	One hundred.	One hundred.	7.1	5.3
NPV (%)	One hundred.	One hundred.	One hundred.	One hundred.
PLR	ND	ND	1.92	1.04
NLR	0	0	0	0

通过特异性PCR检测，在培养液中也存在单核细胞增生乳杆菌。更准确地说，在阳性样品的一半和全部弗雷泽检测到单核细胞增生乳杆菌。相反，在任何阴性样本中都没有检测到它。在大肠杆菌O157:H7的病例中，在任何富集液中均未检测到特异性PCR病原体。

讨论

在本研究中，ALOA和RAPID L.mono表现出相同的性能。在以前的研究中并非如此[19,23,29]，因此它可能具有不寻常的特征，并且可能归因于本研究中检测的样本数量相当有限。相反，Fluorocult大肠杆菌O157:H7和CT-SMAC性能显示出它们的弱点。更准确地说，假阳性结果数量的增加可能归因于分离株的表型性状与被认为是典型的性状的偏差;同时充分强调了确认性试验的重要性。后两种媒介的另一个共同特点是没有假阴性结果;灵敏度和阴性预测值均为最佳。灵敏度和阴性预测值是病原体检测的关键参数，灵敏度和阴性预测值越高越合适[21,30]。

Restaino等人[31]、Manafi和Kremsmaier[22]以及Hadjilouka等人也报道了氟培养大肠杆菌O157:H7和CT-SMAC假阳性结果较多的情况。[19]，不可避免地导致特异性降低、阳性预测值和阳性似然比。因此，建议结合假阳性结果较少的介质，如CHROMagar[32]，以提高分析的准确性。

在单核增生乳杆菌的情况下，应用经典微生物学技术得到的结果可以用半弗雷泽和全弗雷泽的特异性PCR预测。然而，在自然污染的黄瓜和火箭样品中检测病原体的情况并非如此，其中强调了这种分析无法作为指示[33]。同样，特异性PCR不仅在本研究分析的草莓样品中检测不到大肠杆菌O157:H7，在黄瓜和火箭样品中也检测不到大肠杆菌O157:H7(数据未显示)。

结论

通过在至少两种培养基上进行平行试验，可以提高传统微生物学方法检测单核增生乳杆菌和大肠杆菌O157:H7的准确性和可靠性。此外，不推荐在富集菌培养后进行特异性PCR作为这些病原体存在的指标。

鸣谢

导致这些结果的研究得到了欧洲联盟第7个研究、技术发展和示范框架方案的资助，赠款协议为第289719号(QUAFETY项目:www.quafety.eu)。

参考文献

1. 张建军，张建军，张建军，张建军。(2002)大肠埃希菌的传播与控制。动物科学可以吗82: 475 - 490。
2. Olsen SJ, Patrick M, Hunter SB, Reddy V, Kornstein L等。(2005)与熟食火鸡肉有关的单核细胞增生李斯特菌感染的多州暴发。临床感染与疾病40: 962 - 967。
3. [J]，李建平，李建平，等(2008)新鲜水果的风险评估方法。]J苹果微生物104: 925 - 943。(Crossref)
4. WHO(2013)肠出血性大肠杆菌(EHEC)。媒体中心。世界卫生组织。
5. 李建军，刘建军，刘建军，2011版权所有。从零售肉类和肉店环境中分离出8支大肠杆菌O157:H7的高流行率。感染，基因进化45: 1 - 5。(Crossref)
6. (2014)即食新鲜水果和蔬菜中单核细胞增生李斯特菌的流行和李斯特菌病的发生。在Hambrick EC(编辑)“单核增生李斯特菌:食物来源，流行和管理策略”，Nova出版社，纽约，美国，第283-296页。
7. (2015)大肠杆菌的流行和即食新鲜水果和蔬菜的暴发。In McCoy G(编辑)《大肠菌群:发生、检测方法和环境影响》，Nova出版社，纽约，美国，第71-106页;
8. Beuchat LR(1998)生吃水果和蔬菜的表面净化:综述。世卫组织/ FSF /安全系数98.2。世界卫生组织食品安全股，日内瓦。
9. Little CL, Taylor FC, Sagoo SK, Gillespie IA, Grant K等。(2007)英国零售预包装混合蔬菜沙拉中单核细胞增生李斯特菌和其他李斯特菌的患病率和水平。食物Microbiol24: 711 - 717。
10. Sant 'Ana AS, Igarashi MC, Landgraf M, Destro MT, Franco BDGM(2012)巴西圣保罗销售的即食蔬菜中分离的单核细胞增生李斯特菌的患病率、种群和表型和基因型特征。[J]食品微生物学155: 1 - 9。
11. FDA(2013)《控制和减少/消除新鲜和鲜切农产品微生物危害的预防控制措施分析与评价》。食品和药物管理局。
12. 欧洲食品安全局(EFSA)、欧洲疾病预防和控制中心(ECDC)(2010年)欧洲联盟关于2008年人畜共患病、人畜共患病病原体和食源性暴发的趋势和来源的摘要报告。欧洲食品安全署杂志8: 1496。
13. 欧洲食品安全局(EFSA)、欧洲疾病预防和控制中心(ECDC)(2011年)欧盟关于2009年人畜共患病、人畜共患病病原体和食源性暴发的趋势和来源的摘要报告。欧洲食品安全署杂志9: 2090。
14. EFSA(欧洲食品安全局)、ECDC(欧洲疾病预防和控制中心)(2015)欧盟关于2013年人畜共患病、人畜共患病病原体和食源性暴发趋势和来源的总结报告。欧洲食品安全署杂志13: 3991。
15. EFSA(欧洲食品安全局)、ECDC(欧洲疾病预防和控制中心)(2015)欧盟2014年人畜共患病、人畜共患病病原体和食源性暴发趋势和来源摘要报告。欧洲食品安全署杂志13: 4329。
16. 希腊疾病预防控制中心(2014)流行病学监测与干预处。卫生部。2004-2013年希腊李斯特菌病流行病学数据。
17. EFSA(欧洲食品安全局)、ECDC(欧洲疾病预防和控制中心)(2014)欧盟关于2012年人畜共患病、人畜共患病病原体和食源性暴发趋势和来源的总结报告。欧洲食品安全署杂志12: 3547。
18. 希腊疾病预防控制中心(2016)流行病学监测与干预处。卫生部。2004-2015年希腊肠出血性大肠杆菌感染流行病学资料
19. Hadjilouka A, Mantzourani KS, Katsarou A, Cavaiuolo M, Ferrante A等。(2015)自然污染的火箭和黄瓜样品中单核增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7患病率和浓度的确定性和随机方法估计。J食品工程78: 311 - 322。
20. 3月SB, Ratnam S(1986)山梨醇- macconkey培养基检测出血性结肠炎相关大肠杆菌O157:H7。临床微生物学杂志23日:869 - 872。
21. Ottaviani F, Ottaviani M, Agosti M(1997)单核增生李斯特菌的差异琼脂培养基，论文在quimper froid研讨会上发表，布列塔尼，法国，6月16-18日。
22. Manafi M, Kremsmaier B(2001)不同显色/荧光培养基检测食品中大肠杆菌O157:H7的比较评价。[J]食品微生物学71: 257 - 262。
23. Andritsos V, Mataragas M, Paramithiotis S, Drosinos EH(2013)用确定性和随机方法量化肉糜中单核细胞增生李斯特菌的流行和浓度，并通过存在/不存在微生物测试估计三种培养基的性能。食物Microbiol36: 395 - 405。
24. Jersek, T. Majstorovic, N. Klun, S.S. Mozina(2005)富集培养基对食品中单核增生李斯特菌pcr检测的影响。农业学报85: 15 - 23。
25. D 'Agostino M, Wagner M, Vazquez-Boland JA, Kuchta T, Karpiskova R，等。(2004)以原料奶为食品模型的pcr检测单核细胞增生李斯特菌的验证方法-向国际标准发展。J食品工程67: 1646 - 1655。
26. Gordillo R, Córdoba JJ, Andrade MJ, Luque MI, Rodríguez M(2011)肉制品中大肠杆菌O157:H7 PCR检测方法的建立。肉Sci88: 767 - 773。(Crossref)
27. Hadjilouka A, Andritsos ND, Paramithiotis S, Mataragas M, Drosinos EH(2014)不同食品中单核细胞增生李斯特菌血清型流行率和生物多样性。J食品工程77: 2115 - 2120。
28. Thrusfield M(2007)“兽医流行病学”。(第三版)布莱克威尔科学，英国牛津。
29. Aragon- alegro LC, Aragon DC, Martinez EZ, Landgraf M, de Melo Franco BDG等。(2008)食品中单核细胞增生李斯特菌的显色培养基分离性能。食品控制19日:483 - 486。
30. Stessl B, Luf N, Wagner M, Schoder D(2009) 6种显色aloa型培养基检测单核增生李斯特菌的性能试验。J苹果微生物106: 651 - 659。
31. 李建平，李建平，李建平(1999)一种从牛肉中分离大肠杆菌O157:H7的显色培养基。左苹果微生物29日:26 - 30日。(Crossref)
32. Guali M, Ruckly C, Carle I, Lejay-Collin M, Weill FX (2013) CHROMagar STEC和STEC O104显色琼脂培养基检测粪便标本中产志贺毒素大肠杆菌的评价。临床微生物学杂志51: 894 - 900。
33. Hadjilouka A, Madjourani KS, kuou V, Paramithiotis S, Mataragas M，等。(2013)经典和分子技术在果蔬中检测单核细胞增生乳杆菌的适用性，论文发表在第六届欧洲鲜切农产品加工短期课程上，安塔利亚，土耳其。