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摘要

在癌症药物的发现中，3D方法已经在过去的几年里被应用于建模复杂的肿瘤结构和肿瘤微环境的异质性成分。皮肤黑色素瘤是一种发病率稳步上升的严重未满足需求的癌症。生物工程技术越来越多地应用于设计黑素瘤特异性模型。在这里，我们总结了如何在三维细胞培养模型中研究黑色素瘤微环境的细胞外和细胞元素。我们回顾了这些模型的好处，并解决了它们的局限性和未来发展的新治疗策略的展望。

简介

据世界卫生组织(世卫组织)称，癌症是全世界第二大死亡原因[1]。尽管黑素瘤在所有皮肤癌病例中占不到5%，但它是最具侵袭性的亚型，占皮肤癌相关死亡病例的80%，而且病例数量正在迅速上升。因此，死亡率和发病率相对较高，全世界每年约有50 000人死亡，特别是由于[3]转移的发生。黑色素瘤是继肺癌和乳腺癌之后第三种最常见的癌症，主要可能转移到大脑[4-6]。事实上，估计有10-40%的黑色素瘤患者会发生脑转移[7]。因此，黑色素瘤脑转移(MBM)患者预后较差，预期总生存期(OS)仅为4个月，[8-10]。

在黑色素瘤中，由于v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源物B (BRAF)(35%-50%的黑色素瘤)和成神经细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)(10%-25%)的点突变，丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路被普遍激活。针对这一途径的努力导致BRAF抑制剂vemurafenib和dabrafenib、丝裂原激活蛋白激酶(MEK)抑制剂曲美替尼和dabrafenib +曲美替尼[11]的联合治疗获得批准。MBM的常规治疗包括多发性转移瘤的全脑放射治疗和有限数量转移瘤的放射手术或放射治疗。尽管发明了新的全身药物，如使用检查点抑制剂免疫治疗，如抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4 (ipilimumab)[13,14]，抗程序性细胞死亡蛋白1 (anti-PD1) (nivolumab和pembrolizumab)[15,16]或[17]联合治疗和靶向治疗(BRAF, MEK抑制剂)[18-21]，但结果仍然很差，急需新的有效的治疗方法。

然而，迄今为止，新型抗肿瘤药物在临床过渡到3期的成功率普遍较低[22-24]。由于临床试验是基于临床前细胞模型和大部分啮齿类动物模型的有效性证据而启动的，显然这些模型需要在未来的药物开发中更具预测性。肿瘤及其周围微环境的细胞异质性，加上由于三维(3D)结构、缺氧和营养梯度造成的机械力，可能会影响潜在疗法的疗效，因此在检查新的抗癌候选药物时，考虑3D模型至关重要。

这篇综述旨在描述当前的3D概念在体外皮肤黑色素瘤模型，比较这些三维模型与二维(2D)模型的关键特征，并讨论当前三维黑色素瘤模型对未来药物发现工作的潜力和挑战。

主要部分

肿瘤微环境:黑色素瘤癌变的关键因素

用2D对人体肿瘤的过度简化在体外模型解释了为什么这些“单分子层”模型不能捕捉细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ECM)相互作用的程度和性质，以及由于人类肿瘤[25]的3D配置而可能发生的营养和氧梯度。在过去的几十年里，癌症研究最初集中在癌细胞和了解它们向肿瘤细胞的转化。然而，近年来研究发现，肿瘤微环境(TME)及其细胞和分子异质性对肿瘤进展、转移形成和向远处组织扩散具有重要影响。

黑色素瘤最初源于黑色素细胞的恶性转化，黑色素细胞是表皮中天然存在的色素细胞，以保护有丝分裂的角质形成细胞免受紫外线照射造成的损伤。黑素细胞起源于神经嵴，然后迁移到表皮。黑素细胞的迁移由与角质形成细胞[26]的细胞间串扰引导。角质形成细胞也参与黑素瘤[27]的进展，它们的存在对于研究细胞在完整肿瘤微环境中对候选药物的反应至关重要。因此，黑色素瘤的微环境不仅由恶性细胞形成，还由与非癌基质细胞的复杂相互作用形成，如角质形成细胞、癌症相关成纤维细胞(CAFs)、浸润免疫细胞、血液/淋巴内皮细胞以及细胞外基质的生化成分，这些都参与了黑色素瘤的形成和生长[28]。

除了高度异质性的癌细胞群外，复杂的基质组织还是各种生长因子和细胞因子的存储库，这些因子和细胞因子可以极大地影响肿瘤生长和药物反应[29-31]。由CAFs分泌的各种生长因子也增强了上皮-间质转化(EMT)和癌症[32]的治疗耐药性。来自黑色素瘤的CAFs也影响角质形成细胞，并诱导vimentin的表达，vimentin是一种参与EMT的细胞骨架蛋白，它只在正常的人类角质形成细胞[33]中弱表达。此外，3D共培养实验表明，CAFs促进黑素瘤细胞的迁移和侵袭性，这种迁移依赖于白细胞介素-6 (IL-6)和白细胞介素-8 (IL-8)的分泌[34]。血管生成和转移可能伴随着肿瘤间质分泌的IL-8，证实了其作为黑素瘤[35]循环生物标志物的预后意义。因此，血清IL-8水平与肿瘤分期[36]相关。与IL-8类似，间质细胞产生的肝细胞生长因子(HGF)增强了黑素瘤的侵袭性，黑素瘤中HGF水平升高伴有化疗耐药[37]。值得注意的是，多种额外的细胞外成分，包括酶，如基质重塑蛋白酶，细胞外泡(EV)，如外泌体[38]，以及EV转移物，包括miRNAs[39]，营养和氧梯度协同参与控制黑色素瘤的进展。

因此，肿瘤微环境中的非癌变细胞可以显著影响黑色素瘤细胞对治疗药物的疗效。例如，在一个带血管化的三维球形模型中，长期使用vemurafenib治疗后，黑色素瘤细胞在有成纤维细胞的球形区域的增殖不太明显，表明微环境对药物反应[40]的影响。因此，对肿瘤微环境的治疗操作必须被认为是一种非常有前途的方法，这在传统的二维细胞培养模型中无法从技术上解决。

黑色素瘤的免疫反应:奖牌的两面

对肿瘤微环境的进一步了解导致了针对免疫反应的创新治疗方法的出现，例如使用检查点抑制剂进行免疫治疗，如抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4 (ipilimumab)[13,14]或抗程序性细胞死亡蛋白1 (anti-PD1) (nivolumab和pembrolizumab)[15,16]。浸润黑色素瘤的免疫细胞中，t淋巴细胞在抗癌免疫中起着核心作用，肿瘤内t细胞的聚集程度是患者对免疫治疗[41]反应的重要预测因子。黑色素瘤中一些常见的肿瘤微环境特征包括作为非肿瘤细胞的肿瘤相关的M2型巨噬细胞(M2 TAMs)和调节性t淋巴细胞(Treg)的存在，它们通过促进黑色素瘤细胞从免疫防御机制中逃逸，成为免疫治疗的靶点[42,43]。肿瘤浸润巨噬细胞产生的不同趋化因子可能有助于将treg招募到肿瘤，并在黑素瘤[43]中维持免疫抑制的肿瘤微环境。由于这两种细胞都具有显著的免疫抑制作用，它们促进皮肤癌变[44,45]。值得注意的是，这种免疫抑制细胞的肿瘤浸润与不良预后有关。

相比之下，其他存在于肿瘤基质中的免疫细胞，如自然杀伤(NK)细胞、m1型巨噬细胞或树突状细胞，已被报道可诱导保护性的抗肿瘤免疫反应[46,47]，这使得免疫反应在黑色素瘤中的作用不明确。例如，NK细胞通过分泌细胞因子和与树突状细胞相互作用，在先天免疫和适应性免疫中发挥重要作用。

总之，恶性黑素瘤的免疫细胞成分对于研究新的治疗方法至关重要，因此必须纳入临床前研究在体外模型出现强制性的。

人类三维黑色素瘤模型的最新进展

和大多数癌症类型一样，黑色素瘤也得到了初步研究在体外在传统的二维细胞培养模型中的确，二维细胞培养具有成本低、重现性高的优点，是一种快速的高通量药物筛选方法[48,49]。然而，虽然二维单层细胞培养可以无限获取营养物质、氧气、代谢物和信号分子，但3D模型可能更接近生理情况在活的有机体内[48-50]，如前所述。此外，当比较同一肿瘤实体的2D和3D癌症模型时，随后发现细胞代谢、增殖、凋亡相关基因、化疗耐药相关基因、癌症干细胞数量和miRNA谱的差异，包括黑素瘤[48,49,51]。

特别是，对黑素细胞和黑素瘤细胞的遗传改变和表型损失在二维单一培养已被描述。早在1987年就观察到二维培养条件支持人类黑素细胞的快速增殖，导致抗原改变(神经生长因子受体、蛋白多糖、转铁蛋白相关M、120,000蛋白等表面抗原的表达)，与恶性黑素瘤[52]相关。此外，在2D培养过程中，在不同的黑色素瘤细胞系中发现了p16/CDKN2肿瘤抑制基因突变，但在原发病变中没有发现原位[53、54]。此外，尽管化疗药物或放疗在2D培养中显示了疗效，但它们的活性可能发生显著变化在活的有机体内，部分受TME影响[55,56]。

为了在临床前药物研发中考虑肿瘤微环境，已经实现了癌症基因工程小鼠模型(GEMM)、人类异种移植小鼠或3D器官共培养。然而，在临床癌症试验中，只有不到8%的动物模型结果是可重复的，值得注意的是，小鼠的皮肤生理和免疫与人类皮肤有显著不同。小鼠皮肤中的黑色素细胞大多位于毛囊中，决定皮毛的颜色，而人类的黑色素细胞主要位于表皮的基底层，在那里它们对紫外线做出反应，产生黑色素并将其转移到角质形成细胞[58,59]。因此，基于小鼠与人类皮肤解剖和生理的显著差异，小鼠模型仅限于研究黑色素瘤的一般进展，特别是肿瘤微环境的特定作用。

因此，在三维条件下实现三维模型研究黑色素瘤及其环境的研究得到了长足的发展。图1描述了三维黑色素瘤模型的最新进展，并按时间顺序列出了表1中的附加信息。

图1:皮肤黑色素瘤三维模型发展的选定里程碑的时间轴。所选里程碑的详细信息列于表1

表1:皮肤黑色素瘤三维模型发展的选定里程碑。图1中的时间轴描述了蓝色高亮显示的表行。ECM代表细胞外基质

一年	里程碑	细胞类型	ECM /支架	参考
1967	在细胞培养中建立第一个人黑色素瘤细胞系(单层)	患者源性黑色素瘤细胞系(LeCa 19.4, LeCa 26.5, MeGo)	-	[60]
1973	第一个三维黑素瘤球体(小鼠细胞)的研制	小鼠B-16黑色素瘤细胞	软琼脂	[61]
1973	第一个悬浮培养人黑色素瘤细胞系的建立	患者源性黑色素瘤细胞系(A-375, A-875)	-	[62]
1975	人角质形成细胞培养的建立	原代人角质形成细胞与致死辐照3T3细胞共培养	-	[63]
1981	第一的发展在体外全层皮肤模型(大鼠细胞)	原代大鼠成纤维细胞与表皮细胞共培养(大鼠)	胶原晶格	[64]
1984	第一个人类黑色素瘤球状体的开发(直接从患者材料中生长)	Patient-derived黑色素瘤细胞	琼脂覆盖瓶	[65]
2000	人体三维全厚度黑色素瘤模型的建立	原代人角质形成细胞、成纤维细胞、转移性黑色素瘤细胞系(HBL)	DED的自然ECM	[66]
2000	利用RGP、VGP或转移性黑素瘤细胞系的黑素瘤细胞建立三维全厚度黑素瘤模型，研究黑素瘤早期转移	原代人角质形成细胞，来自RGP (PM-WK)， VGP (RPM-EP)的黑色素瘤细胞系，或转移细胞系(MM-AN, MM-RU) 没有成纤维细胞	DED的自然ECM	[67]
2000	第一个完全基于细胞的人体三维全厚度黑色素瘤模型的开发	原代人角质形成细胞、成纤维细胞、来自RGP (WM35)、VGP (WM793)、转移性黑色素瘤细胞系(WM852)的黑色素瘤细胞系(WM35)	胶原蛋白	[68]
2005	从已建立的黑素瘤细胞系的球形亚群中分离多能干细胞群	建立人原代黑色素瘤细胞系(WM115)和转移性黑色素瘤细胞系(WM239A)	N/A	[69]
2013	完全基于细胞的人体三维全厚度微血管化黑色素瘤模型的开发:转移性黑色素瘤细胞系的整合诱导内皮细胞的促血管生成作用，并导致更分支的微血管网络	原代人角质形成细胞和成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，原代黑色素瘤细胞系(A375, SK MEL 28)，转移性黑色素瘤细胞(Malme3, RPMI7951)	纸锚	[70]
2013	完全基于细胞的人体全层皮肤黑色素瘤球形模型的开发	原代人成纤维细胞，角质形成细胞和肿瘤球状体(451-LU细胞系，MM)。	I型胶原蛋白(鼠尾)	[56]
2015	刺激成纤维细胞产生自身ECM成分(胶原III、IV和VII)的人三维全层黑色素瘤侵袭模型的建立	原代人成纤维细胞、角质形成细胞、原代人黑色素瘤细胞系(WM35)或转移性黑色素瘤细胞系(SK-MEL-28)	Alvetex脚手架	[71]
2016	建立受伤和发炎的人黑色素瘤三维模型，研究消炎药对黑色素瘤侵袭的作用	原代人成纤维细胞，角质形成细胞，转移性黑色素瘤细胞系(HBL, A375-SM, C8161)	DED的自然ECM	[72]
2017	研究黑素瘤随时间和侵袭深度的人体三维黑素瘤模型的建立	来自早期RGP (WM35)或转移性黑素瘤细胞(SK-MEL-28)的原代人成纤维细胞、角质形成细胞和黑素瘤细胞系	DED的自然ECM	[73]
2018	第一个含有血液和淋巴毛细血管的三维黑色素瘤模型的开发	人成纤维细胞，角质形成细胞，人微血管内皮细胞(HMVEC (LEC & BEC pos.))，黑素瘤球状物(A375, Malme 3m, SK-MEL 28, RPMI 7951, WM983A，或WM983B)	纸锚	[40]
2019	从患者自身肿瘤中构建三维淋巴结/黑色素瘤免疫增强器官(可能允许研究个性化免疫治疗)	患者淋巴结+黑色素瘤组织被粉碎消化以获得细胞。所有细胞(未分选)被植入ECM模拟胶原基水凝胶中	HA/胶原蛋白基水凝胶体系	[74]
2019	研究黑色素瘤中年轻人与老年人微环境的三维免疫增强黑色素瘤模型的建立	人角质形成细胞，年轻和年老的成纤维细胞，黑色素瘤细胞系(1205lu, WM3918)， t细胞	胶原蛋白	[75]

第一个肿瘤三维球体模型在1970/71年生成[77,77]，3年后的1973年，Folkman和Hochberg[61]描述了第一个黑色素瘤三维球体模型。第一个三维黑色素瘤模型是基于小鼠黑色素瘤细胞系(B16)。1981年，初审在体外全层皮肤模型采用大鼠成纤维细胞植入胶原蛋白晶格中，并点缀内皮细胞[64]。1984年，从人类肿瘤材料中直接生成的黑素瘤球状体已被描述[65]。最后，在2000年，几个研究小组开发了不同的方法来制作人性化的三维全厚度黑色素瘤模型[66-68,78]。虽然他们大多数使用人去表皮真皮层(DED)(从裂厚皮肤移植物或皮肤库中分离的皮肤)作为真皮层，但在顶部播种黑素瘤细胞、角质形成细胞和/或成纤维细胞[66,67,78]，Meier说et al。开发了第一个完全基于细胞的人体三维全层黑色素瘤模型，使用成纤维细胞和胶原蛋白形成真皮基础，最后在顶部添加黑色素瘤细胞和角质形成细胞[68]。2013年开发了第一个完全基于细胞的、集成内皮细胞、不以DED为真皮基础的人体三维全层黑色素瘤模型[70]。此外，2013年，Vörsmannet al。发明了一种基于完整的黑素瘤球状体而不是单个黑素瘤细胞[56]的人体三维全层细胞黑素瘤模型。

值得注意的是，到目前为止，从大鼠尾巴或牛身上提取的ECM的主要成分成纤维细胞胶原I在大多数细胞基础模型中被实现形成真皮层。第一个没有动物胶原蛋白的三维全厚度黑色素瘤模型是在2013年由Gibot公司描述的et al。[70] 2015年希尔et al。证明了他们的模型可以产生自身的ECM成分(胶原III、IV和VII)[71]。第一个也是迄今为止唯一描述的基于细胞的人体全层皮肤黑素瘤球形模型已于2018年发表[40]。在该模型中，成纤维细胞被播种到周围的纸锚上形成薄片，并与进一步单独制备的薄片堆叠在一起，包括人微血管内皮细胞(HMVEC)和成纤维细胞或黑色素瘤球形细胞和角化细胞[40]。

此外，开发免疫增强的三维黑色素瘤模型的第一个方法已经启动。例如，最近报道了一种将t细胞集成到黑素瘤球状体中的人体三维免疫增强黑素瘤模型，用于研究黑素瘤中的年轻和老年微环境[75]。此外,Votanopouloset al。完成了来自患者自身肿瘤的三维淋巴结/黑色素瘤免疫增强器官，从而几乎精确地重建了在活的有机体内这可能使个性化免疫疗法的研究成为可能[74]。重要的是，对于健康皮肤，首先是具有免疫功能的3D全层皮肤模型，其中集成了Mutz-3、CD34⁺或CD4⁺t细胞已经被开发出来[79,80]，但还没有关于黑色素瘤的这种模型的描述。

研究人三维全层黑色素瘤模型的侵袭和转移

从患者的临床和组织病理学观察，黑色素瘤的进展分为不同的阶段。在初期，黑素细胞异常增生导致良性痣的形成，这是最早的黑素细胞病变。进一步的异常生长和发育不良导致径向生长期(RGP)，这是由表皮内增殖定义的。这个阶段之后是垂直生长阶段(VGP)，细胞开始垂直生长并侵入真皮层和皮下组织，最后导致转移到远处的器官，特别是大脑[81,82]。因此，黑色素瘤侵袭和转移等进展事件是复杂的多步骤事件，无法在二维检测中进行研究。

人类第一个三维全厚度黑色素瘤侵袭模型是在20年前建立的。这些模型表明，健康的黑色素细胞保留在表皮-真皮连接处[66]。此外，来自RGP的原代黑色素瘤细胞和黑色素瘤细胞不能侵入真皮，但来自VGP的不同细胞系以及转移性黑色素瘤细胞系能够穿过基膜并溶解原生ECM成分(胶原IV和胶原VII)[66-68,78]。重要的是，转移性黑色素瘤细胞只有在角质形成细胞和成纤维细胞存在的情况下才能穿过基膜[66,83]，这强调了肿瘤间质内细胞-细胞通讯对黑色素瘤侵袭的影响。此外，黑色素瘤细胞通过基底膜的侵袭依赖于角质形成细胞分泌基质金属蛋白酶9，在被黑色素瘤细胞激活后，基质金属蛋白酶9开始切割ECM的IV型胶原[84,85]。值得注意的是，成纤维细胞和角化细胞的侵袭潜能以及对黑色素瘤侵袭的影响因细胞系而异[73,84]。

黑素瘤细胞在侵入真皮层后，为了与原发肿瘤分离并迁移到周围组织和远处部位，需要改变其细胞骨架组织，并与周围细胞和ECM通信[86,87]。特别是，循环的肿瘤细胞粘附在微血管上并穿过内皮细胞层移动到远处的器官，毛细血管网络是必不可少的[88,89]。在此基础上，关于黑色素瘤TME和血管化的研究得到了进展。第一个用于研究黑色素瘤细胞促血管生成和促淋巴生成影响的三维全厚度黑色素瘤模型最近才被描述出来。Gibot的研究et al。转移性黑色素瘤细胞系产生高水平的血管内皮生长因子(VEGF)，导致内皮细胞的促血管生成作用，导致更复杂、分枝和致密的微血管网络在体外．这些结果可以被Bourland证实等他开发了第一个包括血液和淋巴毛细血管的人体三维全厚度黑色素瘤球形模型。肿瘤球状体在重建皮肤中分泌促淋巴管生成(VEGF-C)和促血管生成(VEGF-A)因子以及cc趋化因子配体21 (CCL21)和血管生成素-2 (ANG-2)。此外，由于重建皮肤的肿瘤周围细胞(成纤维细胞和角化细胞)产生了类似数量的VEGF-C，这表明血管生成和淋巴管生成可能不仅受肿瘤细胞的调节，也受周围细胞[40]的调节。

总之，一些细胞系与RGP或VGP或转移的晚期有关[90]，但从径向生长期到垂直浸润转移的侵袭过程和进展仍不完全清楚，需要进一步的研究。

尽管如此，很明显，肿瘤微环境、细胞-细胞以及细胞- ecm通信是黑色素瘤侵袭和转移的主要贡献者。因此，了解和建模肿瘤微环境可能是必要的治疗干预转移性黑色素瘤。

结论

很明显，单分子培养不能充分概括药物测试所需的肿瘤生物学，而考虑到肿瘤微环境的关键作用，人类皮肤的3D模型是研究黑色素瘤更合适的模型。在过去的40年里，三维黑色素瘤模型已经变得越来越复杂，从单一培养发展到共培养，最后发展到血管化和部分免疫全层皮肤模型。虽然各种模型使用的是重建皮肤，但大多数都是基于富含成纤维细胞和角质形成细胞的外源性生物材料。相比之下，最近基于人成纤维细胞分泌的细胞外基质的3D模型，通过添加人血液和淋巴管[40]，有潜力模拟肿瘤侵袭。这样的模型可能会重建一个更完整的微环境，以研究候选药物的作用及其对肿瘤细胞外渗的潜在影响，肿瘤细胞外渗是转移的关键步骤，也是黑色素瘤的标志。

然而，针对创新的临床前药物发现的具体需求，3D模型将不得不在鲁棒性和小型化与对患者的预测性之间取得平衡。特别是，适应稳健的中通量或高通量化合物测试在技术上仍然具有挑战性。此外，重要的是要考虑使用来自患者的原代肿瘤细胞，而不是永久的黑色素瘤细胞系，以表征和识别候选药物，并选择个性化药物的治疗方法。总之，尽管存在挑战，但在生理上是相关的在体外根据Russell和Burch[91]的3r原则，通过模拟人类，3D模型可能有潜力部分取代动物试验在活的有机体内类似肿瘤微环境，可能会改善未来肿瘤药物发现的临床转译。

资金来源

这项工作还没有得到资助。

的利益冲突

不存在利益冲突。

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