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摘要gydF4y2Ba

以木聚糖酶为固定化催化剂，以木聚糖为原料生产低聚木糖gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba提出了。该酶提取物含有多种性质不同的木聚糖酶，因此需要开发廉价、简单的方法进行工业规模的纯化。该酶被成功纯化，固定化和高度稳定使用一个简单的协议。主要纯化的木聚糖酶为34kda蛋白，相当于总菌株木聚糖酶活性的50%。在不同的固定化试验方案中，使用醛载体可以使该组分完全固定化，保持其初始催化活性的80%。对该方法进行优化后，稳定因子的稳定性比可溶性酶高约1100倍。在最佳催化剂的作用下，水解度最高可达73.4%。通过对反应条件(不同的时间和温度)的优化，可以得到62% (11.93 mg/mL)感兴趣的低聚木糖(XOS2-XOS6)(图1)。gydF4y2Ba

图1所示。gydF4y2Ba图形抽象。gydF4y2Ba

关键字gydF4y2Ba

木聚糖酶，黑曲霉，生物催化，酶热稳定，XOS生产gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

木聚糖是自然界中仅次于纤维素的最丰富的天然多糖。木聚糖由β-(1-4)-的线性聚合物组成gydF4y2BaDgydF4y2Ba-吡喃木糖基，可以被4-取代gydF4y2BaOgydF4y2Ba甲基-α-gydF4y2BaDgydF4y2Ba-葡萄糖醛酸吡喃基，乙酰基或α-gydF4y2BalgydF4y2Ba-阿拉伯糠酰基可变比例[1]。gydF4y2Ba

木聚糖主要被内切木聚糖酶水解产生低聚木糖(XOS)混合物，被认为是新兴的益生元。在XOS的健康益处中，双歧杆菌和gydF4y2Ba乳酸菌,gydF4y2Ba降低致病性和腐性细菌，改善肠道功能和钙吸收，免疫特性，抗氧化，抗炎或抗过敏活性都包括[2]。β-木糖苷酶可催化寡糖转化为木糖。木糖可以用作乙醇生产中的碳源，也可以用木糖还原酶[3]将木糖化学或酶转化为木糖醇等其他产品，木糖醇是一种重要的非热量甜味剂。gydF4y2Ba

据报道，木聚糖酶来自不同的来源，如真菌或细菌，通常可以诱导微生物以木聚糖为碳源生长。一种具有工业吸引力的替代方法是使用大量可获得且具有成本效益的农业残留物(麦麸、玉米芯、玉米秸秆、米糠、稻壳等)来获得酶，从而降低总体制造成本[4]。gydF4y2Ba

不同碳源培养后得到的粗菌株通常由不同的内、外木聚糖酶和其他酶组成，这些酶能催化所需产物转化为其他不同的化合物;即使使用内切木聚糖酶的混合物也难以控制这一过程，因为整体催化剂的性质(活性、稳定性和选择性)是所有酶的性质的混合物。gydF4y2Ba

另一方面，gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba可根据发酵条件生产多达15种不同的木聚糖酶[5]。这就需要设计简单的净化工艺。考虑到在工业上使用可溶性酶在许多情况下是昂贵的，通常使用酶作为固定化制剂是方便的，以便重新使用催化剂，提高生产力，并允许更容易地设计反应器，避免昂贵的纯化过程。由于固定化酶的重要性，利用固定化过程生产更稳定的生物催化剂也是非常有趣的。这可能允许催化农业废物水解成具有附加值的益生元，从而最大限度地降低这一过程的成本。gydF4y2Ba

特别是在过去十年中，不同来源的木聚糖酶通过不同的协议被固定化，使得其操作性能得到了不同的改善(表1)[6-32]。gydF4y2Ba

表1。gydF4y2Ba文献报道内切木聚糖酶的固定化gydF4y2Ba

nd:不确定gydF4y2Ba

^{一个gydF4y2Ba}恢复的活度是指在导数中观察到的活度与与支撑相结合的活度相比。gydF4y2Ba^bgydF4y2Ba固定率是指与支撑物相结合的活性与提供给支撑物的总活性的百分比。gydF4y2Ba^cgydF4y2Ba稳定系数是指在括号中所示的特定温度下，衍生物的半衰期值与可溶性酶的半衰期值之比。gydF4y2Ba

因此，本研究提出了两种不同木聚糖酶的纯化、固定化和稳定的简单方法gydF4y2Ba答:尼日尔gydF4y2Ba提出了。采用最佳催化剂对木聚糖水解制得具有工业价值的不同寡糖的反应进行了研究和优化。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

材料gydF4y2Ba

内根-1,4-β-木聚糖酶由gydF4y2Ba答:尼日尔gydF4y2Ba．琼脂糖10 BCL采购自琼脂糖珠技术公司(马德里，西班牙)。Epichlorhydrine、亚氨基二乙酸gydF4y2BapgydF4y2Ba-氨基苯基硼酸、三乙胺、乙醇胺、聚乙烯亚胺、山毛榉木聚糖、木糖、甘氨醇、硼氢化钠、高碘酸钠和3-5´-二硝基水杨酸从Sigma-Aldrich公司(美国圣路易斯)获得。玉米芯粉是Rasul (Andirá， Brazil)捐赠的。羧甲基-海糖快流、q -海糖快流、cnbr活化的4B海糖和SDS-PAGE低分子量标准采购自GE Healthcare生命科学公司(Uppsala，瑞典)，低聚木糖标准(b2 - x6)采购自Megazyme公司(Bray，爱尔兰)。所有试剂均为分析级。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

Endo-1, 4 -β木聚糖酶的生产gydF4y2Ba

黑曲霉gydF4y2Ba用于木聚糖酶的生产。培养物在2% (w/v)琼脂和4% (w/v)燕麦面粉上生长，在40°C下培养4天。酶的生产按照Benedetti的描述进行gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．[33]，以玉米芯粉为碳源。粗提物经滤纸真空过滤后冻干。gydF4y2Ba

酶测定和蛋白质测定gydF4y2Ba

用3-5´-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定木聚糖酶解后释放的还原糖，方法[34]。以木糖为标准还原糖进行测定。gydF4y2Ba

在pH值为5的条件下，将40 mg/mL山毛榉木聚糖与100 mM醋酸钠混合制备可溶性底物。混合物在25°C搅拌30分钟，然后在5000℃离心20分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba．可溶部分被分离出来，用作反应的底物。因此，本研究最终使用的底物浓度为20 mg/mL。实验在25°C温和搅拌下进行。该温度的选择与最佳温度(约55°C)相反，以促进标准条件下的措施，并消除长时间反应在更高温度下失活的可能性。一个酶单位(U)定义为在这些条件下每分钟能够生产1摩尔还原糖的酶的数量。gydF4y2Ba

蛋白质测定采用Bradford方法[35]，以牛血清白蛋白(分数V)为蛋白质标准。gydF4y2Ba

准备固定支架gydF4y2Ba

琼脂糖10bcl与乙醛基团活化后得到乙醛基载体，如之前桂三[36]所述。根据Mateo的理论制备了聚乙烯亚胺-琼脂糖(pei -琼脂糖)载体gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．[37]采用乙醛基琼脂糖载体作为起始原料。亚氨基二乙酸-琼脂糖(ida -琼脂糖)，硼酸-琼脂糖和氨基琼脂糖载体被Mateo所描述gydF4y2Ba等gydF4y2Ba．[38]使用环氧活化琼脂糖作为基础载体。铜gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-螯合琼脂糖是通过在20 mM CuSO溶液中培养之前用亚氨基二乙酸激活的载体制备的gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba浸泡30分钟，然后用蒸馏水洗[39]。gydF4y2Ba

酶的纯化和固定化gydF4y2Ba

不同的制剂都在低酶负荷下进行，以避免可能的质量限制转移。gydF4y2Ba

净化:gydF4y2Ba使用粗菌株作为起始材料的酶的制备取决于所使用的载体。因此，含2 U/mg的2 mg木聚糖酶(用Bradford法测定)在pH值为7的磷酸钠缓冲液中溶解(5 mM磷酸盐用于离子交换载体上的固定;50mm磷酸盐用于固定在硼酸盐支持和100mm用于铜使用gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}螯合物琼脂糖)。然后，在25°C下，在10 mL酶溶液中加入1 g载体，在不同的载体上进行固定化。酶吸附在铜上gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-螯合琼脂糖用20 mM咪唑解吸。gydF4y2Ba

固定:gydF4y2Ba将2mg纯木聚糖酶(含16.8 U/mg)稀释在10ml缓冲溶液中(100mm碳酸氢钠pH值为10或100mm磷酸钠pH值为7)，并提供1g乙醛基琼脂糖或cnbr活化的Sepharose载体。当固定化完成后，乙醛基衍生物通过加入1mg /mL固体NaBH被还原gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba浸泡30分钟后再用清水冲洗。在cnbr载体上进行固定化，在4℃下固定15分钟，然后用1 M乙醇胺在pH 8下阻塞2小时。最后用清水冲洗衍生物。用铜活化的琼脂糖异功能载体进行了一次纯化-固定化gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-螯合基团和乙醛基。为此，对单功能铜活化载体进行如上所述的第一步吸附，然后将吸附的酶在pH值为10的条件下培养2小时。最后，用1 mg/mL固体NaBH还原制备gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba浸泡30分钟后再用清水冲洗。gydF4y2Ba

为了控制纯化和固定化过程，定期提取上清液(无载体的酶溶液)和悬浮液(整个混合物)样品，并测定酶活性。gydF4y2Ba

固定率(YI)和表达活性(EA)测定如下:gydF4y2Ba

提供给载体的总活性是添加到固定化载体中的单位(U)的总数，而未结合酶活性是在固定化过程结束时在上清液中发现的单位(U)的数量。gydF4y2Ba

热稳定性的研究gydF4y2Ba

在不同的温度下进行热失活，将1 g固定化衍生物悬浮在pH值为5的10 mL 0.1 M醋酸缓冲溶液中。定期提取悬液样品，并按上述方法测试其活性。初始活度被认为是100%。gydF4y2Ba

失活模型基于Henley和Sadana[40]提出的失活理论。根据实验数据的最佳拟合模型，即无残留活性的两级串联失活模型，确定失活参数。根据它，生物催化剂的失活经过两个连续的步骤，活性逐渐降低，直到最终得到完全失活的酶种，如下图所示:gydF4y2Ba

kgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和kgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba是一阶跃迁速率常数E, EgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和EgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba是相应的酶种类。表示该机制的数学模型为:gydF4y2Ba

其中ɑ为t时刻的剩余活性，α为酶种EgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba相对于本地酶种E。gydF4y2Ba

只考虑酶失活的一步机制(kgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba=0)，剩余活性(α≠0)，模型为具有剩余活性的一级失活，表示为:gydF4y2Ba

（2）gydF4y2Ba

根据实验数据的最佳拟合模型确定失活参数。半衰期(剩余酶活性为其初始值一半的时间;tgydF4y2Ba_{1／2gydF4y2Ba})用于比较不同生物催化剂的稳定性，由由Eq.(1)或Eq.(2)所描述的各自模型进行插值确定。gydF4y2Ba

温度对固定化木聚糖酶活性的影响gydF4y2Ba

乙醛-琼脂糖制剂或可溶性酶的活性在不同温度下测定，方法是在pH值为5的条件下，将2 mg可溶性或1 g衍生物稀释在10 mL 100 mM醋酸钠缓冲液中。活度的测量如前所述。gydF4y2Ba

sds - pagegydF4y2Ba

样品根据Laemmli[41]描述的方法进行变性电泳，使用12%的聚丙烯酰胺凝胶。分子质量标准为磷酸化酶b (97 kDa)、牛血清白蛋白(66 kDa)、卵清蛋白(45 kDa)、碳酸酐酶(30 kDa)、胰蛋白酶抑制剂(20.1 kDa)和α-乳清蛋白(14.4 kDa)。根据Heukeshoven和Dernick[42]的说法，凝胶被考马斯亮蓝或硝酸银染色。gydF4y2Ba

高性能阴离子交换色谱与脉冲安培检测(HPAEC-PAD)分析gydF4y2Ba

用HPAEC-PAD分析木糖和低聚木糖(XOS)，采用由GP50梯度泵和ED50电化学检测器(金工作电极和Ag/AgCl参比电极)组成的ICS2500 Dionex系统。分析在25°C下进行，CarboPac PA-1柱(250×4 mm)与CarboPac PA-1保护柱(50×4 mm)相结合。分离在1 mL/min的流速下进行，如前所述[21]。木糖和XOS的定量使用标准溶液(XOS1到XOS6)进行外部校准。gydF4y2Ba

结果与讨论gydF4y2Ba

木聚糖酶催化剂的制备gydF4y2Ba

净化和固定:gydF4y2Ba的应变gydF4y2Ba答:尼日尔gydF4y2Ba以玉米芯粉为碳源种植。得到的培养物由不同的蛋白质组成(图2,lane 2)。当木糖作为底物时，检测到较高的酶活性，证实内生木聚糖酶的产生;反之，avicel、羧甲基纤维素和羧甲基纤维素均未检测到活性gydF4y2BapgydF4y2Ba-nitrophenyl -β-gydF4y2BaDgydF4y2Ba-吡喃木糖苷作为底物，说明在菌株生长条件下，这些活性不显著产生。由于产生了几种木聚糖酶，因此需要进行一个纯化步骤。当对催化性能进行评估时，得到的值代表每种酶的单个性能的平均值，这使得在生产过程中很难找到稳定性。因此，目标酶的纯化是使用不同的载体来进行的，这些载体由能够物理吸附蛋白质的基团激活，如阳离子或阴离子，金属螯合物和苯硼酸酯基团(表2)。木聚糖酶的吸附量取决于所使用的载体。铜的最大吸附量为50%gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-螯合载体用于纯化。用20 mM咪唑对吸附的部分进行解吸，用SDS-PAGE分析，结果显示一个34 kda的蛋白具有木聚糖水解活性(图2,lane 4)。这种酶被命名为木聚糖酶I (xyl I)，相当于总内切木聚糖酶活性的50%。纯化因子为4.14(表3)。gydF4y2Ba

图2。gydF4y2BaSDS-PAGE凝胶对内参-1,4-β-木聚糖酶的纯化。条带:(1)分子量标记;(2)粗蛋白提取gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba；(3)未吸附在铜螯合琼脂糖载体上的蛋白质;(4)用20mM咪唑解吸铜螯合琼脂糖后的内参-1,4-β-木聚糖酶。实验按方法进行。gydF4y2Ba

表2。gydF4y2Ba木聚糖酶的吸附gydF4y2Ba答:尼日尔gydF4y2Ba在不同的支持gydF4y2Ba

激活支持gydF4y2Ba	固定率(%)gydF4y2Ba
Carboxymethyl-sepharosegydF4y2Ba	11gydF4y2Ba
IDA-agarosegydF4y2Ba	17gydF4y2Ba
Q-sepharosegydF4y2Ba	13gydF4y2Ba
PEI-agarosegydF4y2Ba	8gydF4y2Ba
Amino-agarosegydF4y2Ba	3.gydF4y2Ba
铜gydF4y2Ba2 +gydF4y2Ba螯合物琼脂糖gydF4y2Ba	50gydF4y2Ba
Boronate-agarosegydF4y2Ba	5gydF4y2Ba

表3。gydF4y2Ba纯化后的内-1,4-β-木聚糖酶的蛋白和活性值gydF4y2Ba黑曲霉gydF4y2Ba在铜gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}螯合物琼脂糖gydF4y2Ba

	总蛋白(毫克)gydF4y2Ba	总活动(U)gydF4y2Ba	特定的活动(U.mggydF4y2Ba－1gydF4y2Ba）gydF4y2Ba	收益率(%)gydF4y2Ba	净化的因素gydF4y2Ba
粗提物gydF4y2Ba	26gydF4y2Ba	52岁的8gydF4y2Ba	2, 03gydF4y2Ba	One hundred.gydF4y2Ba	1，00gydF4y2Ba
Endo-xylanase我gydF4y2Ba	2、7gydF4y2Ba	22日,7gydF4y2Ba	8日,41gydF4y2Ba	43gydF4y2Ba	4、14gydF4y2Ba

酶在工业过程中的应用使其固定化成为一种多相催化剂成为必要。考虑到酶是通过金属螯合载体选择性吸附和纯化的，第一个尝试的策略是使用异官能金属醛活化载体。这种载体能够通过增加培养pH值来共价固定选择性吸附的酶，从而增加酶的胺基亲核性，改善共价固定到载体表面[38]上的醛基。使用这种载体可以使酶的纯化和共价固定化只需要一步。酶在中性pH下固定化，然后pH增加到10有利于共价固定化。最后，进行了一个还原过程，将该过程转化为不可逆过程。这个过程允许木聚糖酶I(木聚糖酶活性的50%)的完全固定，并且在用Bradford方法测量蛋白质量后没有发现泄漏，确认酶是共价固定的。然而，这一方案(在碱性pH下培养加上还原步骤)产生了不活性衍生物。考虑到一个空白的可溶性酶在碱性条件和还原剂存在的情况下都是活性的，失活可能来自于载体上的醛基与共价多重相互作用产生的刚性。gydF4y2Ba

因此，我们尝试了一种分两步的协议。第一步用铜纯化酶gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-活化的载体如上所述，然后酶被固定化。考虑到在纯化过程中，用不同离子交换剂或其他硼酸盐激活载体激活的载体都不能固定该蛋白，因此尝试用醛激活载体来固定该蛋白。在这个支架上的固定必须在pH值为10的情况下进行。这允许通过与赖氨酸[43]的最富位置相对应的脱质子胺基的最富区域来固定。纯化的Xyl I被迅速固定，事实上，在15分钟内，超过80%的这种酶与载体结合，在2小时后完全固定(图3)。最后，减少制备以稳定键。与可溶性酶相比，最终表达活性在80%左右。观察到的活性为衍生物13 U/g。gydF4y2Ba

图3。gydF4y2Ba木聚糖酶I的固定化gydF4y2Ba答:尼日尔gydF4y2Baglyoxyl-agarose。可溶性酶(♦)上清液(■)和悬浮液(▲)。反应在pH为10的100mm碳酸氢钠缓冲液中进行，温度为25°C。gydF4y2Ba

具有木聚糖酶活性的酶部分不被铜吸附gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}-支持也提供乙醛基支持。固定化的结果非常缓慢，事实上，2小时后无法检测到，只有48小时后70%的该组分才共价连接到载体上。这一结果证实了二羟酶是一种具有不同特性的酶。木聚糖酶I和木聚糖酶II是提取物中两种主要的木聚糖酶，是后续研究的候选木聚糖酶。两种蛋白也使用高反应性的载体作为cnbr活化的Sepharose进行固定化。这种载体能够通过与可溶性酶[43]具有类似性质的少量链接来固定。使用较短的固定化时间(约15分钟)，每种酶(xyl I和xyl II)只有约30%被单独固定化，保持初始活性不变。gydF4y2Ba

对不同制备方法的热稳定性进行了评价。可溶性酶xyl I和xyl II在60°C孵育后的半衰期分别约为18和7分钟。与相应的可溶性酶相比，CNBr衍生物的稳定因子分别为6倍和5.5倍。在乙醛氧基-琼脂糖载体上固定化的制剂的活性几乎没有改变(图4A)。在更高的温度下(75°C)培养促进乙醛基衍生物的失活，其半衰期分别为xyl I和xyl II的3.5和0.8小时(图4B)。两种酶的不同制备的热稳定性再次表明它们是不同的酶。gydF4y2Ba

图4。gydF4y2Ba木聚糖酶I和木聚糖酶II不同制剂的热失活过程。可溶性环氧树脂I(□)，可溶性环氧树脂II(▲)，cnbr -环氧树脂I(♦)，cnbr -环氧树脂II(■)，乙醛-环氧树脂I(〇)和乙醛-环氧树脂II(●)。实验在60°C (A)和75°C (B)和pH值为5的条件下进行。gydF4y2Ba

环氧-乙醛-琼脂糖衍生物的稳定性优化:gydF4y2Ba环氧乙醛衍生物在碱性pH下固定2小时得到最稳定的衍生物。然而，不同酶与乙醛基载体在碱性pH下的孵育时间的增加会产生具有更多共价键的衍生物，从而制备出具有不同稳定性的制剂[36]。因此，将刚固定化的酶在还原前与载体孵育不同时间，然后评价其热稳定性。不同衍生物的稳定性随孵育时间的增加而增加。孵育20小时后获得最大的稳定性(图5A)。较长的孵育时间并未产生更稳定的衍生品(数据未显示)。gydF4y2Ba

将最佳制备物与60°C下的可溶性环氧I进行比较(图5B)。可溶性酶的半衰期约为18分钟，最佳制备的半衰期约为13.8天。这导致了与可溶性酶相比，该制剂的稳定因子约为1100倍。gydF4y2Ba

图5。gydF4y2BaA)对环氧I乙醛基琼脂糖制剂进行热灭活，固定化孵育2小时，然后在pH值为10的条件下孵育不同时间。未经过额外孵育(♦)和孵育5小时(■)和20小时(▲)后得到的衍生物。实验在70°C和pH值为5的条件下进行。B)在乙醛酰-琼脂糖上固定并在pH值10下孵育20小时(♦)的环氧I的热失活和可溶性酶(▲)。实验在pH值5,60°C下进行。gydF4y2Ba

最佳催化剂在不同温度下的活性:gydF4y2Ba在不同温度下，测定了最佳固定化制剂与可溶性酶(I)的活性。可溶性酶的最大活性在55°C时显示出来，然后在82°C时活性开始下降，直到低于20%。最佳衍生物的最大活性在65°C时获得，在82°C时活性约为50%(图6)。这一事实与固定化制备物比可溶性酶具有更高的热稳定性有关。gydF4y2Ba

图6。gydF4y2Ba温度对乙醛-琼脂糖(♦)上可溶的(▲)和固定的环氧I酶活性的影响。gydF4y2Ba

最佳乙醛基衍生物水解木聚糖的研究gydF4y2Ba

在乙醛-琼脂糖上固定化稳定的最佳制备的内-1,4-β-木聚糖酶(xyl I)催化下，山毛榉木聚糖水解在不同的温度(4,25和55℃)下进行，并用还原糖检测进行测定(图7)。正如预期的那样，反应速率强烈依赖于温度。但反应速率明显降低，最大转化率与条件无关。由于该衍生物是用纯内切木聚糖酶进行的，它不能水解阿拉伯糖、葡萄糖醛酸或不同位置的乙酰化的其他酯化产物，因此该转化值在使用该制剂时是最大的。为了比较不同温度下的反应诅咒，这个值被认为是100% (DNS法测量的最大转化率)。gydF4y2Ba

图7。gydF4y2Ba在4℃(♦)、25℃(■)和55℃(▲)条件下，用固定在乙醛-琼脂糖上的木聚糖酶I水解山毛榉木聚糖(20 mg/mL)，然后测定还原力(DNS法)。实验在pH值为5的条件下进行。gydF4y2Ba

研究人员还研究了在不同时间和温度下产生的不同化合物(表4)。有趣的是，不同反应的组成取决于进行的温度。较低的温度有利于含有1-3单位木糖的化合物的出现。温度的升高有利于形成聚合度较高的XOS (DP> 4单位木糖)。例如，当转化率为该催化剂最大转化率的42-45%左右时，XOS 1-XOS 3在4℃、25℃和55℃条件下的总含量分别为3.02、1.64和1.18 mg/mL;当转化率为90%时，25℃条件下木糖含量高于55℃条件下的木糖含量(分别为1.17和0.3 mg/mL);而在4、25和55℃条件下，XOS 4-XOS 6的产率分别为0.78、0.91和1.06 mg/mL。当转化率达到90%时，木糖在25℃下的含量高于55℃下的含量(分别为1.17和0.3 mg/mL)。相反，当反应分别在4、25和55℃时，X4-X6的产量分别为0.78、0.91和1.06 mg/mL(表4)。gydF4y2Ba

表4。gydF4y2Ba木糖和低聚木糖(XOS)水解后的山毛榉木聚糖(20 mg/mL)固定化在乙醛-琼脂糖木聚糖酶，在不同的温度。gydF4y2Ba

2021年版权燕麦。所有权利reservgydF4y2Ba

温度(°C)gydF4y2Ba	相对gydF4y2Ba 转换gydF4y2Ba	时间gydF4y2Ba	木糖和XOS (mg/mL)gydF4y2Ba
	（％）gydF4y2Ba	(h)gydF4y2Ba	X1gydF4y2Ba	XOS2gydF4y2Ba	XOS3gydF4y2Ba	X4gydF4y2Ba	X5gydF4y2Ba	X6gydF4y2Ba	总计gydF4y2Ba
控制(木聚糖)gydF4y2Ba	4．5gydF4y2Ba	-gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0.09gydF4y2Ba	0.03gydF4y2Ba	0.04gydF4y2Ba	0.16gydF4y2Ba
4gydF4y2Ba	5.3gydF4y2Ba	0．5gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．10gydF4y2Ba	0.03gydF4y2Ba	0.04gydF4y2Ba	0.17gydF4y2Ba
	6.1gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0.11gydF4y2Ba	0.04gydF4y2Ba	0.05gydF4y2Ba	0.20gydF4y2Ba
	34.3gydF4y2Ba	24gydF4y2Ba	0.04gydF4y2Ba	0.90gydF4y2Ba	0.58gydF4y2Ba	0.44gydF4y2Ba	0.17gydF4y2Ba	0．10gydF4y2Ba	2.23gydF4y2Ba
	44.9gydF4y2Ba	50gydF4y2Ba	0．10gydF4y2Ba	1.77gydF4y2Ba	1.15gydF4y2Ba	0.53gydF4y2Ba	0.16gydF4y2Ba	0.09gydF4y2Ba	3.80gydF4y2Ba
	55.5gydF4y2Ba	75gydF4y2Ba	0.20gydF4y2Ba	2.61gydF4y2Ba	1.46gydF4y2Ba	0.50gydF4y2Ba	0.13gydF4y2Ba	0.08gydF4y2Ba	4.98gydF4y2Ba
	61.5gydF4y2Ba	125gydF4y2Ba	0.37gydF4y2Ba	3.65gydF4y2Ba	1.64gydF4y2Ba	0.36gydF4y2Ba	0.08gydF4y2Ba	0.06gydF4y2Ba	6.16gydF4y2Ba
25gydF4y2Ba	8.6gydF4y2Ba	0．5gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0.12gydF4y2Ba	0.05gydF4y2Ba	0.05gydF4y2Ba	0.22gydF4y2Ba
	12.1gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0.05gydF4y2Ba	0.04gydF4y2Ba	0.16gydF4y2Ba	0.07gydF4y2Ba	0.06gydF4y2Ba	0.38gydF4y2Ba
	42.7gydF4y2Ba	24gydF4y2Ba	0.01gydF4y2Ba	0.89gydF4y2Ba	0.74gydF4y2Ba	0.53gydF4y2Ba	0.24gydF4y2Ba	0.14gydF4y2Ba	2.55gydF4y2Ba
	75.7gydF4y2Ba	32gydF4y2Ba	0.43gydF4y2Ba	4.65gydF4y2Ba	1.88gydF4y2Ba	0.32gydF4y2Ba	0.06gydF4y2Ba	0.06gydF4y2Ba	7.40gydF4y2Ba
	90.9gydF4y2Ba	125gydF4y2Ba	1.17gydF4y2Ba	6.69gydF4y2Ba	1.26gydF4y2Ba	0.15gydF4y2Ba	0.04gydF4y2Ba	0.05gydF4y2Ba	9.36gydF4y2Ba
55gydF4y2Ba	17.3gydF4y2Ba	0．5gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0.08gydF4y2Ba	0.08gydF4y2Ba	0.20gydF4y2Ba	0.11gydF4y2Ba	0.09gydF4y2Ba	0.56gydF4y2Ba
	28.0gydF4y2Ba	1gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0.24gydF4y2Ba	0.27gydF4y2Ba	0.31gydF4y2Ba	0.18gydF4y2Ba	0.13gydF4y2Ba	1.13gydF4y2Ba
	44.4gydF4y2Ba	2gydF4y2Ba	0．00gydF4y2Ba	0.56gydF4y2Ba	0.62gydF4y2Ba	0.53gydF4y2Ba	0.32gydF4y2Ba	0.21gydF4y2Ba	2.24gydF4y2Ba
	89.6gydF4y2Ba	10gydF4y2Ba	0.30gydF4y2Ba	5.36gydF4y2Ba	2.99gydF4y2Ba	0.91gydF4y2Ba	0.13gydF4y2Ba	0.07gydF4y2Ba	9.76gydF4y2Ba
	96.8gydF4y2Ba	24gydF4y2Ba	0.98gydF4y2Ba	8.50gydF4y2Ba	3.10gydF4y2Ba	0.22gydF4y2Ba	0.05gydF4y2Ba	0.06gydF4y2Ba	12.91gydF4y2Ba
	100.0gydF4y2Ba	One hundred.gydF4y2Ba	2.20gydF4y2Ba	11.17gydF4y2Ba	1.05gydF4y2Ba	0.14gydF4y2Ba	0.05gydF4y2Ba	0.07gydF4y2Ba	14.68gydF4y2Ba

X1)木糖，XOS: 2木糖二糖，3木糖三糖，4木糖四糖，5木糖戊糖，6木糖己糖。实验按照方法部分的描述进行。gydF4y2Ba

考虑木聚糖溶液初始浓度为20 mg/mL，当反应温度为55℃，木聚糖转化率为100%时，木糖(X1)和XOS (XOS 2-XOS 6)的产率最高，木糖产量分别为73.4% (14.68 mg/mL)和11% (2.20 mg/mL)(图8)。而当木聚糖转化率为96.8%时，木糖产量下降至5% (0.98 mg/mL)。62% (11.93 mg/mL)的生前XOS (X2-X6)得到。这是一个非常高的转化率，考虑到提取物中显然没有其他酶，如酯酶和其他酶，其余的与其他糖的链接，如阿拉伯糖或乙酰化不能被水解。gydF4y2Ba

图8。gydF4y2Ba在55℃下[A] 2 h(44%转化率)和[B] 100 h(100%转化率)水解后可溶性山毛榉木聚糖(20 mg/mL)由衍生物i -乙醛-琼脂糖水解产物的HPAEC-PAD色谱图。1)木糖，2)木糖二糖，3)木糖三糖，4)木糖四糖，5)木糖戊糖，6)木糖己糖，7)DP>的其他XOS 6。实验按照方法部分的描述进行。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

细胞外木聚糖酶gydF4y2Ba答:尼日尔gydF4y2Ba以玉米芯为碳源制备的炭素易于纯化、固定和稳定，只需两步。乙醛衍生物在60°C下的稳定性是可溶性酶的1100倍左右。gydF4y2Ba

本文所描述的最佳生物催化剂具有从木质纤维素材料中生产高附加值的功能性XOS的质量。最佳催化剂的高稳定性允许在更高的温度下进行水解，提高反应速率并避免可能的微生物污染。XOS的最终形状可以通过改变过程中的温度和时间来控制。利用所开发的工艺，可从可溶性木聚糖中生产62%的对消化道有益的寡糖(X2-X6)。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

Ramón阿雷斯基金会的财政支持得到高度认可。阿拉贡感谢巴西机构FAPESP(2008/09332-8)和cape(3756-10-6)的财政支持。这项工作得到了西班牙政府的支持(AGL2017-84614-C2-1-R)。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba

1. Collins T, Gerday C, Feller G(2005)木聚糖酶，木聚糖酶家族和嗜极木聚糖酶。gydF4y2Ba《牧师gydF4y2Ba29: 3-23。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
2. Azevedo AFC, de Oliva Neto P, Silva DF, Pastore GM(2013)来自木质纤维素材料的低聚木糖:化学结构、健康益处和通过化学和酶水解的生产。gydF4y2Ba食物Res IntgydF4y2Ba51: 75 - 85。gydF4y2Ba
3. Polizeli ML, Rizzatti AC, Monti R, Terenzi HF, Jorge JA，等(2005)真菌木聚糖酶的性质和工业应用。gydF4y2Ba生物科技:Microbiol》gydF4y2Ba67: 577 - 591。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
4. 吕震，杨军，袁宏(2008)一种嗜碱内do-β-14-木聚糖酶的制备、纯化及鉴定。gydF4y2Ba酶活工艺gydF4y2Ba43: 343 - 348。gydF4y2Ba
5. Biely P, Markovic O, Mislovicová D(1985)凝胶中内源性-1,4-葡聚糖酶和内源性-1,4-木聚糖酶的敏感检测。gydF4y2Ba学生物化学肛门gydF4y2Ba144: 147 - 151。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
6. Dhiman SS, Kalyani D, Jagtap SS, Haw JR, Kang YC，等。(2013)双孢蜜环菌木聚糖酶的表征及其在SiO2纳米颗粒上的固定化。gydF4y2Ba生物科技:Microbiol》gydF4y2Ba97: 1081 - 1091。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
7. Sardar M, Roy I, Gupta MN(2000)在可逆可溶性聚合物Eudragit (TM) L-100上同时纯化和固定化黑曲霉木聚糖酶。gydF4y2Ba酶活工艺gydF4y2Ba27日:672 - 679。gydF4y2Ba
8. 陈红，刘亮，吕松，刘旭，王敏等。(2010)双醛淀粉偶联剂在壳聚糖上固定化黑曲霉木聚糖酶的研究。gydF4y2Ba生物科技:生物化学》gydF4y2Ba162: /。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
9. Pal A, Khanum F(2011)用响应面法在戊二醛活化藻酸珠上共价固定化木聚糖酶:固定化酶的表征。gydF4y2Ba学生物化学过程gydF4y2Ba46: 1315 - 1322。gydF4y2Ba
10. Damásio ARDL, Silva TM, Almeida FBDR, Squina FM, Ribeiro DA, et al. (2011) niveus Aspergillus niveus木聚糖酶GH11在niidulans中的异源表达及其表征和应用。gydF4y2Ba学生物化学过程gydF4y2Ba46: 1236 - 1242。gydF4y2Ba
11. 曲霉木聚糖酶在Eudragit S-100上固定化的制备、表征和应用。gydF4y2Ba生物科技J》gydF4y2Ba66: 165 - 175。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
12. 郭达MK, Abdel-Naby MA(2002)固定化柽柳曲霉木聚糖酶的催化性能。gydF4y2BaMicrobiol ResgydF4y2Ba157: 275 - 81。gydF4y2Ba
13. Rogalski J, Szczodrak J, Dawidowicz A, Ilczuk Z, Leonowicz A(1985)地曲霉F-413纤维素酶和d -木聚糖酶复合物在控制孔隙度玻璃上的固定化。gydF4y2Ba酶活工艺gydF4y2Ba7: 395 - 400。gydF4y2Ba
14. Aragon CC, Santos AF, Ruiz-Matute AI, Corzo, N, Guisan JM，等。(2013)用固定化稳定生物催化剂从杂色曲霉中提取木聚糖酶，在填充床反应器中连续生产低聚木糖。gydF4y2BaJ Mol催化B酶gydF4y2Ba98: 8 - 14。gydF4y2Ba
15. 林永云，曾俊梅，李卫东(2011)利用固定化的卤酸芽孢杆菌木聚糖酶生产低聚木糖。gydF4y2Ba学生物化学过程gydF4y2Ba46: 2117 - 2121。gydF4y2Ba
16. Kapoor M, Kuhad RC(2007)短小芽孢杆菌MK001株木聚糖酶的固定化及其在低聚木糖生产中的应用。gydF4y2Ba生物科技:生物化学》gydF4y2Ba142: 125 - 138。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
17. Nagar S, Mittal A, Kumar D, Kumar L, Gupta VK(2012)木聚糖酶在戊二醛活化氧化铝球上的固定化提高家禽饲料消化率。gydF4y2Ba学生物化学过程gydF4y2Ba47: 1402 - 1410。gydF4y2Ba
18. Manrich A, Komesu A, Adriano WS, Tardioli PW, Giordano RLC(2010)琼脂糖和壳聚糖载体上的多重共价附着固定化和稳定木聚糖酶。gydF4y2Ba生物科技:生物化学》gydF4y2Ba161: 455 - 467。gydF4y2Ba
19. Dhiman SS, Jagtap SS, Jeya M, Haw JR, Kang YC，等。(2012)在SiO₂纳米颗粒上固定化脂肪醇木聚糖酶及其在低聚木糖生产中的应用。gydF4y2BaBiotechnol列托人gydF4y2Ba34: 1307 - 1313。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
20. Sarbu A, de Pinho MN, Freixo MDR, Goncalves F, Udrea I(2006)通过丙烯酰胺在醋酸纤维素膜上的自由基接枝共价固定木聚糖酶的新方法。gydF4y2Ba酶活工艺gydF4y2Ba39: 125 - 130。gydF4y2Ba
21. Aragon CC, Mateo C, Ruiz-Matute AI, Corzo N, Fernandez-Lorente G，等。(2013)利用固定化稳定链霉菌内生木聚糖酶衍生物生产低聚木糖。gydF4y2Ba学生物化学过程gydF4y2Ba48: 478 - 483。gydF4y2Ba
22. 艾铮，姜铮，李磊，邓伟，草部一等(2005)橄榄绿链霉菌E-86木聚糖酶在Eudragit S-100上的固定化及低聚木糖的研究。gydF4y2Ba学生物化学过程gydF4y2Ba40: 2707 - 2714。gydF4y2Ba
23. maaleje - achouri I, Guerfali M, Gargouri A, Belghith H(2009)利用固定化嗜热木聚糖酶从农工业残留物中生产低聚木糖。gydF4y2BaJ Mol催化B酶gydF4y2Ba59: 145 - 152。gydF4y2Ba
24. 闫晓，王霞，赵鹏，张燕，徐鹏，等。(2012)木聚糖酶固定化纳米孔金的研究进展。gydF4y2Ba微孔介孔板牙gydF4y2Ba161: 1 - 6。gydF4y2Ba
25. Edward VA, Pillay VL, Swart P, Singh S(2002)利用Eudragit S-100固定化热孢木聚糖酶。gydF4y2BaS Afr J科学gydF4y2Ba98: 553 - 554。gydF4y2Ba
26. 李亮，邹勇，黄铮，蒋铮，陈伟伟(2007)海洋热toga重组木聚糖酶B (XynB)在金属螯合物Eupergit C 250L上的固定化。gydF4y2Ba酶活工艺gydF4y2Ba41: 278 - 285。gydF4y2Ba
27. Simpson HD, Haufler UR, Daniel RM(1991)一种来自嗜热真细菌Thermotoga的极耐热木聚糖酶。gydF4y2Ba物化学JgydF4y2Ba277: 413 - 417。gydF4y2Ba
28. 卡诺Á， Minguillón C, Palet C(2006)内-1,4-β-木聚糖酶在聚砜丙烯酸酯膜上的固定化。gydF4y2BaJ会员ScigydF4y2Ba280: 383 - 388。gydF4y2Ba
29. 徐铮，苗勇，陈建勇，蒋旭，林玲等。(2011)纤维素酶和木聚糖酶在可逆可溶性聚合物上的共固定化机理。gydF4y2Ba:生物化学生物技术gydF4y2Ba163: 153 - 161。gydF4y2Ba
30. Akdemir ZS, Demir S, Kahraman MV, Apohan NK(2011)木聚糖酶共价固定化的uv固化聚合物载体的制备和表征。gydF4y2BaJ Mol催化B酶gydF4y2Ba68: 104 - 108。gydF4y2Ba
31. Dumitriu S, Chornet E(1997)木聚糖酶在壳聚糖-黄原胶水凝胶中的固定化。gydF4y2BaBiotechnol掠夺gydF4y2Ba13: 539 - 545。gydF4y2Ba
32. Madakbas S, Demir S, Kahraman MV(2013)共价附着在功能化聚苯胺载体上的木聚糖酶固定化。gydF4y2BaStarch-StarkegydF4y2Ba65: 146 - 150。gydF4y2Ba
33. Benedetti ACEP, Costa ED, Aragon CC, Santos AF, Goulart AJ等人(2013)利用黑曲霉生产耐热木聚糖酶的低成本碳源。gydF4y2Ba科学农场基础应用gydF4y2Ba34: 25-31。gydF4y2Ba
34. Miller GL(1959)用二硝基水杨酸试剂测定还原糖。gydF4y2Ba肛门化学gydF4y2Ba31日:426 - 428。gydF4y2Ba
35. 一种利用蛋白质-染料结合原理对蛋白质的微克量进行定量的快速、灵敏的方法。gydF4y2Ba学生物化学肛门gydF4y2Ba72: 248 - 254。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
36. Guisán JM(1988)醛-琼脂糖凝胶作为酶的固定化-稳定的活性载体。gydF4y2Ba酶活工艺gydF4y2Ba10: 375 - 382。gydF4y2Ba
37. Mateo C, Abian O, Fernández-Lafuente R, Guisan JM(2000)载体-聚乙烯亚胺复合材料上的非扭曲离子吸附可逆固定化酶。gydF4y2BaBiotechnol BioenggydF4y2Ba68: 98 - 105。gydF4y2Ba
38. Mateo C, Bolivar JM, Godoy C, Rocha-Martin J, Pessela BC，等。(2010)新型异功能载体的两步固定化过程改善酶的性能。gydF4y2Ba《生物高分子gydF4y2Ba11: 3112 - 3117。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
39. 阿米森P, Mateo C, Cortés E, Barredo JL, Salto F，等。(1999)多聚his标记戊二酰化酶在定制金属螯合载体上的选择性吸附。gydF4y2BaJ ChromatogrgydF4y2Ba848: 61 - 70。gydF4y2Ba
40. 李志明，李志明(1986)。gydF4y2BaBiotechnol BioenggydF4y2Ba28日:1277 - 1285。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
41. Laemmli UK (1970) T4噬菌体头部组装过程中结构蛋白的裂解。gydF4y2Ba自然gydF4y2Ba227: 680 - 685。gydF4y2Ba(Crossref)gydF4y2Ba
42. Heukeshoven J, Dernick R(1985)聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质银染色的简化方法和银染色机理。gydF4y2Ba电泳gydF4y2Ba6: 103 - 112。gydF4y2Ba
43. Mateo C, Abian O, Bernedo M, Cuenca E, Fuentes M，等(2005)乙醛氧基载体固定化蛋白质的一些特殊特性。gydF4y2Ba酶活工艺gydF4y2Ba37: 456 - 462。gydF4y2Ba