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摘要

目的:本研究的目的是评估大鼠完全胆外展过程中小脑浦肯野细胞的结构和代谢变化。

方法:实验以体重200±25 g的雄性Wistar大鼠为实验对象。60只大鼠造胆总管瘘管，将肝脏分泌的胆汁全部通过塑料管收集到外置的玻璃胆汁容器中。对照组60只进行假手术(不取胆)。1号^th3^th，和5^th术后d，取对照组和实验组动物头颅，采集小脑皮层标本进行组织学、组织化学和电镜观察。

结果:胆汁的流失导致浦肯野细胞的结构和代谢异常逐渐增加，导致严重的、不可逆的紊乱，甚至一些细胞死亡。浦肯野细胞逐渐缩小，球形和伸长减少，细胞核和细胞器(线粒体、内质网、高尔基复合体和溶酶体)发生深刻变化，随后琥珀酸-、NADH-、葡萄糖-6-磷酸-、NADPhH脱氢酶受到抑制，乳酸脱氢酶和溶酶体酸性磷酸酶标记酶被激活。这些变化反映了体内胆汁缺失情况下受损神经元的损伤和适应过程的比例。

结论:胆汁总流失(1^圣3^{理查德·道金斯}，和5^th(d)诱导小脑浦肯野细胞结构和代谢紊乱逐渐增加，并导致部分细胞死亡。

关键字

小脑，浦肯野细胞，结构，细胞化学，胆汁丢失。

介绍

胆汁是一种重要的生物液体，由肝脏分泌，流经胆总管进入十二指肠。胆汁含有胆汁酸、磷脂、胆固醇、胆红素、蛋白质、水和盐。初级BAs由肝脏中的胆固醇合成，与甘氨酸或牛磺酸结合以增加其溶解度，分泌到胆汁中，禁食时在胆囊中浓缩，并根据饮食脂肪在肠道中排出，并在结肠中由肠道微生物群生物转化为次级BAs，在回肠和结肠中重新吸收回到肝脏。肠道内的BAs不仅调节胆固醇、甘油三酯和脂溶性维生素的消化和吸收，还通过激活肝、肠、肌肉和棕色脂肪组织中的法内脂素X和g蛋白偶联胆汁酸受体-1，作为信号分子在调节上皮细胞增殖、基因表达和脂糖代谢中发挥关键作用[1]。BAs受体在内皮细胞中表达，可能对体循环和门静脉循环都有重要影响[2]。BAs，几十年来被认为只在肠腔中具有脂肪乳化功能，最近作为一种新的心脏代谢调节剂出现。它们通过各种器官和组织中的多个细胞内受体起作用，具有真正的内分泌作用。BA通过调节糖脂代谢影响能量稳态，主要通过激活核法内酯X受体(FXR)以及胞质膜G蛋白偶联BA受体TGR5在多种组织中发挥作用。BA在糖尿病、肥胖、代谢综合征和心血管疾病的发病机制中的作用正在受到重视，BA及其衍生物似乎代表了治疗这些文明疾病的新的潜在疗法[3]。

由胆结石或恶性肿瘤引起的梗阻性(机械性)黄疸可阻止胆汁的正常流出，并不可避免地诱发进展中的高胆红素血症，其后果是有害的[4]。它需要手术治疗，然后进行外胆道引流。早期适当的胆管减压可减少术后并发症，但会导致胆汁外露[5]。胆汁的长期流失可引起脂质消化障碍、凝血障碍等维生素A、B、D、E、K缺乏的症状，引起钙代谢紊乱并伴有骨代谢失调，血液酸碱平衡紊乱，肝、肾、神经系统功能紊乱[6-8]。在我们之前的研究中，我们发现大鼠进行3-5天的胆道外引流(胆汁完全流失)会引起脑组胺能神经元[9]以及大脑顶叶皮层神经元[10]的严重结构和代谢紊乱。本论文的目的是估计小脑的组织学变化，特别是在其浦肯野细胞，在类似设置的胆汁损失的大鼠。

材料与方法

动物，实验设计和化学品

实验选用体重200±25 g的雄性Wistar大鼠120只。大鼠被安置在室内，可以自由获得标准的实验室食物，并保持在受控的环境条件下。所有实验程序均符合欧洲共同体理事会指令(86/609/EEC)对实验动物的护理和使用。这项研究得到了格罗德诺国立医科大学生物医学伦理委员会的批准。

60只大鼠将胆总管近端(肝小叶管汇合处以下3 ~ 5mm)切开结扎，将肝脏分泌的胆汁全部通过聚乙烯导管收集到外侧玻璃胆汁容器中(图1)，将容器固定在大鼠体右侧皮肤上。对照组60只进行假手术(不取胆)。1号^th3^th，和5^th术后d，对照组和实验组分别用乙醚麻醉并斩首。采集小脑标本，按6:3:1的比例固定在酒精、氯仿和乙酸的混合物中，然后用酒精和二甲苯处理，包埋石蜡。其他小脑皮质块冷冻保存在液氮中进行进一步的组织化学处理;其他小块的小脑皮层在5^th术后数日迅速取下，固定于1% OsO₄脱水后包埋于环氧树脂中，用于电子显微镜。

所有化学物质均来自Sigma-Aldrich(美国)。

图1所示。胆总管造瘘的手术方案。

组织学

7 μm石蜡小脑皮层矢状面切片用苏木精、伊红、0.1%的硫氨酸溶液(尼氏法)染色，评估神经元的一般细胞学和死亡神经元的鉴定[11]。使用Axioskop 2 plus显微镜和数码相机Axiocam MRc5(卡尔蔡司，德国)进行组织学检查、显微摄影和形态测定。在尼氏法染色的制剂中，根据其细胞质嗜色性的强度和细胞体形状，估计小脑浦肯野细胞在皮层回1µm间隔内的总数，以及正常和病理类型神经元的数量:正色(正常，中等染色)、高色(强烈染色)、高色萎缩、低色(苍白染色)和阴影细胞(死亡神经元的非常苍白的残留物)。

使用计算机图像分析软件image Warp (Bit Flow, USA)对尼氏法染色的石蜡矢状切片上的浦肯野细胞进行形态测定和细胞光度测定。为了估计神经元体的大小和形状，在计算机显示器上用鼠标光标勾画出多达30个神经元体的图像。最大和最小直径(D)，周长(P)，平方(S)，以及形状系数(4πS/P)²计算了拉伸系数(最大D/最小D -球度参数)和拉伸系数(最大D/最小D -球度参数)。

组织化学

采用冷冻恒温器(Leica CM 1840，德国)制备10µm冷冻小脑矢状面切片。测定了琥珀酸脱氢酶(SDH, EC 1.3.99.1)、乳酸脱氢酶(LDH, EC 1.1.1.27)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH, EC 1.1.1.49)、NADH脱氢酶(NADPhDH, EC 1.6.1.1)等氧化酶的活性以及溶酶体酸性磷酸酶标记酶(AP, EC 1.4.3.4)的活性[12]。对于酶组织化学，将冷冻切片放入相应的孵育培养基中，包括缓冲液、底物、辅助因子(如有必要)和显色剂，孵育30分钟至5小时，以观察酶活性的位置，然后洗涤并包埋在合适的塑料培养基中。石蜡切片采用Einarsson法检测浦肯野细胞细胞质中RNA的含量[12]。通过组织化学反应中获得的色素光密度测定神经元细胞质中组织化学反应的酶活性或产物。每个实验组估计有150-200个神经元。

电子显微镜

MT-7000超微组(RMC, USA)用于制备电子显微镜切片。将它们与醋酸铀酰和柠檬酸铅进行对比，并在白俄罗斯国家科学院生理学研究所电子显微镜中心使用电子显微镜(JEM 100CX II，日本)进行检查。

统计数据

使用STATISTICA 10 (StatSoft, Inc.， USA)软件对每只动物的平均值进行非参数统计处理(因为组中动物数量较少)。在描述性统计中，确定中位数(Me)和四分位间距(IQR)的值。p<0.05 (Mann-Whitney u检验)认为差异显著，因为它不是正态分布。

结果

组织学

胆汁丢失1天后，光镜下未见小脑浦肯野细胞结构改变。胆汁丢失3天后，浦肯野细胞的形状变得多种多样:细长，椭圆形或三角形，但不仅仅是梨形。出现深色萎缩和神经元死亡。胆汁丢失5天后，浦肯野细胞的破坏性变化增加。细胞高度伸长，顶端树突延长，染色质溶解，细胞核和细胞质肿胀，细胞核变形和分裂(图2、3)。单个阴影细胞。但是小脑皮层区域的神经元仍然没有改变。

图2。小脑浦肯野细胞。

a组(假手术后5天);

B, C-5天胆汁损失(B-核肿胀，c -核分裂)。尼氏小染色。数字缩微摄影。放大倍率× 1000。比例尺-5µm

图3。小脑浦肯野细胞。a组(假手术后5天);

B-5天的胆汁损失(紫色染色的浦肯野细胞过色萎缩)。Victorov等人染色。数字缩微摄影。放大倍率× 200。比例尺-10µm。

浦肯野细胞的计算结果显示，胆汁丢失第5天，高色变神经元数量增加3.8倍(p=0.009)，高色变萎缩神经元数量增加34.4倍(p=0.009)，黑影细胞数量增加7.5倍(p=0.037)。Victorov法估计的死亡神经元数量增加了28倍(p=0.018)。在胆汁丢失的动力学过程中，浦肯野细胞的大小逐渐减小，它们的伸长和球形度的丧失发生了(图4)。

图4。胆汁丢失动力学中小脑浦肯野细胞大小和形状的变化。m±IQR;*-p<0.05， **-p<0.01。

组织化学

胆汁的丧失导致浦肯野细胞细胞质、线粒体标记酶琥珀酸-和NADH脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和NADH脱氢酶(NADHDH, EC, 1.1.1.49)和NADPhH脱氢酶的活性逐渐降低，乳酸脱氢酶和溶酶体酸性磷酸酶标记酶的活性逐渐降低(图5-9)。

图5。小脑浦肯野细胞琥珀酸脱氢酶活性的研究。

假手术后А-5天数;

B-5天胆汁损失(细胞质染色较低)。根据Nachlas等人染色。数字缩微摄影。放大倍率× 200。比例尺-10µm。

图6。小脑浦肯野细胞琥珀酸脱氢酶活性的研究。

А-controls(假手术后5天);B-5天胆汁损失(细胞质染色较低)。根据Nachlas等人的说法。数字缩微摄影。放大×400。比例尺-10µm。

图7。-小脑浦肯野细胞乳酸脱氢酶活性。

А-controls(假手术后5天);

B-5天胆汁损失(细胞质染色较高)。根据赫斯、斯卡佩里和皮尔斯的说法。数字缩微摄影。放大倍率× 400。比例尺-10µm。

图8。-小脑浦肯野细胞酸性磷酸酶活性。

А-controls(假手术后5天);

B-5天胆汁损失(细胞质染色较高)。

根据Gomori的说法。数字缩微摄影。放大倍率× 200。比例尺-10µm。

图9。胆汁丢失动力学中小脑浦肯野细胞胞浆酶活性和RNA含量的变化。m±IQR;*-p<0.05， **-p<0.01。

电子显微镜

在5号^th我们发现浦肯野细胞有很多超微结构的改变。这些神经元的核膜变得模糊，显示出深深的褶皱;核仁增大，位于细胞核周围;观察到核周空间扩大，大量输出核糖核蛋白颗粒(核糖体亚基)。萎缩神经元细胞质中细胞器数量减少，并发生破坏性改变。粗内质网(RER)池的宽度显著增加(31%)，但其表面减少了38%，核糖体数量减少了3.2倍。核糖体总数仅减少43%，因为游离核糖体的数量略有增加。光滑内质网面积减少33%(图10，表1)。

图10。假手术后5天的小脑浦肯野细胞细胞质(对照，A)或胆汁丢失(B):线粒体肿胀，嵴破坏;g -肥厚型高尔基复合体，池宽;胞浆变性伴自噬体的d位;RER扩展池。电子microphotogram。比例尺-2µm。

表1。胆汁丢失5天后小脑浦肯野细胞的超微参数

参数		控制	胆汁流失
r	膜面积，µm2	4.194±0,342	2.591±0.938 **↓
	蓄水池延伸度，cu	0.764±0.067	1.0±0,333 **↑
核糖体	总量，单位1 μ m2	96.50±6,50	55.0±3,0 **↓
	结合量，单位:1µm2	64.50±4,50	20.0±5,0 **↓
	游离量，以1µms为单位2	32.50±12,50	39.0±5,0
爵士	膜表面面积，1 μ m2	2.710±0.397	1.807±0.678 **↓
	扩展度，单位为cu。	1.183±0,20	1.750±1,0
线粒体	量，1 μ m2	0.071±0.013	0.049±0.011 **↓
	平均面积，µm2	6.0±0.934	3.403±0.743 **↓
	肿胀程度，单位为cu。	1.050±0.233	1.40±0.40 *↑
	嵴表面面积，厘米。	1.027±0.236	0.714±0,333 *↓
	克丽斯塔破碎系数	0.750±0.142	1.0±0,15 *↑
高尔基 复杂的	膜表面面积，1 μ m2	1.50±0,293	3.165±1421 **↑
	蓄水池延伸度，cu	1.0±0.125	1.20±0,550 *↑
溶酶体	量，单位为1 μ m2	4.0±0,50	9.0±1,0 **↑
	平均面积，单位为1 μ m2	1.227±0,701	5.696±0,956 **↑

注:每个数据点为Me±IQR;* p < 0.05;** p < 0.01与对照组比较;cu-conditional单位。

大部分线粒体肿胀，嵴分散，基质苍白。部分外膜被破坏(图9)。线粒体数量减少31%，肿胀程度增加33%。其嵴面积减少了43%，破碎系数增加了33%(表1)。

高尔基复合体的大小增加，它们的蓄水池发生了特定的积累。溶酶体的数量增加了2.3倍，平均面积增加了4.6倍(表1)。通常可以看到细胞质局部变性(包括小颗粒、不规则电子致密团块和雾溶酶体在内的无形结构)(图10B)。

讨论

在我们之前的论文中，在大鼠胆汁丢失后，我们发现大脑组织胺能神经元和顶叶皮层神经元也出现了类似的剧烈结构和代谢紊乱[8,9]。在本研究中，从体内移除胆汁会导致高色素萎缩的浦肯野细胞和阴影细胞数量增加，这似乎对神经元的生存来说太严重了[12]。神经元的体积减小、球形丧失和伸长可能是细胞间液渗透压升高的结果。神经元的收缩是通过Na的激活而发生的⁺- k⁺2氯^{- - - - - -}输运系统或耦合Na⁺/小时⁺иCl^{- - - - - -}/ HCO_3.^{- - - - - -}代谢途径[13,14]。细胞骨架的破坏也会扰乱神经元的形状。

本研究发现，在超微结构水平上，胆汁丧失大鼠小脑浦肯野细胞表现出破坏性和代偿性的适应性变化。线粒体肿胀，嵴密度减小，面积减小。这与光镜下神经元胞质中标记酶琥珀酸酶和nadh脱氢酶活性的降低相对应。核膜折叠的增加、核仁的大小和向核膜的移动、核孔的数量和大小的增加以及核糖体亚基向细胞质的大量输出、游离核糖体的增生和高尔基复合体的肥大可能反映了受影响神经元中合成过程的激活，以补偿受损或丢失的结构并在胆汁丢失后存活。结合核糖体数量和内质网通道的减少表明输出到神经末梢的蛋白质生物合成减少。这会干扰神经元的功能。在所研究的神经元中溶酶体的数量和大小显著增加，并伴有溶酶体标记酶酸性磷酸酶的激活(光镜下)，这可能反映了自噬的增加，以清除受损的微观结构。

细胞膜损伤和神经元结构紊乱的可能原因之一可能是胆固醇的损失，胆固醇被包括在生物膜的组成中，并由其他器官提供给肝脏，以合成生物学上重要的物质——胆汁酸，胆汁酸在胆汁去除过程中丢失。此外，在胆汁损失和胆汁未进入十二指肠的情况下，来自十二指肠的长期传入冲动导致中枢抑制过程。

浦肯野细胞对胆汁的流失非常敏感，但同时也表现出高度的可塑性。看起来神经元的修复过程与破坏过程是并行的。如果后者占主导地位，细胞就会死亡。

结论

胆汁的流失导致浦肯野细胞结构和代谢异常的逐渐增加，导致严重的、不可逆的紊乱(神经元深色萎缩)和一些细胞的死亡。浦肯野细胞的大小逐渐减小，神经元的球性和伸长逐渐减少，细胞核和细胞器(线粒体、内质网、高尔基复合体和溶酶体)发生深度变化，随后发生琥珀酸-、NADH-、葡萄糖-6-磷酸-、NADPhH脱氢酶的激活以及乳酸脱氢酶和溶酶体酸性磷酸酶的标记酶的激活。所有这些变化都反映了体内胆汁缺失情况下神经元损伤和适应过程的比例。

致谢

作者感谢Olga A. Karnyushko提供的技术援助和英文翻译Yanina Razvodovskaya对手稿的修改。

版权所有OAT。版权所有

资金

格罗德诺州立医科大学的试剂和动物补助金。

利益冲突声明

没有宣布。

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