看看最近的文章

摘要

糖尿病与延迟骨愈合和假关节的风险相关。高反应性糖代谢中间衍生物的产生，包括甲基乙二醛(MGO)，以及在慢性持续高血糖下糖基化反应的后续加速与糖尿病并发症有关。吡哆沙明(PM)是维生素B6的一种天然形式，据报道可抑制糖基化，并被认为可有效抑制糖尿病并发症。在目前的研究中，我们检查了PM治疗糖尿病小鼠骨愈合紊乱和mgo诱导的成骨细胞功能障碍的有效性。小鼠多次注射低剂量链脲佐菌素(STZ) (50 mg/kg体重，持续5天)诱导糖尿病。确认明显高血糖后，将钻孔损伤(5.0 mm)引入小鼠股骨，评估PM治疗或不治疗的骨缺损愈合情况。虽然PM治疗对糖尿病状态没有影响，但计算机断层扫描图像显示，损伤后第3天和第10天早期延迟骨愈合明显改善;组织学评价也支持这一结果。在体外细胞实验结果表明，MGO暴露显著抑制MC3T3细胞成骨分化，且呈剂量依赖性，而PM处理可使其恢复。综上所述，水溶性维生素PM可能是治疗糖尿病MGO毒性所致骨损伤的有效候选药物。

关键字

甲乙二醛，糖基化，骨损伤修复，吡哆沙明

简介

糖尿病是一种代谢性疾病，其发病率在世界范围内呈上升趋势。它是心血管疾病、中风、慢性肾病、神经病变、失明和癌症的主要原因，这些疾病与糖尿病患者的发病率和死亡率密切相关。糖尿病也被认为会影响骨强度、骨周转率、矿物密度和结构方面的骨骼健康。延迟骨愈合被认为是长期糖尿病的另一并发症，与延迟愈合、不愈合或假关节的高风险相关[1-3]。糖尿病致残性骨并发症的预防和改善越来越受到重视。

考虑到高血糖的地下机制，已知糖化应激和氧化应激与糖尿病并发症的发生有关，包括成骨细胞分化减少导致的骨愈合延迟、破骨细胞活性增加以及诱导软骨细胞和成骨细胞凋亡[4-7]。糖基化应激是一种压倒性的不利糖基化状态，已被确定为致病因素。糖基化是一种非酶的反应，最终导致生物大分子中糖基化终产物的形成。在高糖条件下糖化应激的特征性增加在活的有机体内由于来自外源性和内源性AGEs的积累和二羰基的产生，导致糖尿病并发症，二羰基是反应性化合物和主要的AGE前体。糖化应激的重要性可以从糖化反应早期产生的具有Amadori重排的糖化血红蛋白(HbA1c)与糖尿病并发症的发生密切相关的事实中得到证明，在临床上被用作约一个月平均血糖水平的替代标记物[8-10]。AGEs和二羰基被认为是促炎和促氧化介质，导致各种生物反应，主要是通过激活AGEs受体。

我们之前报道过糖基化应激和AGEs的积累导致小鼠[11]骨愈合延迟。最活性的二羰基，甲基乙二醛(MGO)，抑制成骨细胞分化[11]。因此，应该抑制MGO的产生，以阐明其对糖尿病患者骨骼问题的有益作用。目前，吡哆沙明(PM)作为一种AGE抑制剂和治疗糖尿病并发症的研究药物受到了广泛关注。PM是维生素B6的三种天然形式之一，与pyridoxal (PL)和pyridoxine (PN)一起，被认为是一种抗糖化剂，通过捕集α-二羰基化合物发挥作用[12-21]。既往研究表明，PM可抑制糖尿病[22]动物模型中AGEs的形成，延缓糖尿病肾病和视网膜病变的发展。在目前的研究中，我们旨在检查PM治疗在提高骨修复能力方面的有效性在活的有机体内使用高血糖糖尿病小鼠，同时恢复mgo诱导的成骨细胞分化紊乱在体外．

材料和方法

细胞培养

小鼠MC3T3细胞(日本筑波理研细胞库)在α-最低必需培养基(5.5 mmol/L葡萄糖;Wako纯化学工业，大阪，日本)，添加10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素在5% CO中₂在37°C的大气中。在MC3T3细胞培养基中加入10 mM β-甘油磷酸、0.1 μM地塞米松和50 μM抗坏血酸诱导成骨细胞分化。在分化培养基中加入0.5 - 2.0 mM MGO (Sigma Aldrich)和0.3 - 3.0 mM吡哆沙胺-二盐酸一水合物(4-氨基甲基-3-羟基-2-甲基-5-羟甲基吡啶盐酸盐，东京化学工业，日本)，每隔一天更换一次培养基。

碱性磷酸酶活性测定

在诱导成骨细胞分化7天后，根据制造商的协议，使用TRACP和ALP检测试剂盒(Takara Bio, Inc.， Otsu, Japan)测定MC3T3细胞中的ALP活性。

实验动物与糖尿病诱导

6周龄雄性C57BL/6J小鼠(体重约21克)购自Charles River Japan, Inc.(日本横滨)。试验开始前预驯化1周。用于糖尿病诱导，链脲佐菌素(STZ;50 mg/kg体重)，每日腹腔注射，连续5天，按照糖尿病并发症动物模型协会(AMDCC)协议。非糖尿病对照组小鼠注射枸橼酸钠缓冲液。PM用1.0 g/L的饮水灌胃。将小鼠分为4个实验组:非糖尿病对照组(CNT)与PM治疗组[CNT+PM (n = 10)或CNT (n = 10)]和糖尿病组(DM)与PM治疗组(DM)+PM (n = 10)或DM (n = 10)]。注射STZ或柠檬酸钠缓冲液3周后，使用从尾静脉获得的全血，用血糖计(Glutest Ace, Sanwa Kagaku, Japan)监测非空腹血糖水平。血糖水平为> 300 mg/dL，诊断为糖尿病。使用DCA Vantage分析仪(Siemens Healthineers, Erlangen, Germany)在尾静脉血中测定早期糖化标记物HbA1c。 Mice were maintained under standard cage conditions (24 °C; 12/12 h light/dark cycle) with sawdust bedding, and access to food (mouse standard chow diet) and water ad libitum. All animal experiments were approved by the Committee on Animal Experimentation of Kanazawa University and performed in accordance with the Fundamental Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiment and Related Activities in Academic Research Institutions under the jurisdiction of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology of Japan.

股骨钻孔损伤诱导

在咪达唑仑(4.0 mg/kg)、美托咪定(0.3 mg/kg)和布托啡诺(5.0 mg/kg)联合麻醉下，在小鼠股骨远端切开一个直纵皮肤切口(5.0 mm)。然后剥去骨膜，劈开内侧大肌，露出股骨表面。在左股骨骨干内侧(膝关节上方5mm处)插入钻头(直径0.9 mm)造成钻孔损伤，如前所述[11]。钻孔穿过侧支皮质骨和骨髓。手术过程中，使用加热垫将体温维持在37°C。

计算机断层扫描(CT)

在麻醉条件下使用x线CT系统(Latheta LCT 200;Hitachi Aloka Medical, Tokyo, Japan)在钻孔损伤后0、3、7、10和14天。使用合适的分析软件(AzeWin;AZE, Ltd.，东京，日本)。根据斜冠状面，保持工作轴平行于骨缺损中心线，对图像进行多平面重建处理。在每个阶段计算骨缺损区域的CT值，如前所述[11]。

组织病理学检查

钻孔损伤后7天，取出左侧股骨，用10%缓冲甲醛溶液固定。固定12小时后，清洗软组织，标本在先前描述的甲酸硝酸钠溶液中脱钙。钻孔标本切片，石蜡包埋。制备5 ~ 7 μm厚的正中矢状连续切片，用苏木精和伊红(H&E)染色。组织切片用光镜放大100倍检查。

统计分析

数据以均数±均数的标准误差表示。四组间测量变量差异采用非重复单因素方差分析(ANOVA)进行分析。使用Tukey的方法进行事后多重比较，以评估组间的差异。p值< 0.05的差异被认为显著。使用SPSS软件(IBM SPSS Statistics Version 22, IBM, Armonk, NY, USA)进行统计分析。

结果

PM治疗对stz诱导的糖尿病小鼠骨缺损修复的影响

为了检验PM治疗糖尿病骨缺损修复的有效性，DM和CNT分别与或不与PM处理(1 g/L)，并在饮用水中给予小鼠。我们首先评估了与糖尿病相关的高血糖状况。结果，与CNT相比，stz诱导的DM观察到明显的糖尿病状态:体重(22±1.4)vs。27±1.7 g)，非空腹血糖水平(531±94.8)vs。132±10.6 mg/dL)，糖化血红蛋白(7.9%±0.99%)vs。3.7%±0.28%)(p< 0.05)。多次低剂量STZ注射(50 mg/kg体重，每天注射5天)后3周，DM组多饮明显，相比之下CNT组(9.3±0.86vs。3.3±0.22 g/天;DMvs。(表1)。PM治疗不影响DM组的糖尿病状态(体重22±1.4 gvs。22±1.7 g;血糖:531±94.8vs。539±63.0 mg/dL;HbA1c: 7.9%±0.99%vs。7.7%±0.36%;进水量9.3±0.86vs。6.6±3.82 g/天;DMvs。DM+PM)(表1)。此外，PM没有改变CNT组的任何指标(表1)。

表1。小鼠糖尿病状态。

＊p与DM或DM+PM相比< 0.05;数据用均数±均数标准误差表示。BW,体重;BG,血糖;国家糖蛋白标准化项目NGSP;问,控制;糖尿病、糖尿病;点,吡哆胺。

进一步，我们研究了小鼠股骨钻孔缺损的骨缺损修复，使用CT扫描进行评估。CT图像显示，与CNT组和DM+PM组相比，DM组钻孔病灶的骨修复延迟(图1A)。定量评估显示，即使在损伤后3天，DM组骨缺损部位CT值明显低于CNT组(图1B)。我们观察到，在所有观察期间(3、7、10和14天)，与CNT组相比，DM组的骨愈合明显受损(图1B)。然而，钻孔损伤后3、7、10天，PM治疗显著改善了DM组的骨愈合(图1B)。此外，DM组个体HbA1c与伤后7天CT值呈负相关(图2)，提示糖化HbA1c水平升高可能与骨愈合延迟和CT值低有关。而PM治疗组(DM+PM)无负相关(图2)。

图1所示。CT扫描对骨缺损修复的评价。(A)左股骨骨损伤后0、3、7、10、14天的CT图像。(B) CT成像的定量评价。纵轴表示骨缺损病变的CT值。无吡哆沙明(PM)治疗的非糖尿病对照组;CNT+PM，非糖尿病对照组PM治疗;无PM治疗的DM、糖尿病组;DM+PM, PM治疗的糖尿病组;胡,hounsfield单位。数据以平均值±SEM表示; n = 10每组。*，p< 0.05;**p< 0.01

图2。骨损伤后3天HbA1c与CT值相关性图无PM治疗的DM、糖尿病组;DM+PM, PM治疗的糖尿病组;n = 10每集团

此外，组织学结果也显示，与损伤后10天恢复期的其他组相比，DM组骨孔缺损未得到修复(图3)。PM处理组(DM+PM)骨孔恢复后充满了新的骨组织，如CNT和CNT+PM组(图3)。

图3。骨损伤后第7天显微观察结果。无PM治疗的非糖尿病对照组为CNT;CNT+PM，非糖尿病对照组PM治疗。他走时污渍。放大,×10

PM处理对mgo诱导体外MC3T3细胞成骨分化恶化的影响

在体外以细胞为基础的试验表明，暴露于MGO以剂量依赖性的方式抑制MC3T3细胞的成骨细胞分化，如ALP活性所示(图4)在体外以细胞为基础的分析来评估PM治疗对成骨细胞分化的有效性，观察到mgo诱导的MC3T3细胞成骨细胞分化恶化有显著改善(图4)。

图4．在体外MC3T3细胞的成骨分化。(A和B)诱导成骨细胞分化后第7天MC3T3细胞碱性磷酸酶(ALP)活性测定。Dif,分化媒体;分别以甲基乙二醛;点,吡哆胺。数据以平均值±SEM表示;n = 6每组。*，p< 0.05

讨论

本研究首次证明了PM治疗对股骨钻孔损伤(1.0 mm)模型糖尿病小鼠骨缺损延迟愈合恢复的有效性(图1和3)。CT和组织学评估显示，DM+PM组骨缺损病变骨化恢复率与CNT组几乎相似(图1和2)。虽然发现PM治疗对降低stz诱导的糖尿病小鼠的血糖或HbA1c水平无显著影响(表1)。个体数据分析显示，与(DM+PM)组相比，HbA1c和平均血糖水平较高的DM小鼠在术后7天钻孔骨缺损部分的CT值较低(图2)，HbA1c和CT值无负相关。PM投加量(饮用水1 g/L;在本研究中使用的约200 mg/kg/天)与我们之前的报告相同，证明它是一个安全剂量(0.42 μM)，使血清中PM浓度在较小的毒性范围内在活的有机体内其临床前疗效已在KK-Ay/Ta和stz诱导的糖尿病大鼠和小鼠的糖尿病肾病中得到证实[17,14]。值得注意的是，在CNT+PM组中，PM治疗并没有加速骨化恢复(图1和3)，这表明PM只能影响骨修复组织中糖尿病和高血糖引起的代谢改变。

在体外MC3T3细胞的实验显示，在细胞培养基中添加MGO降低了ALP活性，ALP是成骨细胞分化和功能最常用的标记物(图4)。然而，PM处理显著改善了mg诱导的MC3T3细胞成骨分化的恶化(图4)。在本实验中，我们使用的MGO浓度相当于我们之前的研究[11]中的浓度0.5到2.0 mM。MGO的浓度在活的有机体内仍有争议，数据在不同的检测方法中有所不同。MGO在活器官和细胞中的实际胞内浓度已被讨论过。此外，PM的浓度用于在体外基于细胞的实验以及MGO剂量仍在讨论中。吡哆辛是维生素B6的一种形式，据报道在1 μM[23]时可导致细胞死亡。相比之下，吡哆醛和PM是无毒的。在以前的临床研究中，没有或很少观察到PM的不良事件。

糖尿病会引起许多并发症。糖尿病相关骨问题的机制被认为是骨髓间充质干细胞不会被招募到糖尿病患者的损伤部位[25]，因此，糖尿病与成骨细胞抑制和破骨细胞促进作用[24]有关。我们之前的研究表明，糖基化应激，包括MGO，可损害成骨细胞分化和延迟骨损伤修复的糖尿病[11]。在这项研究中，PM管理挽救了糖尿病小鼠的骨损伤修复。因此，我们提出，抑制MGO的产生可能是一种潜在的有效策略，以对抗糖尿病中的骨骼问题，而PM可能是MGO解毒的一个强有力的候选者。

PM是维生素B6的衍生物，据报道具有许多生物学效应:(1)通过捕获糖基化反应中包括MGO在内的二羰基中间体来抑制AGE的形成，(2)清除葡萄糖和脂质降解产生的有毒羰基产物，(3)清除活性氧(ROS)[12]。在一项II期临床研究[18]中，口服PM治疗对1型和2型糖尿病肾病患者的肌酐清除和尿转化生长因子b1水平有益处。在动物研究中，PM降低了Zucker糖尿病(ZDSD)大鼠[26]的糖化血清蛋白水平和椎间盘退变过程。最近一项研究表明，长期和短期治疗PM可抑制镰状细胞病小鼠[27]微血管中中性粒细胞和血小板的粘附功能，提示PM具有一种新的生物学作用。

总之，我们的研究结果表明PM治疗可能有助于减少糖尿病相关的糖化应激和改善骨愈合延迟。这是第一篇关于PM在骨损伤中的有益作用的报道，并为糖尿病患者假关节和延迟骨愈合/融合的治疗提供了基础。

确认

我们感谢Y. Niimura的技术援助。该文件由Cactus Communications的一个部门Editage编辑。

资金

我们感谢来自金泽大学SAKIGAKE项目2018、武田科学基金会、科学研究资助基金(16K10896、18K07551、20K07323、19K09593和18K06889)和日本科学促进学会全球人才培养计划的资金支持。

竞争利益声明书

作者声明报告中不存在利益冲突。

参考文献

1. 王晓燕，王晓燕，王晓燕(2010)糖尿病对骨愈合的影响。临床口腔植入物保留区21日:673 - 681。(Crossref)
2. 糖尿病对闭合性骨折愈合的影响。临床矫正相关保留区232: 210 - 216。(Crossref)
3. Folk JW, Starr AJ, Early JS(1999)跟骨骨折手术治疗的早期伤口并发症:190例骨折分析。J .创伤13: 369 - 372。(Crossref)
4. Kayal RA, Siqueira M, Alblowi J, McLean J, Krothapalli N, et al.(2010)骨折愈合过程中TNF α介导糖尿病增强的软骨细胞凋亡，并通过FOXO1刺激软骨细胞凋亡。J骨矿工保留区25日:1604 - 1615。
5. Botushanov NP, Orbetzova MM(2009) 1型和2型糖尿病患者的骨密度与骨折风险。叶形线地中海(普罗夫迪夫)51: 12 - 17。(Crossref)
6. Stolzing A, Sellers D, Llewelyn O, Scutt A(2010)糖尿病诱导大鼠间充质干细胞的变化。细胞组织器官191: 453 - 465。
7. Sheweita SA, Khoshhal KI(2007)骨折中的钙代谢和氧化应激:抗氧化剂的作用。咕咕叫药物金属底座8: 519 - 525。(Crossref)
8. Goldfine AB, Fonseca V, Jablonski KA, Pyle L, Staten MA, et al. (2010) tinsa - t2d(使用水杨酸盐治疗2型糖尿病的炎症)研究团队:水杨酸盐对2型糖尿病患者血糖控制的影响:一项随机试验。安实习生地中海152: 346 - 357。
9. Goldfine AB, Fonseca V, Jablonski KA, Chen YD, Tipton L，等(2013)在2型糖尿病患者中使用水杨酸盐靶向炎症研究团队:水杨酸盐(水杨酸盐):一项随机试验。安实习生地中海159: 1 - 12。(Crossref)
10. Barzilay JI, Jablonski KA, Fonseca V, Shoelson SE, Goldfine AB等人(2014)tinsa - t2d研究联盟:水杨酸盐治疗对2型糖尿病患者晚期糖基化终产物血清水平的影响。糖尿病护理37: 1083 - 1091。
11. 张晓燕，张晓燕，张晓燕，等(2017)甲乙二醛对糖尿病骨损伤延迟愈合的影响。摩尔地中海代表16: 403 - 409。
12. Voziyan PA, Hudson BG(2005)吡哆沙明作为一种多功能药物:靶向致病性糖基化和氧化损伤。细胞分子生命科学62: 1671 - 1681。(Crossref)
13. Degenhardt TP, Alderson NL, Arrington DD, Beattie RJ, Basgen JM，等(2002)吡哆沙明抑制链脲佐菌素糖尿病大鼠早期肾脏疾病和血脂异常。肾脏Int61: 939 - 950。(Crossref)
14. 朱鹏，林红，孙超，林芳，于浩，等。替米沙坦和吡哆沙明对自发性高血压大鼠早期肾损伤的协同作用。摩尔地中海代表5: 655 - 662。
15. Waanders F, van den Berg E, Nagai R, van Veen I, Navis G，等。(2008)AGE抑制剂吡哆沙明对实验性慢性异体肾移植肾病大鼠的肾保护作用。Nephrol拨移植23日:518 - 524。(Crossref)
16. Alderson NL, Chachich ME, Youssef NN, Beattie RJ, Nachtigal M，等(2003)AGE抑制剂吡哆沙明抑制Zucker肥胖大鼠的脂血症和肾脏和血管疾病的发展。肾脏Int63: 2123 - 2133。
17. Tanimoto M, Gohda T, Kaneko S, Hagiwara S, Murakoshi M，等。(2007)晚期糖基化终产物抑制剂吡哆沙明(K 163)对KK A(y)/Ta小鼠2型糖尿病肾病的影响。新陈代谢56: 160 - 167。(Crossref)
18. Williams ME, Bolton WK, Khalifah RG, Degenhardt TP, Schotzinger RJ等(2007)吡多沙明在1型和2型糖尿病合并显性肾病患者联合2期研究中的作用。是J Nephrol27日:605 - 614。(Crossref)
19. Lewis EJ, Greene T, Spitalewiz S, Blumenthal S, Berl T，等(2012)协同研究组:吡啶多林在2型糖尿病肾病中的作用。J Am Soc肾小球23日:131 - 136。(Crossref)
20. Garg S, Syngle A, Vohra K(2013)晚期糖基化终产物抑制剂治疗骨关节炎的疗效和耐受性:一项随机、双盲、安慰剂对照研究。中国J疼痛29日:717 - 724。
21. Nagaraj RH, Sarkar P, Mally A, Biemel KM, Lederer MO，等。(2002)吡哆沙明对糖尿病大鼠蛋白质羰基化学修饰的影响:吡哆沙明和甲基乙二醛反应的主要产物的表征。学生物化学拱Biophys402: 110 - 119。(Crossref)
22. 张晓燕，张晓燕，张晓燕，等(2016)水杨酸盐和吡哆沙明对糖尿病肾病的预防作用。J糖尿病Res2016:1786789。
23. Vrolijk MF, Opperhuizen A, Jansen EHJM, Hageman GJ, Bast A，等(2017)维生素B6悖论:补充高浓度的吡哆辛会导致维生素B6功能下降。Toxicol体外44: 206 - 212。(Crossref)
24. Simpson CM, Calori GM, Giannoudis PV(2010)糖尿病与骨折愈合:糖尿病药物对骨骼的影响。药物管理局专家意见11: 215 - 220。
25. Shin L, Peterson DA(2012)自体干细胞在2型糖尿病模型中的治疗能力受损。J削弱Res87: 1056 - 1069。(Crossref)
26. gleser JD, Ju D, Tawackoli W，杨建华，Salehi K，等。(2020)高级糖基化终末产物抑制剂吡哆沙明减轻2型糖尿病大鼠IVD变性。国际分子科学21日:9709。
27. 李娟，郑淑云，熊斌，曾阿，马洪AB，等。(2020)吡哆沙明对镰状细胞病小鼠血管内细胞-细胞相互作用的干预作用。Haematologica105: 2407 - 2419。(Crossref)