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摘要

蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂(ZPI)是一种蛇形蛋白家族蛋白，与其紧密结合的维生素k依赖性蛋白辅因子蛋白Z (PZ)一起，可以快速特异性抑制膜结合的FXa。与抗凝血酶、组织因子途径抑制剂(TFPI)和活化蛋白C (APC)一起，ZPI/PZ复合物是人血浆中主要的内源性抗凝剂之一。最近的研究表明，在血友病小鼠模型中，ZPI/PZ基因可调节凝血酶原活性，敲除ZPI/PZ基因可部分恢复止血，这表明ZPI/PZ抗凝功能的中和可为血友病治疗提供一种替代疗法。与目前正在开发的其他针对APC、TFPI和抗凝血酶抗凝剂的替代疗法相比，抗zpi /PZ疗法预计更安全，效果相似。最近在开发强效、特异性ZPI/PZ拮抗剂方面的进展，应该能够在血友病小鼠模型中测试这种可能更安全的治疗方法。

关键字

蛋白z依赖性蛋白酶抑制剂，蛋白z，血友病，蛇形蛋白，内源性抗凝剂，凝血

介绍

蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂(ZPI)首先被鉴定并从血浆中纯化为活性因子X (FXa)[1]的蛋白Z (PZ)依赖性抑制剂，后来被鉴定为蛇形蛋白超家族(serpinA10)[2]的成员。ZPI在血浆中与维生素k依赖蛋白Z (PZ) (Kd ~10 nM)紧密复合物循环，PZ在结构上与因子II, VII, IX, X同源，但由于缺乏催化三联体[3]的丝氨酸和组氨酸残基，因此缺乏蛋白酶活性。在人血浆中，ZPI和PZ的水平范围很广(ZPI ~59±8 nM, PZ ~46±16 nM) [4,5]， ZPI略高于PZ;因此，大部分ZPI和PZ以复合物的形式存在于等离子体[6]中。口服避孕药可提高血浆ZPI/PZ水平，口服抗凝治疗可降低血浆ZPI/PZ水平[5,7]。一些研究发现血浆中ZPI或PZ缺乏是血管血栓形成的危险因素，但另一些研究发现这是一个不确定的危险因素[10]。

ZPI/PZ是血浆中四大抗凝系统之一。其他三种包括:抑制FXa的抗凝血酶、活性因子IX (FIXa)和凝血酶;活性蛋白C (APC)，其蛋白水解降解活性因子V (FVa)和活性因子VIII (fviia);组织因子途径抑制剂(TFPI)，抑制外源性FXase复合物(TF-VIIa-FXa)和FXa。ZPI/PZ作为抗凝血剂通过特异性抑制膜相关的FXa发挥作用。

ZPI/PZ在凝血调节中的重要作用可以从以下研究结果中得到证明:患者或小鼠模型中ZPI或PZ缺乏与因子V Leiden (FVL)突变联合导致严重或致命的血栓表型[10-13]。最近的研究表明，这种血栓形成前状态是由于ZPI/PZ对凝血酶原中FXa的调节和APC[14]对凝血酶原中FVa的互补调节受到损害(图1)。

图1所示。血浆中调节凝血酶生成的主要抗凝系统示意图。血液凝固是由外源性Xase复合物(TF-VIIa)启动的，它迅速激活FX到FXa和FIX到FIXa。FIXa与fviii结合形成内在的Xase复合物，从而放大FX的激活。FXa结合FVa形成凝血酶原(FXa-FVa)，激活凝血酶原到凝血酶。内在Xase复合物(FIXa或fviia)的缺乏导致血友病。凝血酶形成的主要抗凝调节剂包括:抑制游离FXa(*FXa)和凝血酶原结合FXa(#FXa)的ZPI/PZ;抗凝血酶(AT)，抑制凝血酶、FIXa和游离FXa;APC蛋白水解降解FVa和fviia;以及抑制外源性Xase复合物和凝血酶原结合FXa的TFPI。替代FVIII/FIX治疗血友病的替代策略包括靶向APC、抗凝血酶、TFPI和ZPI/PZ抗凝血剂

针对血友病治疗的抗凝系统的疗法

治疗血友病的替代方法侧重于下调抗凝血系统，包括TFPI、抗凝血酶或APC。这些方法目前处于不同的发展阶段。两种人源抗tfpi单克隆抗体正在进行临床试验:诺和诺德公司的concizumab正在进行2期研究[15]的评估，拜耳公司的Bay 1093884正在进行初始人剂量试验b[16]的测试。ALN-AT3(来自Alnylam制药公司的fitusiran)是一种靶向抗凝血酶的RNAi，目前正处于1期临床试验阶段。由蛇形蛋白设计的APC抑制剂α1-抗胰蛋白酶(α1AT)已被发现可以改善血友病小鼠出血，目前仍处于实验室研究阶段。ZPI/PZ抗凝系统最近被提出并被证明是血友病治疗的类似有效靶点。重要的是，TFPI、APC和AT在调节血液调节中发挥的更重要的作用表明，靶向ZPI/PZ治疗血友病可能在许多方面都是有利的，尤其是在安全性方面。本文综述了近年来对ZPI/PZ抗凝功能机制的研究进展，以及如何靶向ZPI/PZ为血友病提供一种有前景的安全预防治疗方法。

ZPI/PZ抑制游离和凝血酶原结合的FXa

在没有辅助因子的情况下，ZPI抑制FXa的速率常数为104M-1s-1。但在PZ、磷脂和Ca2+存在时，抑制加速~1000倍(~107M-1s-1)，接近扩散极限。已有研究证实，ZPI/PZ复合物通过PZ γ -carboxyglutamic (Gla)结构域与膜结合，抑制FXa与促凝磷脂膜表面结合，从而将ZPI反应中心环(reactive center loop, RCL)呈现给FXa，形成ZPI/PZ-FXa三元Michaelis复合物。Michaelis复合体随后经历酰化和构象捕获，形成共价复合体，使蛋白酶的催化功能失活，这与serpin抑制凝血蛋白酶的标准自杀底物机制一致(10)。PZ在血浆中是有限的，其水平是通过催化作用促进ZPI对FXa的抑制来维持的，即一旦ZPI-FXa复合物形成[9]，PZ就会与ZPI分离。与其他蛇形蛋白酶复合物不同，ZPI-FXa共价复合物在中性pH的生理条件下是不稳定的，其半衰期约为1小时，可解离释放活性FXa和裂解的ZPI[9]。

ZPI的RCL中含有P1酪氨酸(Y387)诱饵残留，不利于FXa的识别。因此，RCL和限定RCL的外源位点在ZPI特异性识别FXa的能力中发挥了重要作用。特别是，ZPI的2C表中的Glu313与FXa自溶环中的Arg143的相互作用在介导ZPI-FXa相互作用中是必不可少的[19,20]。PZ和FXa的Gla结构域之间的相互作用进一步促进了促凝膜上三元ZPI/PZ-FXa Michaelis复合物的形成(图2)。

图2。ZPI对膜结合FXa的pz依赖性抑制机制。ZPI/PZ复合物通过PZ Gla结构域与磷脂膜结合，并将ZPI反应中心环(RCL)呈递到膜结合FXa的活性位点，形成三元Michaelis复合物。外源相互作用增强了Michaelis配合物的相互作用，包括ZPI与FXa催化域之间的Glu313-Arg143相互作用和PZ与FXa之间的Gla-Gla相互作用。然后，FXa催化Ser攻击ZPI P1 Tyr裂解RCL，并与FXa形成共价酰基配合物，然后通过标准丝氨酸机制通过ZPI构象变化稳定FXa。PZ从ZPI-FXa共价复合物中解离，然后该共价复合物自身缓慢解离形成裂解的ZPI和活性的FXa

早期研究发现，在FV被活化为FVa形成凝血酶原之前，ZPI/PZ只能抑制FXa，即凝血酶原中的FXa对ZPI/PZ抑制[21]具有抗性。然而，最近的动力学研究表明，凝血酶原复合物FXa被ZPI/PZ以显著的生理速率抑制。虽然这个速率(106M-1s-1)比未络合FXa[14]的抑制速度慢6-8倍，但考虑到未络合FXa在膜[14]上的抑制速度接近扩散限制，它仍然足够快，具有生理学意义。进一步的动力学研究表明，在底物凝血酶原存在的情况下，ZPI/PZ对凝血酶原的抑制作用进一步降低了3-4倍，这与凝血酶原中FXa的动态调节模式一致，该模式是由凝血酶原和ZPI-PZ复合物与FXa的竞争相互作用决定的。ZPI-PZ抑制凝血酶原的生理相关性最明显地体现在野生型(WT) ZPI-PZ复合物的生理水平，而非失活的外源突变体(Glu313Ala) ZPI-PZ复合物在凝血酶原催化的凝血酶原生理水平激活过程中抑制凝血酶生成的能力上(图3)。只有在检查凝血酶生成的完整进展曲线时，这种抑制才变得明显。从而解释了早期研究的失败，该研究仅在初始阶段观察凝血酶的产生，并观察到ZPI/PZ的显著抑制作用。总之，这些数据表明ZPI/PZ复合物在与凝血酶原[14]结合之前和之后都能靶向FXa。因此，在凝血[14]的增殖阶段，ZPI/PZ似乎可以补充APC系统抑制凝血酶原。这与另一种FXa抑制剂抗凝血酶形成对比，抗凝血酶在与凝血酶原[22]结合后是FXa的不良抑制剂。值得注意的是，最近的研究表明，TFPI-α也抑制凝血酶原结合的FXa，但仅在凝血起始阶段凝血酶原形成的中间阶段。

图3。野生型或E313A ZPI-PZ复合物的血浆水平抑制凝血酶原的激活。凝血酶原与FVa (16nM)、FXa (0.06nM)、25µM 30% PS/ 70% PC囊泡和5mM Ca组装后激活凝血酶原(1.4µM)的时间过程^{2 +}60 nM ZPI或E313A ZPI和50 nM PZ在I 0.15, pH 7.4的缓冲液中，在25°C下不存在(实体符号)或存在(开放符号)。用FXa/FVa/脂质/Ca2+开始反应，并在不同时间用显色凝血酶底物加10 mM EDTA作为反应缓冲液猝灭，并测定剩余凝血酶活性。数据代表3-4次独立测量的平均值，平均值±标准差PS:磷脂酰丝氨酸;PC:磷脂酰胆碱。实线是数据的经验拟合。修改自Huang X，et al。[14]

ZPI和PZ在恶性肿瘤中上调，并在许多癌组织中与FX共定位，这可能反映了ZPI/PZ和FX在肿瘤bb0中协同上调，间接表明了ZPI/PZ调控游离和凝血酶原结合的FXa的重要性。许多凝血或抗凝因子同样被报道在恶性肿瘤[25]中上调，并有助于血栓形成前状态(见Levi[26]的综述)。

ZPI/PZ, Leiden因子V (FVL)与血友病

众所周知，FVL突变是一种常见的FV突变，产生抗APC抗凝失活的FVa，与中度血栓形成风险相关[27,28]，类似于人类和动物模型中的ZPI或PZ缺乏表型[11,29]。然而，FVL合并ZPI或PZ缺乏会导致更严重的血栓前表型[10-13]。相比之下，ZPI和/或PZ缺乏对其他类型的血栓形成风险的影响要小得多，如凝血酶原G20210A和高同型半胱氨酸血症[30]。一个合理的解释这些观察结果的机制是APC和ZPI/PZ作为凝血酶原活性的互补调节因子，分别通过降解FVa或抑制FXa。因此，在临床人类或动物模型中观察到的FVL或ZPI/PZ缺乏症的中度血栓形成表型表明，下调这些抗凝剂中的一种会导致凝血酶原适度过度活跃。然而，当FVL合并ZPI或PZ缺乏时，更严重的血栓表型表明，下调APC和ZPI/PZ抗凝剂会导致凝血酶原明显过度活跃。这些观察结果还表明，FVL和ZPI/PZ缺乏在促进血栓形成前表型方面具有相似的效力。

据许多研究者报道，FVL表型与血友病患者较轻的临床症状相关，包括较少的出血发作和较少的凝血因子输注需求[31-33](参见van Dijk的综述)et al。b[34]和Franchiniet al。[35]，其中Mann和Mertens研究组已经阐明了分子机制[36,37]。此外,在活的有机体内对血友病小鼠的研究清楚地表明，FVL突变显著改善血友病A和B小鼠的凝血试验谱以及微循环损伤后的止血，其效果与补充FVIII和FIX凝血因子[38]所产生的止血恢复相当。

由于FV缺乏是致命的，因此很难针对FV进行血友病治疗。然而，ZPI/PZ系统是一个更可行的靶点，最近ZPI/PZ拮抗剂[39]的发展证明了这一点。

靶向ZPI/PZ治疗血友病

ZPI/PZ复合物对游离和凝血酶原结合的FXa的抗凝调节表明，ZPI/PZ可能是调节止血的重要治疗靶点。与这一假设相一致，Thomas Girard和George Broze最近的一项研究表明，抗PZ单克隆抗体或抗PZ单克隆抗体可下调人血友病血浆中的ZPI或PZ在活的有机体内在血友病a小鼠模型中敲除ZPI或PZ基因可显著改善出血表型，相当于

~15% FVIII置换[40]。众所周知，临床血友病表型从严重(<1% FVIII)与自发性出血相关，到轻度(5-40% FVIII)不等，在没有外伤或外科手术的情况下，出血并不常见。因此，这表明中和ZPI/PZ抗凝功能，虽然效果不大，但足以改善严重血友病的表型。

Bolkunet al。据报道，在血友病A患者中观察到ZPI/PZ抗凝系统的上调(ZPI升高19%，PZ升高26%)，在严重血友病A患者中发现ZPI或PZ水平与出血率和关节出血相关[10]。

ZPI/PZ相互作用及ZPI/PZ拮抗剂的研制

ZPI/PZ配合物的晶体结构由两个基团(PDB: 3H5C和3F1S)确定[20,42]。这些结构和诱变研究,表明ZPI-PZ交互是D74由离子相互作用,D238,和D293螺旋G和螺旋PZ的ZPI pseudocatalytic域,和疏水相互作用的1美元的ZPI PZ EGF2和pseudocatalytic域之间的空腔形成PZ(图4)。D293和1美元占大多数的ZPI PZ结合能,因此热点PZ ZPI绑定。重要的是，K239是靠近Y240的ZPI接触残基之一，被发现可以拮抗ZPI- PZ相互作用。Lys239与丙氨酸或半胱氨酸的突变导致ZPI突变体与PZ的结合比WT型ZPI紧密20倍以上。这种增强的结合要么是由于较小的中性侧链消除了位阻，要么是中和了带正电的ZPI K239侧链与附近的碱性PZ残基之间的排斥相互作用，从而加强了ZPI Y240与PZ之间的临界疏水相互作用[43,44]。

图4。ZPI(青色)-PZ(绿色)配合物(PDB:3H5C)的晶体结构。突变的氨基酸在紫色的球体中。结合PZ的ZPI残基是红色的

基于这些发现,最近的一项研究由美国工程两个ZPI突变,一个在RCL P1 Y387残灭活FXa / FXIa serpin抑制函数,第二个在K239绑定界面残渣提高亲和力的不活跃的ZPI PZ(图4)。研究发现,Y387A / K239A突变ZPI (ZPI-2A)有效地竞争与和取代WT ZPI复杂PZ导致活动ZPI-2A-PZ复合物和非复杂WT ZPI。对该ZPI突变体进行了一系列表征实验，结果发现:1)ZPI- 2a与PZ >的结合比WT型ZPI紧密20倍(Kd值为0.4±0.1 nM比10±1 nM);ii)无论FXa与凝血酶原结合或未结合，ZPI- 2a均能有效中和ZPI/PZ抗FXa活性，其摩尔量比WT ZPI高3倍;iii)在纯化系统或正常/血友病血浆中的凝血酶生成实验中，ZPI- 2a以剂量依赖的方式逆转了ZPI/PZ的抗凝血活性，在WT型ZPI上，ZPI- 2a的3倍摩尔过量足以完全逆转ZPI/PZ对凝血酶生成的抑制(图5)。人类ZPI/PZ的血浆浓度为~50-60nM，因此ZPI- 2a突变体的浓度低至~150-200nM即可实现完全失活。因此，ZPI- 2a是一种新开发的具有ZPI/PZ抗凝功能的强效特异性拮抗剂。ZPI-2A是否可以改善血友病小鼠模型的出血，目前正在作者实验室进行研究。

图5。ZPI- 2a逆转了ZPI/PZ对血浆凝血酶生成的抗凝作用。在ZPI/PZ缺陷血浆中，以WT型ZPI和PZ (A)的血浆水平为底物，或在100μl血友病A血浆中，不存在ZPI- 2a的最终浓度，或抗PZ多克隆抗体(PZAb) (0-200μg/ml)/对照羊IgG (B)在I 0.15 Tris缓冲液pH 7.4, 37中进行反应^oC.通过添加含有20%PS:20%PE:60%PC和Ca的小单层脂质囊泡(suv)来激活凝血^{2 +,}玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)(阻断接触激活)和组织因子(TF)的总量为150μl。最终浓度为25μM suv, 16mM Ca^{2 +,}CTI 50μg/ml, TF 2pM, ZPI/PZ 35nM, ZPI- 2a 0-100nM, PZAb/对照IgG 200µg/ml。所有数据均代表3-4个独立测量值的平均值±SD。PS:磷脂酰丝氨酸;体育:磷脂酰乙醇胺;PC:磷脂酰胆碱。修改自Huang X，et al。[39]

拮抗剂下调ZPI/PZ活性的另一种可能策略是识别一种可以结合ZPI/PZ界面并破坏ZPI/PZ复合物的小分子。最近在发现和开发蛋白质-蛋白质相互作用的小分子拮抗剂方面取得了令人鼓舞的进展，特别是在靶向这些相互作用结合热点的小分子方面。ZPI-PZ界面似乎特别适合这种方法，因为ZPI-Y240与其PZ结合伙伴中的一个大部分疏水口袋形成热点相互作用(图4)。这个口袋导致通过PZ的扩展通道，可以为锚定在Y240结合位点的抑制剂形成扩展的结合位点。这种小分子拮抗剂的高通量筛选试验可以利用已建立的ZPI/PZ结合试验，该试验采用荧光团标记的K239C ZPI突变体，该突变体通过300-400%的荧光增强[43]敏感地报告PZ结合。结合到ZPI/PZ界面并阻断ZPI/PZ复合物形成的小分子因此可以通过增强荧光信号的猝灭来识别。作者未发表的研究实际上已经使用这种方法筛选大型文库，并成功鉴定了几种ZPI/PZ相互作用的小分子拮抗剂，尽管它们的亲和力和特异性较低。治疗血友病的小分子药物的优点包括:i)它不会引起受试者广泛的免疫反应，导致患者难以治疗;2)小分子药物可以口服，而目前所有的治疗方法都是以注射为基础的，3)小分子药物的生产要容易得多，成本也更低。口服药物减少血友病患者出血的潜力可能会改变他们的生活。虽然努力鉴定一种与ZPI或PZ具有高亲和力的特异性结合的小分子可能具有挑战性，但鉴于高回报，这是一项值得追求的工作。

市面上有许多多克隆或单克隆抗zpi或抗pz抗体。一种抗PZ多克隆抗体被发现能有效阻断正常人和血友病患者血浆中ZPI/PZ抗凝血活性，增强凝血酶生成[14,39]。此外，在最近的一项研究中，一种靶向人PZ伪催化结构域的单克隆抗体被发现可以中和ZPI/PZ活性，尽管其亲和力相对较低。有趣的是，自身免疫抗pz抗体也在一些有产科并发症的女性患者中被检测到，包括复发性流产、死胎、子痫前期、宫内生长受限和胎盘早剥。我们认为，这些抗PZ抗体中的一些会中和患者的ZPI/PZ活性，从而进一步增强已经存在妊娠高凝的患者的促凝状态，导致胎儿发育异常或胎儿丢失。虽然在这些患者中是病理的，但这些完全人源化的PZ抗体(单克隆)，如果成功地克隆、表达、纯化和表征，将有可能开发成临床使用的有用的抗zpi /PZ拮抗剂，就像从人B细胞中分离的其他单克隆抗体正在开发成有用的抗体疗法一样。

抗zpi /PZ治疗血友病的基本原理和潜在优势

针对APC、抗凝血酶或TFPI进行血友病治疗需要谨慎给药，以避免血栓形成的风险，因为这些抗凝剂在维持止血等方面发挥着重要作用。在美国，concizumab是一种单克隆抗体疗法，需要每天注射低剂量的[15]。这些仍在发展中的疗法的长期安全性也是未知的。与靶向TFPI、APC和抗凝血酶相比，靶向ZPI/PZ具有更好的安全性。与APC和抗凝血酶不同，ZPI/PZ不参与抗炎症和细胞保护功能[47-49]。此外，人类的ZPI和/或PZ缺乏只是轻度血栓前性或正常血凝。在健康个体中，PZ变化范围很广，在低PZ人群中没有异常的痕迹。在临床患者中，ZPI和/或PZ缺乏与血栓形成的关系往往存在争议，通常需要其他先前存在的高凝条件，如妊娠、动脉粥样硬化等[8,45]。重要的是，敲除ZPI或PZ基因的动物是正常和健康的动物。相反，小鼠抗凝血酶、TFPI或PC基因缺失会导致子宫内或围产期因血栓形成、弥散性血管内凝血或消耗性凝血病死亡[50-52]。合并血友病不能挽救tpi缺陷的[53]或抗凝血蛋白缺陷的小鼠[51,54]。 Clinical PC and antithrombin deficiencies in humans result in severe thrombosis [55,56]. Safety and health concerns are thus likely to be more problematic in TFPI, antithrombin, and APC targeted therapies that are still under development.

由于ZPI/PZ中和对止血的作用不大，ZPI/PZ完全失活不会导致严重的血栓形成。最近发表的研究表明，在低化学计量剂量下，失活的ZPI- 2a突变体可以在人类血友病血浆中实现完全的ZPI/PZ失活和伴随的凝血酶生成增强。由于ZPI- 2a是WT型ZPI的变体，对PZ结合的效力和特异性较高，预计其免疫原性较低，副作用较少，是临床应用的理想药物。作为蛇形蛋白，ZPI在血浆中的半衰期相对较长(~3天)，与其最同源的家族成员α - 1- at(蛇形蛋白A1)的半衰期(4.5天)相似[3,57]，明显长于用于血友病a和B替代治疗的重组FVIII和FIX的半衰期(分别为~12小时和18-24小时)[58]。ZPI-2A也可以皮下给药，像其他蛇形蛋白药物一样，例如C1酯酶抑制剂(C1- inh, serpinG1) (Haegarda)，是一种经批准的皮下注射治疗遗传性血管性水肿的药物。ZPI- 2a基因敲除对血友病小鼠的作用能否复制，将是检验抗ZPI/PZ治疗潜力的关键。抗zpi /PZ治疗的一个优势在于，它应该对A型血友病和B型血友病患者都有效，而最近批准的FVIII抗体模拟物(半蜜珠单抗)仅对A型血友病有效。抗zpi /PZ治疗在血友病患者中的有效性可以通过血浆凝血酶生成测定来检测，该测定可有效反映A型血友病或B型血友病患者的出血倾向。然而，对于合并FVL的血友病患者，应更加谨慎地使用或避免使用抗zpi /PZ治疗，尽管这种情况非常罕见。

结论

虽然关于ZPI/PZ对血友病患者止血和出血的贡献的研究仍然有限，目前在活的有机体内和在体外数据支持抑制ZPI/PZ抗凝功能可能是血友病患者有效且更安全的预防性治疗方法的观点，类似于FVL改善血友病出血表型的临床观察。这种疗法可以部分恢复血友病患者有缺陷的止血系统，并极大地改善血友病治疗，因为大多数血友病出血不是外伤引起的，而是由自发的微循环损伤引起的。严重血友病尤其如此，占血友病人群的60%。此外，当作为辅助治疗时，这种治疗可以显著降低凝血因子替代的频率，这对一些患者(25-30%)来说是有问题的，因为刺激免疫系统[59]会产生抑制剂。值得注意的是，虽然血友病基因治疗近年来取得了很大进展，但由于基因治疗所使用的病毒载体[60]预先存在抗体，因此30~50%的患者不适合这种治疗。由于肝毒性，过去因含病原体血浆输注而在35岁血友病患者>中常见的肝脏疾病患者也将不适合接受基因治疗[60]，这强调了开发其他新疗法的必要性。最令人鼓舞的是，新型ZPI/PZ拮抗剂的最新进展现在应该使研究人员能够在血友病小鼠模型中测试这种新疗法。

确认

这项工作的资金由美国国立卫生研究院拨款R37HL39888 (dr。史蒂文·奥尔森和黄欣(合作导演)。我要感谢芝加哥伊利诺伊大学牙周病系的Steven T. Olson博士，他对这项工作进行了有益的讨论，并帮助编辑了手稿。

利益冲突

作者声明与本文内容无利益冲突。

参考文献

1. 韩晓霞，陈建军，陈建军(1998).蛋白z依赖性血浆蛋白酶抑制剂的分离。《美国国家科学院学报》95:9250-9255。
2. 韩旭，黄志峰，Fiehler R, Broze GJ(1999)蛋白z依赖性蛋白酶抑制剂是一种蛇形蛋白。生物化学38: 11073 - 11078。
3. Broze GJ, Miletich JP(1984)人类蛋白质。临床研究杂志73: 933 - 938。
4. 李建军，李建军，李建军，等。(2013)血友病A型患者血浆蛋白Z及蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂的检测。血栓形成的研究131: e110-e113。
5. 杨建平，杨建平，杨建平(1987)人血浆蛋白Z抗原:正常受试者血浆蛋白Z抗原的范围和华法林治疗的效果。血69: 1580 - 1586。
6. 陈建军，陈建军，陈建军，等(2001)蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂与蛋白Z复合物在血浆中的循环。血栓和止血85: 655 - 660。
7. 张建军，张建军，张建军，等。(2005)蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂的研究进展。静脉血栓形成水平和风险的决定因素。血栓和止血93: 411 - 413。
8. 张建军，张建军，张建军，等(2007)蛋白Z/Z依赖性蛋白酶抑制剂(PZ/ZPI)的抗凝血系统与血栓形成。英国血液学杂志137: 99 - 108。
9. 黄晓东，王晓东，王晓东，王晓东(2008)蛋白z依赖性蛋白酶抑制剂与血凝因子Xa反应的动力学表征。生物化学杂志283: 29770 - 297783。
10. 尹志峰，黄志峰，崔健，Fiehler R, Lasky N等。(2000)蛋白Z缺乏的血栓形成前表型。《美国国家科学院学报》97:6734-6738。
11. 张杰，涂颖，陆玲，Lasky N, bronze GJ等。(2008)蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂缺乏比蛋白Z缺乏产生更严重的小鼠表型。血111: 4973 - 4978。
12. Kemkes-Matthes B, Nees M, Kuhnel G, Matzdorff A, Matthes KJ等。(2002)蛋白Z对因子V Leiden患者血栓形成前表型的影响。血栓形成的研究106: 183 - 185。
13. 李建军，李建军，李建军，等(2005)Leiden基因突变患者的R255h氨基酸替代分析。[J]128: 248 - 252。
14. 黄鑫，Swanson R, Kroh HK, Bock PE(2019)蛋白z依赖性蛋白酶抑制剂(ZPI)是一种具有生理意义的凝血酶原功能抑制剂。生物化学杂志294: 7644 - 7657。
15. Shapiro AD, Angchaisuksiri P, Astermark J, Benson G, Castaman G，等。(2019)皮下concizumab预防血友病A和血友病A/B: 2期试验结果。血。
16. 顾建明，赵小燕，Schwarz T, schuhacher J, Baumann A，等。(2017)食蟹猴组织因子途径抑制中和抗体(BAY 1093884)的药效学和药动学关系的机制建模。美国儿科学会期刊19日:1186 - 1195。
17. Sehgal A, Barros S, Ivanciu L, Cooley B, Qin J，等。(2015)一种靶向抗凝血酶的RNAi治疗对血友病患者凝血系统的再平衡和促进止血作用。自然医学21日:492 - 497。
18. Polderdijk SG, Adams TE, Ivanciu L, Camire RM, Baglin TP等。(2017)用于治疗血友病的apc特异性serpin的设计和表征。血129: 105 - 113。
19. Rezaie AR, Manithody C, Yang L(2005)与蛋白z依赖性蛋白酶抑制剂相互作用的关键因子Xa残基的鉴定:活性位点和外源位点相互作用都需要抑制。生物化学杂志280: 32722 - 32728。
20. 黄欣，Dementiev A, Olson ST, Gettins PG (2010) serpin蛋白z依赖性蛋白酶抑制剂(ZPI)作为膜相关因子Xa抑制剂的特异性和激活基础。生物化学杂志285: 20399 - 20409。
21. 韩晓霞，陈建军，陈建军(2000)蛋白z依赖性蛋白酶抑制剂的研究。血96: 3049 - 3055。
22. Rezaie AR(2001)凝血酶原保护凝血酶原复合体中的Xa因子免受肝素-抗凝血酶复合体的抑制。血97: 2308 - 2313。
23. Wood JP, Petersen HH, Yu B, Wu X, Hilden I等。(2017)TFPIalpha与FVa和FXa相互作用抑制凝血起始过程中的凝血酶原。血液的进步1: 2692 - 2702。
24. 李建军，李建军，李建军，等。(2012)蛋白Z/蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂系统在非小细胞肺癌组织中的应用。血栓形成的研究129: e92-e96。
25. Ferrigno D, bucheri G, Ricca I(2001)肺癌凝血试验的预后意义。欧洲呼吸杂志17: 667 - 73。
26. 李维M(2014)癌症相关凝血病。血栓形成的研究2: S70-S75。
27. 崔健，Eitzman DT, Westrick RJ, Christie PD，徐志军等。(2000)携带因子V Leiden突变小鼠的自发性血栓形成。血96: 4222 - 4226。
28. Hille ET, Westendorp RG, Vandenbroucke JP, Rosendaal FR (1997) Leiden因子V突变(活化蛋白C抗性)家庭的死亡率和死亡原因。血89: 1963 - 1967。
29. Sofi F, Cesari F, Abbate R, Gensini GF, bronze G，等。(2010)低Z蛋白水平对血管血栓相关疾病潜在风险的meta分析。血栓和止血103: 749 - 756。
30. Martinelli I, Razzari C, Biguzzi E, buciarelli P, Mannucci PM(2005)低蛋白Z水平与静脉血栓栓塞的风险。血栓与止血杂志:j3: 2817 - 2819。
31. Kurnik K, Kreuz W, Horneff S, During C, Schobess R等。(2007)因子V G1691A突变和因子II G20210A变异对儿童严重血友病A临床表达的影响——一项多中心研究的结果。Haematologica92: 982 - 9875。
32. Shetty S, Vora S, Kulkarni B, Mota L, Vijapurkar M，等。(2007)天然抗凝血和纤溶因子对血友病患者临床严重程度的调节作用。英国血液学杂志138: 541 - 544。
33. Ghosh K, Shetty S, Mohanty D(2001)用一期测定法测定血友病A伴严重因子VIII缺乏的轻度临床表现。血友病7: 9 - 12。
34. van Dijk K, van der Bom JG, Fischer K, Grobbee DE(2004)血栓形成因子是否影响严重血友病的临床表型?文献综述。血栓和止血92: 305 - 310。
35. Franchini M, Lippi G (2010) Factor V Leiden与血友病。血栓形成的研究125: 119 - 23所示。
36. van 't Veer C, Golden NJ, Kalafatis M, Simioni P, Bertina RM，等(1997)血友病A与因子V联合的体外分析(LEIDEN)。血90: 3067 - 3072。
37. Bos MH, Meijerman DW, van der Zwaan C, Mertens K(2005)活化的蛋白C抵抗因子V是否有助于血友病血浆凝血酶的生成?血栓与止血杂志3: 522 - 530。
38. Schlachterman A, Schuettrumpf J，刘建华，Furlan freia C，等。(2005)因子V Leiden改善血友病模型小鼠体内止血功能。血栓与止血杂志3: 2730 - 2737。
39. 黄鑫(2019)设计一种蛋白z依赖性蛋白酶抑制剂(ZPI)突变体作为治疗血友病的新型ZPI抗凝功能拮抗剂。血栓与止血杂志17: 1655 - 1660。
40. 张建军，张建军，张建军，等(2019)血友病A型血友病患者血凝功能的研究进展。血栓与止血杂志17: 149 - 156。
41. Srivastava A, Brewer AK, Mauser-Bunschoten EP, Key NS, Kitchen S等。(2013)血友病管理指南。血友病19: e1-47。
42. 魏志，闫勇，Carrell RW，周安(2009)蛋白Z依赖抑制剂复合物的晶体结构揭示了蛋白Z在膜抑制因子X中的辅助因子作用。血114: 3662 -3667。
43. 黄鑫，周军，周安，Olson ST(2015)蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂(ZPI)-蛋白Z相互作用的热力学和动力学表征揭示了ZPI Lys-239的意想不到的作用。生物化学杂志290: 9906 - 9918。
44. 黄霞，闫燕，涂勇，Gatti J, bronze GJ等。(2012)蛋白Z催化活化蛋白Z依赖性蛋白酶抑制剂(ZPI)的结构基础。血120: 1726 - 1733。
45. 王晓明，王晓明，王晓明(2013)一种新型抗凝血蛋白的克隆及其在生殖生物学中的应用。繁殖146: R73-R80。
46. Beerli RR, Bauer M, Fritzer A, Rosen LB, Buser RB等。(2014)挖掘人类自身抗体库:从胸腺瘤患者中分离有效的il17a中和单克隆抗体。马伯6: 1608 - 1620。
47. Mosnier LO, Zlokovic BV, Griffin JH(2007)细胞保护蛋白C通路。血109: 3161 - 3172。
48. 李建军，李建平，李建平，等(2016)抗凝血酶的抗炎作用及临床应用。血栓和止血115: 712 - 728。
49. 陈晓明，陈晓明，陈晓明，等。(2002)炎症因子对蛋白Z生物合成的弱调控。血栓和止血87: 350 - 351。
50. 黄志峰，Higuchi D, Lasky N, Broze GJ(1997)组织因子途径抑制基因破坏对小鼠宫内死亡的影响。血90: 944 - 951。
51. Ishiguro K, Kojima T, Kadomatsu K, Nakayama Y, Takagi A等。(2000)小鼠完全抗凝血酶缺乏导致胚胎死亡。临床研究杂志106: 873 - 878。
52. 陈建军，陈建军，陈建军，等。(1998)抗凝血蛋白C基因失活导致小鼠围产期消耗性凝血病的发生。临床研究杂志102: 1481 - 1488。
53. Maroney SA, Cooley BC, Ferrel JP, Bonesho CE, Nielsen LV等(2012)造血组织因子途径抑制剂缺失减轻血友病小鼠出血。《美国国家科学院学报》109:3927-3931。
54. Bolliger D, Szlam F, Suzuki N, Matsushita T, Tanaka KA等。(2010)杂合子抗凝血酶缺乏症改善因子viii缺陷小鼠的体内止血作用。血栓和止血103: 1233 - 1338。
55. Gupta A, Patibandla S(2019)蛋白C缺乏症。StatPearls。金银岛(FL)， 2019。
56. Bravo-Perez C, Vicente V, Corral J(2019)抗凝血酶缺乏症的管理:临床医生的最新进展。血液学专家评论12: 397 - 405。
57. de Serres F, Blanco I (2014) α -1抗胰蛋白酶在人类健康和疾病中的作用。内科学杂志276: 311 - 335。
58. Bolton-Maggs PH, Pasi KJ(2003)血友病A和B。《柳叶刀》361: 1801 - 1809。
59. Ragni MV(2015)靶向抗凝血酶治疗血友病。新英格兰医学杂志373: 389 - 391。
60. George LA(2017)血友病基因治疗成熟。血液的进步1: 2591 - 2599。