摘要
适当的粘膜生成在宿主固有粘膜防御感染中起着关键作用。然而,如果不加控制,过多的黏液可能对宿主有害。因此,必须严格控制粘液的产生。在本研究中,我们研究了RIP-2在调控非分型中的作用流感嗜血杆菌(NTHi)诱导粘蛋白MUC5AC表达上调。我们发现RIP-2是MUC5AC的负调控因子,而MAP激酶JNK是NTHi诱导MUC5AC的正调控因子。我们的研究揭示了RIP-2在上呼吸道疾病中控制粘液生成的新作用,并可能有助于确定新的治疗靶点。
关键字
非分型流感嗜血杆菌,MUC5AC,阴性调节,RIP-2,JNK
介绍
上呼吸道(包括中耳)的粘膜屏障通常有助于捕获和清除传染源,作为宿主的保护机制[1]。粘蛋白是这些区域粘液的主要成分。粘蛋白是由粘膜组织杯状细胞分泌的高分子量糖蛋白家族。已知的粘蛋白有20多种,其中12种存在于呼吸道[2]。粘蛋白5AC(MUC5AC)已知是包括中耳炎(OM)在内的上呼吸道感染期间产生的主要粘蛋白之一。虽然适当的粘液生产对宿主有保护作用,但过量的粘液生产可能有害[1-4]。事实上,厚厚的粘液和中性粒细胞网可为非分型感染者创造一个类似生物膜的环境流感嗜血杆菌(NTHi),OM和慢性阻塞性肺疾病(COPD)的主要细菌病原体之一。粘蛋白MUC5AC的过度产生可导致持续的慢性感染或加重急性组织损伤[1,5]。因此,与炎症一样,必须严格控制粘液的产生。
nthi引起的上呼吸道感染,包括COPD和OM,仍然是全世界的重大健康问题。COPD是美国在美国死亡的第三个主要原因。数字每年都在上涨。哈塞特等等。据报道,2014年受慢性阻塞性肺病影响的美国人每年超过1400万[6]。OM是人类最常见的儿科传染病,每年有2000多万人次就诊,花费超过50亿美元[7,8]OM的特征是由于感染引起的中耳腔粘膜过度增生和炎症。由于在发育过程中咽鼓管的长度缩短,儿童患者对OM病原体高度敏感(7)。.目前,COPD和OM的标准治疗方法是系统使用广谱抗生素,这会导致抗生素耐药性增加。小儿OM患者也经常使用手术干预,通过放置导管帮助中耳腔引流。这种常见的手术干预和nt抗生素的使用需要关注耐药菌株的发展以及与这两种炎症性疾病相关的医疗成本的上升。因此,迫切需要在充分了解这些炎症性疾病的分子发病机制的基础上开发非抗生素治疗策略阿斯。
受体相互作用蛋白-2(RIP-2)在激活和调节中发挥关键作用和调节多种炎症信号级联,包括核因子-κB(NF-κB)和丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)。核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)是胞质受体,其检测细菌肽聚糖和其他炎症刺激[9]。在NOD2检测到病原体相关的分子模式(PAMPS)时,通过卡卡相互作用招募并相互作用RIP-2。RIP-2是点NOD样受体下游的双特异性激酶,其经历自动磷酸化和随后的多化以驱动炎性细胞因子和趋化因子的转录[9]。RIP-2是必要的信令适配器,之前的研究表明,NF-κB活化在其缺席中是次优的[10]。之前的研究还表明,RIP-2作为卵霉蛋白诱导的肺炎的重要衔接子分子。然而,RIP-2在细菌诱导的粘蛋白MUC5Ac表达中的作用,OM和COPD病理学的主要贡献者仍然很大程度上。
在本研究中,我们试图研究RIP-2在nthi诱导的MUC5AC基因表达中的作用。在这里,我们发现NTHi在mRNA和蛋白水平诱导RIP-2表达,RIP-2是MUC5AC表达的负调控因子,而c-Jun n端激酶(JNK)是MUC5AC诱导的正调控因子。因此,我们的研究首次提供了NTHi通过RIP-2信号通路负调控MUC5AC诱导的直接证据,并可能导致抑制MUC5AC过量产生的新治疗策略的开发。
材料和方法
试剂和抗体
SP600125购自Calbiochem。抗β-肌动蛋白(sc-8432)、α-微管蛋白(sc-69969)和总JNK1/2(sc-7345)的抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗磷酸化JNK1/2(#9251)、抗兔HRP连接抗体(#7074)和抗小鼠HRP连接抗体(#7076)的抗体抗RIP-2(ab8428)抗体购自Abcam。
菌株和培养条件
本研究采用NTHi 12临床分离株。NTHi的生长过程如前所述[12-16]。为体外实验中,NTHI重新悬浮在PBS中,并以50分的多种感染(MOI)使用。对于体内实验,Nthi重新悬浮在等渗盐水中,以1×10的浓度使用7.CFU每只鼠标。
细胞培养
细胞培养方案如前所述[2-4,12-17]。以下所述的所有培养基均添加10%体积的FBS(Sigma-Aldrich)和Pen/Strep(100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml链霉素;生命技术)。人中耳上皮HMEEC-1细胞保存在DMEM(Cellgro)中,并添加BEGM单体(Lonza)人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞(ATCC)保存在RPMI 1640培养基(Gibco)中。所有细胞均在37°C的5%CO培养基中培养2..
实时定量RT-PCR分析
如前所述[2-4,12-17]进行总RNA提取和RT-qPCR。使用比较Ct方法测定mRNA的相对数量,并使用人亲环素对其进行标准化体外或小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用于体内作为内生控制。人MUC5AC、小鼠MUC5AC、人亲环素和小鼠GAPDH的引物序列在前面已经描述过[2,18]。RIP-2的引物序列如下:人类RIP-2(正向5'-CAA GCA CGA TAT ATA TAG CTA TGC AG-3'和反向5'-GCA AAG GAT TGG TGA CAT CCT C-3');鼠标RIP-2(正向5'-GGG AAT TTG CAA TGA GCC TG-3'和反向5'-GCA GGA TGC GGA ATC TCA AT-3')。
质粒和转染
RIP-2 siRNA(SR305775)和对照siRNA(SR30004)购自Origene。根据制造商的说明,使用Lipofectamine Rnaimax(Thermo Fisher Scientific)进行所有瞬时转染。对于抑制剂的实验,用或没有化学抑制剂预处理转染的细胞1小时,然后与NTHI温育5小时。
蛋白印迹
Western blot程序之前已经描述过[2-4,12-17]。使用全细胞提取物进行Western blot,在8-10%SDS-PAGE凝胶上分离,并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用含有0.1%吐温20(TBS-T)的Tris缓冲盐水(TBS)溶液封闭膜5%非脂肪干牛奶。然后在5%牛血清白蛋白-TBS-T中1:2000稀释一级抗体的情况下孵育该膜。在TBS-T中进行三次洗涤后,将膜与5%非脂肪干牛奶-TBS-T中相应的二次抗体稀释1:5000稀释。使用Amersham ECL Prime R可视化显示各蛋白质eagent(GE医疗保健生命科学公司)。
小鼠和动物实验
C57BL/6和RIP-2- / -从Jackson实验室购买小鼠(7-8周龄),麻醉小鼠接种浓度为1×10的NTHi7.每只小鼠或生理盐水的CFU作为对照[2]。在接种后6和12小时处死接种小鼠。检查小鼠耳膜是否有中耳炎症迹象。然后对解剖的小鼠中耳进行总RNA提取和组织学分析。所有动物实验均经乔治亚州立大学动物护理和使用委员会批准性。
组织学
如前所述[2],甲醛固定的石蜡包埋的小鼠中耳组织(4μm),然后用苏木精和eosin(H&E)染色,以使中耳的炎症反应和病理变化可视化。用光学显微镜系统(Carl Zeiss)记录染色细胞和组织切片的图像。
统计分析
在至少三个独立实验中重复所有实验。数据显示为平均值±SDN决定。采用双尾未配对的学生进行统计分析t-测试;P< 0.05被认为有统计学意义。
结果和讨论
NTHi诱导人体外上皮细胞和小鼠中耳体内RIP-2的表达
RIP-2是一种双特异性激酶,已知可调节炎症信号通路。先前的研究表明RIP-2在各种疾病中的作用是复杂的。例如,RIP-2缺陷小鼠对与多发性硬化模型相关的发展性关节炎和自身免疫介导的头肌无力具有抵抗力[9,19,20]。矛盾的是,NOD2/RIP-2通路的失调与病毒感染期间细胞信号通路的失调有关[9,21]。为了在我们的实验模型中研究RIP-2在NTHi诱导的粘蛋白表达中的作用,我们首先检查了NTHi是否诱导RIP-2体外我们用NTHi处理人类上皮细胞,并通过定量PCR(Q-PCR)分析测定RIP-2 mRNA的表达。NTHi在人类中耳上皮HMEEC-1细胞中诱导RIP-2 mRNA水平的表达(图1A)和人支气管上皮BEAS-2B细胞(图1B)。我们还证实了RIP-2在蛋白水平上的时间依赖性诱导(图1C)。符合体外结果发现,NTHi诱导的RIP-2 mRNA表达也通过q-PCR分析(图1D)在小鼠中耳证实。体外和体内.
图形1.NTHi在人上皮细胞中诱导RIP-2体外在小鼠中耳体内.HMEEC-1(A.)和BEAS-2B(B)用NTHi刺激细胞5h,用Q-PCR分析RIP-2mrna的表达(C)用NTHi刺激细胞不同时间段(1、3、5或7小时),并通过Western blot分析RIP-2蛋白表达。(D)C57BL/6小鼠经鼓室接种NTHi或对照组6h,通过Q-PCR分析RIP-2mRNA表达A-B,D为平均值±SD (n = 3);*P<0.05。
RIP-2对nthi诱导的MUC5AC表达起负调控作用
基于黏液生产过剩是NTHi感染的标志和NTHi显著诱导RIP-2表达的基础上,我们假设RIP-2可能在调节粘蛋白生产[22]中发挥关键作用。为了确定RIP-2在MUC5AC诱导中的作用,我们利用了人类上皮细胞中针对RIP-2的小干扰RNA (siRNA)。我们首先评估RIP-2 knockdown的效率。如图2A所示,RIP-2 siRNA有效地耗尽了RIP-2的表达。接下来,我们评估了siRNA RIP-2对MUC5AC诱导的影响。有趣的是,在HMEEC-1细胞中,siRIP-2显著增强了nthi诱导的MUC5AC上调(图2B)。此外,我们还确定了NTHi是否也会在小鼠中耳炎模型中耳中引起积液。如图2C所示,早在感染后12小时,RIP-2缺陷小鼠与WT对照组小鼠相比,积液增加。总之,我们的数据表明RIP-2是nthi诱导MUC5AC表达的负调控因子。
图形2.RIP-2作为NTHi诱导MUC5AC表达的负调节因子。(A&B酒店用siRNA转染HMEEC-1细胞,用于RIP-2或对照40小时,然后用NTHI刺激5小时,并分析RIP-2(A.)和MUC5AC(B)通过Q-PCR分析mRNA表达(C)来自C57BL / 6或RIP-2的中耳组织部分- / -小鼠经鼓室接种NTHi (1 × 107.CFU)或对照组用苏木精和伊红染色,放大x 200,用卡尔蔡司光学显微镜观察。比例尺:20µm。A-B中的数据为平均值±SD(n=3)*P<0.05。
JNK在nthi诱导MUC5AC上调中起正调控作用
MAP激酶JNK已被证明在介导细菌诱导的炎症反应中发挥关键作用[4,23]。因此,我们试图确定JNK在nthi诱导MUC5AC表达中的作用。我们首先证实了JNK被NTHi激活。NTHi在人上皮细胞中以时间依赖性的方式诱导JNK的有效激活(图3A)。接下来,我们评估了JNK特异性抑制剂(SP600125)对nthi诱导的MUC5AC表达的影响。如图3B所示,JNK的抑制抑制了nthi诱导的MUC5AC的表达,从而表明JNK作为nthi诱导的MUC5AC表达的正调节因子的关键作用。JNK在调节细菌诱导的宿主粘膜免疫反应中的作用是高度复杂的,可能根据病原体和宿主基因的不同而有不同的作用。JNK对MUC5AC表达的正调控可能是由于其介导了包括转录因子在内的信号通路的激活,从而导致MUC5AC表达的转录上调。我们之前报道过JNK通过靶向负激活蛋白-1 (AP-1)位点负调控MUC5AC的表达链球菌引起的肺炎感染[4]。因此,JNK可能通过MUC5AC基因的启动子区域中的AP-1位点积极地调节NTHI诱导的MUC5AC表达。需要通过使用Muc5Ac-Luc荧光素酶报告促进剂构建体的AP-1位点突变体来确认这一假设。
图形3.JNK是NTHi诱导MUC5AC表达的正性调节因子。(A.)将HMEEC-1细胞用NTHi处理指定时间段,并使用指定抗体通过Western blot分析分析细胞裂解物(B)用5μMJNK抑制剂(SP600125)预处理HMEEC-1细胞1小时,然后用NTHI刺激5小时,然后通过Q-PCR分析分析MUC5AC mRNA表达。数据in.B均数±标准差(n=3)*P<0.05。
JNK对nthi诱导的RIP-2表达起负调控作用
在证明了JNK在介导NTHi上调粘蛋白MUC5AC中的积极作用后,我们接下来试图探索JNK是否也可以通过抑制RIP-2的表达来介导MUC5AC的上调,RIP-2是NTHi诱导MUC5AC表达的负性调节因子。有趣的是,使用JNK特异性抑制剂抑制JNK可以增强NTHii诱导的RIP-2表达(图4)。这一令人兴奋的结果提供了直接证据,揭示了JNK可能通过上调MUC5AC转录和抑制负性调节因子RIP-2表达来介导NTHi诱导的粘蛋白MUC5AC表达的复杂分子机制(图5)。
图形4.JNK作为NTHI诱导的RIP-2表达的负调节剂。用5μMJNK抑制剂(SP600125)预处理HMEEC-1细胞1小时,然后用NTHI刺激5小时,然后通过Q-PCR分析分析RIP-2 mRNA表达。数据是±SD(n = 3);*P<0.05。
图形5.图示JNK作为NTHi诱导的粘蛋白MUC5AC表达上调的正调节因子。相反,RIP-2作为MUC5AC诱导的负调节因子。
综上所述,我们的研究为细菌诱导的黏液上调的复杂调控机制带来了新的见解,并可能有助于开发新的治疗策略,以抑制上呼吸道感染性疾病中的黏液过剩。需要进一步研究黏液过度分泌的严格调控的精确分子机制。
确认
这项工作得到了2021年版权法案的支持。所有权利保留人DC005843、DC013833和GM107529(致J.-D.L.)。J.-D.L.是佐治亚州研究联盟在炎症和免疫方面的杰出学者。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
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