看看最近的文章

蛋白印迹

Western blot程序之前已经描述过[2-4,12-17]。使用全细胞提取物进行Western blot，在8-10%SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含有0.1%吐温20（TBS-T）的Tris缓冲盐水（TBS）溶液封闭膜5%非脂肪干牛奶。然后在5%牛血清白蛋白-TBS-T中1:2000稀释一级抗体的情况下孵育该膜。在TBS-T中进行三次洗涤后，将膜与5%非脂肪干牛奶-TBS-T中相应的二次抗体稀释1:5000稀释。使用Amersham ECL Prime R可视化显示各蛋白质eagent（GE医疗保健生命科学公司）。

小鼠和动物实验

C57BL/6和RIP-2^{- / -}从Jackson实验室购买小鼠（7-8周龄），麻醉小鼠接种浓度为1×10的NTHi^7.每只小鼠或生理盐水的CFU作为对照[2]。在接种后6和12小时处死接种小鼠。检查小鼠耳膜是否有中耳炎症迹象。然后对解剖的小鼠中耳进行总RNA提取和组织学分析。所有动物实验均经乔治亚州立大学动物护理和使用委员会批准性。

组织学

如前所述[2]，甲醛固定的石蜡包埋的小鼠中耳组织（4μm），然后用苏木精和eosin（H＆E）染色，以使中耳的炎症反应和病理变化可视化。用光学显微镜系统（Carl Zeiss）记录染色细胞和组织切片的图像。

统计分析

在至少三个独立实验中重复所有实验。数据显示为平均值±SDN决定。采用双尾未配对的学生进行统计分析t-测试;P< 0.05被认为有统计学意义。

结果和讨论

NTHi诱导人体外上皮细胞和小鼠中耳体内RIP-2的表达

RIP-2是一种双特异性激酶，已知可调节炎症信号通路。先前的研究表明RIP-2在各种疾病中的作用是复杂的。例如，RIP-2缺陷小鼠对与多发性硬化模型相关的发展性关节炎和自身免疫介导的头肌无力具有抵抗力[9,19,20]。矛盾的是，NOD2/RIP-2通路的失调与病毒感染期间细胞信号通路的失调有关[9,21]。为了在我们的实验模型中研究RIP-2在NTHi诱导的粘蛋白表达中的作用，我们首先检查了NTHi是否诱导RIP-2体外我们用NTHi处理人类上皮细胞，并通过定量PCR（Q-PCR）分析测定RIP-2 mRNA的表达。NTHi在人类中耳上皮HMEEC-1细胞中诱导RIP-2 mRNA水平的表达（图1A)和人支气管上皮BEAS-2B细胞(图1B)。我们还证实了RIP-2在蛋白水平上的时间依赖性诱导(图1C)。符合体外结果发现，NTHi诱导的RIP-2 mRNA表达也通过q-PCR分析（图1D）在小鼠中耳证实。体外和体内.

图形1.NTHi在人上皮细胞中诱导RIP-2体外在小鼠中耳体内.HMEEC-1(A.）和BEAS-2B（B)用NTHi刺激细胞5h，用Q-PCR分析RIP-2mrna的表达(C)用NTHi刺激细胞不同时间段（1、3、5或7小时），并通过Western blot分析RIP-2蛋白表达。(D)C57BL/6小鼠经鼓室接种NTHi或对照组6h，通过Q-PCR分析RIP-2mRNA表达A-B,D为平均值±SD (n = 3);*P<0.05。

RIP-2对nthi诱导的MUC5AC表达起负调控作用

基于黏液生产过剩是NTHi感染的标志和NTHi显著诱导RIP-2表达的基础上，我们假设RIP-2可能在调节粘蛋白生产[22]中发挥关键作用。为了确定RIP-2在MUC5AC诱导中的作用，我们利用了人类上皮细胞中针对RIP-2的小干扰RNA (siRNA)。我们首先评估RIP-2 knockdown的效率。如图2A所示，RIP-2 siRNA有效地耗尽了RIP-2的表达。接下来，我们评估了siRNA RIP-2对MUC5AC诱导的影响。有趣的是，在HMEEC-1细胞中，siRIP-2显著增强了nthi诱导的MUC5AC上调(图2B)。此外，我们还确定了NTHi是否也会在小鼠中耳炎模型中耳中引起积液。如图2C所示，早在感染后12小时，RIP-2缺陷小鼠与WT对照组小鼠相比，积液增加。总之，我们的数据表明RIP-2是nthi诱导MUC5AC表达的负调控因子。

图形2.RIP-2作为NTHi诱导MUC5AC表达的负调节因子。(A&B酒店用siRNA转染HMEEC-1细胞，用于RIP-2或对照40小时，然后用NTHI刺激5小时，并分析RIP-2（A.)和MUC5AC(B)通过Q-PCR分析mRNA表达(C）来自C57BL / 6或RIP-2的中耳组织部分^{- / -}小鼠经鼓室接种NTHi (1 × 10^7.CFU）或对照组用苏木精和伊红染色，放大x 200，用卡尔蔡司光学显微镜观察。比例尺：20µm。A-B中的数据为平均值±SD（n=3）*P<0.05。

JNK在nthi诱导MUC5AC上调中起正调控作用

MAP激酶JNK已被证明在介导细菌诱导的炎症反应中发挥关键作用[4,23]。因此，我们试图确定JNK在nthi诱导MUC5AC表达中的作用。我们首先证实了JNK被NTHi激活。NTHi在人上皮细胞中以时间依赖性的方式诱导JNK的有效激活(图3A)。接下来，我们评估了JNK特异性抑制剂(SP600125)对nthi诱导的MUC5AC表达的影响。如图3B所示，JNK的抑制抑制了nthi诱导的MUC5AC的表达，从而表明JNK作为nthi诱导的MUC5AC表达的正调节因子的关键作用。JNK在调节细菌诱导的宿主粘膜免疫反应中的作用是高度复杂的，可能根据病原体和宿主基因的不同而有不同的作用。JNK对MUC5AC表达的正调控可能是由于其介导了包括转录因子在内的信号通路的激活，从而导致MUC5AC表达的转录上调。我们之前报道过JNK通过靶向负激活蛋白-1 (AP-1)位点负调控MUC5AC的表达链球菌引起的肺炎感染[4]。因此，JNK可能通过MUC5AC基因的启动子区域中的AP-1位点积极地调节NTHI诱导的MUC5AC表达。需要通过使用Muc5Ac-Luc荧光素酶报告促进剂构建体的AP-1位点突变体来确认这一假设。

图形3.JNK是NTHi诱导MUC5AC表达的正性调节因子。(A.)将HMEEC-1细胞用NTHi处理指定时间段，并使用指定抗体通过Western blot分析分析细胞裂解物(B）用5μMJNK抑制剂（SP600125）预处理HMEEC-1细胞1小时，然后用NTHI刺激5小时，然后通过Q-PCR分析分析MUC5AC mRNA表达。数据in.B均数±标准差（n=3）*P<0.05。

JNK对nthi诱导的RIP-2表达起负调控作用

在证明了JNK在介导NTHi上调粘蛋白MUC5AC中的积极作用后，我们接下来试图探索JNK是否也可以通过抑制RIP-2的表达来介导MUC5AC的上调，RIP-2是NTHi诱导MUC5AC表达的负性调节因子。有趣的是，使用JNK特异性抑制剂抑制JNK可以增强NTHii诱导的RIP-2表达（图4）。这一令人兴奋的结果提供了直接证据，揭示了JNK可能通过上调MUC5AC转录和抑制负性调节因子RIP-2表达来介导NTHi诱导的粘蛋白MUC5AC表达的复杂分子机制（图5）。

图形4.JNK作为NTHI诱导的RIP-2表达的负调节剂。用5μMJNK抑制剂（SP600125）预处理HMEEC-1细胞1小时，然后用NTHI刺激5小时，然后通过Q-PCR分析分析RIP-2 mRNA表达。数据是±SD（n = 3）;*P<0.05。

图形5.图示JNK作为NTHi诱导的粘蛋白MUC5AC表达上调的正调节因子。相反，RIP-2作为MUC5AC诱导的负调节因子。

综上所述，我们的研究为细菌诱导的黏液上调的复杂调控机制带来了新的见解，并可能有助于开发新的治疗策略，以抑制上呼吸道感染性疾病中的黏液过剩。需要进一步研究黏液过度分泌的严格调控的精确分子机制。

确认

这项工作得到了2021年版权法案的支持。所有权利保留人DC005843、DC013833和GM107529（致J.-D.L.）。J.-D.L.是佐治亚州研究联盟在炎症和免疫方面的杰出学者。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

参考文献

1. Koeppen M，McNamee EN，Brodsky KS，Aherne CM，Faigle M等（2013）呼吸机诱导肺损伤期间气道粘蛋白Muc5ac的有害作用。粘膜免疫6：762-775。[交叉参考]
2. Lee Jy，Komatsu K，Lee Bc，Miyata M，O'Neill Bohn A等。（2015）VINPOCETINE抑制肺炎链球菌诱导的粘膜MUC5AC表达的上调通过诱导MKP-1磷酸酶在中耳炎的发病机制中的诱导。免疫学杂志194: 5990-5998. [交叉参考]
3. Lee J，Komatsu K，Lee BC，Lim JH，Jono H等。（2012）磷酸二酯酶4B通过抑制cAMP蛋白激酶A依赖性MKP-1磷酸酶途径介导肺炎链球菌对粘蛋白MUC5AC蛋白的细胞外信号调节激酶依赖性上调。J临床生物化学287: 22799-22811. [交叉参考]
4. Lim JH, Kim HJ, Komatsu K, Ha U, Huang Y, et al.(2009)不同MAPK通路对肺炎链球菌诱导的人MUC5AC粘蛋白表达的差异调控。阿姆J翻译公司1: 300 - 311。［交叉参考]
5. Juneau RA，Pang B，Weimer KE，Armbruster CE，Swows WE（2011）非分型流感嗜血杆菌启动中性粒细胞细胞外陷阱的形成.感染免疫79: 431 - 8。［交叉参考]
6. Hassett DJ，Borchers MT，Panos RJ（2014）慢性阻塞性肺疾病（COPD）：从临床、免疫学和细菌发病机制角度进行评估。微生物学杂志52: 211-226. [交叉参考]
7. vergison a（2008）中耳炎的微生物学：移动目标。疫苗26附录7:G5-10。[交叉参考]
8. Allen EK，Manichaikul A，Sale MM（2014）《中耳炎的遗传因素：不可知发现方法》。Curr过敏性哮喘代表14: 411。［交叉参考]
9. Jun JC，Cominelli F，Abbott DW（2013）炎症性疾病中的RIP2活性和新疗法的意义。白僵菌94: 927 - 932。[交叉参考]
10. Kobayashi K，Inohara N，Hernandez LD，GaláN JE，Núñez G等（2002）RICK/Rip2/CARDIAK介导先天性和适应性免疫系统受体的信号传导。本性416: 194 - 199。[交叉参考]
11. Goh FY，Cook KL，Upton N，Tao L，Lah LC等，（2013）受体相互作用蛋白2基因沉默可减轻过敏性气道炎症。免疫学杂志191: 2691 - 2699。［交叉参考]
12. 安德鲁斯CS，Matsuyama S，Lee Bc，Li JD（2016）通过上调负调节器MyD88短暂的调控抑制Nthi诱导的炎症。科学培训6: 34445.[交叉参考]
13. Andrews CS，Miyata M，Susuki Miyata S，Byung Cheol L，Komatsu K等，（2015）非分型流感嗜血杆菌诱导的MyD88短表达受阳性IKKbeta和CREB途径以及阴性ERK1/2途径的调节。公共科学图书馆一号10:e0144840[交叉参考]
14. Konduru AS，Lee BC，Li JD（2016）姜黄素通过抑制阳性IKKβ途径和上调阴性MKP-1途径抑制NTHi诱导的CXCL5表达。科学培训6：31695。[交叉参考]
15. Konduru AS，Matsuyama S，Lee BC，Komatsu K，Li JD（2017）姜黄素通过上调MAPK磷酸酶MKP-1抑制NTHi诱导的中耳炎MUC5AC粘蛋白过度分泌。Int J Inflam2017: 4525309。[交叉参考]
16. Tasaki Y，Wang YW，Konduru AS，Komatsu K，Matsuyama S，et al.（2016）通过抑制MEK-ERK信号通路，cAMP依赖性蛋白激酶A作为非分型流感嗜血杆菌诱导的GM-CSF表达的负调节因子。int mol med.3: 1 - 5。
17. 小松K，Lee JY，Miyata M，Hyang Lim J，Jono H，等（2013年）抑制PDE4B通过增加氘喹酶CYLD的表达来抑制炎症。NAT CANCE4：1684。[交叉参考]
18. Susuki-Miyata S, Miyata M, Lee BC, Xu H, Kai H, et al. (2015) PKA-Cβ和p65之间的交互作用介导了roflumilast和NTHi对PDE4B的协同诱导。美国科学院学报112:E1800-1809。[交叉参考]
19. Vieira SM、Cunha TM、França RF、Pinto LG、Talbot J等（2012年）联合NOD2/RIPK2信号调节IL-17轴并促进实验性关节炎的发展。免疫学杂志188: 5116-5122.[交叉参考]
20. Shaw PJ，Barr MJ，Lukens JR，McGargill MA，Chi H，et al.（2011）通过中枢神经系统中的RIP2衔接蛋白向树突状细胞浸润的信号传导促进炎症和自身免疫。免疫34: 75-84. [交叉参考]
21. Kim Yg，Park JH，Reimer T，Baker DP，Kawai T，等。（2011）病毒感染增强NOD1 / 2信号传导与二次细菌感染相关的强化致命性。宿主与微生物9: 496-507. [交叉参考]
22. Yang S，Wang B，Humphries F，Jackson R，Healy ME，et al.（2013）Pellino3泛素化RIP2并介导Nod2诱导的结肠炎信号传导和保护作用。纳特免疫14: 927-936.[交叉参考]
23. Wagner EF，Nebreda AR（2009）通过JNK和P38 MAPK途径在癌症发展中的信号集成。Nat Rev癌症9: 537-549.[交叉参考]